专利名称：玉米耐盐种质的筛选方法
技术领域：
本发明属于农业新品种选育技术领域，具体涉及玉米耐盐自交系的筛选方法。
背景技术：
在我国0.67亿hm2耕地中有10%为盐溃化土壤，土壤盐溃化已成为限制农作物产量进一步提高的重要环境因子之一。玉米(Zea mays)对盐分中度敏感，耐盐性相对较差。因此，深入研究玉米耐盐生理机制，筛选耐盐品种，培育具有一定耐盐能力的玉米，对充分利用盐溃化土地，提高玉米产量具有重要意义。对玉米耐盐种质的筛选已有大量报道，孟义江等对36份玉米杂交种进行了耐盐性筛选，筛选出耐盐性强的品种3份；徐立华等以自交系齐319，鲁原341，Lx9801，8112的幼胚为外植体，通过组培筛选，获得了耐盐突变体，为玉米抗逆育种提供了新的种质资源。盐胁迫对玉米的主要伤害是盐离子在细胞内大量累积，导致离子毒害和离子不平衡。盐胁迫下Na+大量涌入胞内，不仅破坏细胞中已形成的离子平衡状态，而且影响K+和Ca2+的胞内含量和分布。Na+对细胞K+的吸收呈现明显竞争性抑制；同时高浓度Na+可置换质膜和细胞内膜系统所结合的Ca2+，膜系统完整性被破坏，膜透性增大，导致生理生化代谢紊乱。盐胁迫下细胞内离子平衡破坏的一个典型指标就是K+/Na+降低。国内外学者对作物盐胁迫下离子含量的变化进行了大量研究，初步探索出了盐胁迫下作物离子含量的变化规律。王宝山等研究证明，在NaCI胁迫下，随盐浓度和胁迫时间增加，玉米黄化幼苗组织中Na+含量相应增加，根中Na+含量为地上部分的I倍。夏阳等报道，在NaCI胁迫下，玉米Na+含量增高，K+浓度下降，KVNa+随盐浓度升高而降低。目前对玉米耐盐种质的筛选主要有两种途径:一是在盐胁迫处理下，通过测定株高、根长、根数、干物质积累等性状对玉米种质进行耐盐性鉴定和评价；二是在盐胁迫处理后，通过测定玉米种质的叶绿素含量、脯氨酸`含量、丙二醛(MDA)、相对电导率、超氧化物歧化酶(S0D)、过氧化物酶(P0D)、过氧化氢酶(CAT)活性等生理生化指标来确定玉米的耐盐性。利用这些方法虽然能够筛选出耐盐玉米种质，但是会增加筛选工作量，并且测定玉米种质的生理生化指标比较复杂、实验误差较大，要得到准确可靠的耐盐种质需要多次重复实验，因此延长实验时间，降低实验效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种玉米耐盐种质的筛选方法；该方法简便易行，不仅可以减少实验工作量，缩短实验时间，而且能够大大提高耐盐玉米种质筛选的效率和筛选结果的准确性。为了解决上述技术问题，本发明采取如下技术方案:一种耐盐种质筛选方法，包括如下步骤:
1.收集材料:收集3个玉米自交系材料；
2.种子精选与消毒:精选无破损、大小一致的种子，将3个玉米自交系分别用0.5%的次氯酸钠消毒10 min，用蒸馏水冲洗3-5次，用滤纸吸干附着水，得3个自交系玉米消毒种子;
3.盐胁迫下浸种:将3个玉米自交系消毒种子分别浸泡在0mmol/L、60 mmol/L、140mmol/L与220 mmol/L的NaCl溶液中12 h ;得3个玉米自交系盐胁迫种子分别进入步骤4与步骤5 ；0 mmol/L即蒸馏水浸种处理为对照样品；
4.种子萌发:将步骤3所得的3个玉米自交系盐胁迫种子分别置于直径为12cm的培养皿中，双层滤纸作发芽床，每皿30粒；分别加入0 mmol/L、60 mmol/L、140 mmol/L与220mmol/L的NaCl溶液，实验设3次重复；培养皿置于培养箱中25°C暗萌发；萌发期间每天补一次15ml对应浓度的盐溶液，待种子萌发处理4 d后，每个样品留取生长一致的10粒萌动种子进入步骤6.1测定萌动种子的种皮、胚乳、胚的Na+、K+离子含量；
5.幼苗生长:将0 mmol/L、60 mmol /I,、140 mmol/L 与 220 mmol/L 的 NaCl 溶液各100 mL分别与500 g已灭菌的蛭石搅拌均勻，而后分装于15 cmX 13 cm的营养钵中；将步骤3所得的3个玉米自交系盐胁迫种子，分别播在各对应盐浓度的消毒蛭石中，每钵30粒，进行胁迫处理，实验设3次重复；播种后置于植物生长室中培养，生长室的昼夜温度为25±2°C /20±2°C，每天光 照12 h，光照强度为600 u mol/(s.m2)，相对湿度60-80% ;期间，每隔I d补加I次50 ml的去离子水，每3 d补加一次对应浓度的NaCl溶液50 ml，胁迫处理10 d后，待对照样品叶片生长到三叶一心时，每个样品留取生长一致的10株盐胁迫处理幼苗进入步骤6.2测定幼苗根、茎、叶的Na+、K+离子含量；
6.离子含量测定
6.1将步骤4所得的萌动种子用60 mmol/L的NaCl溶液冲洗干净，将种皮、胚、胚乳分离，置105°C烘箱中10 min，然后于80°C下烘48 h，而后用等离子质谱测定Na+、K+离子的含量;
6.2将步骤5所得的盐胁迫处理幼苗用60 mmol/L NaCl溶液冲洗干净，将根、茎、叶分离，置105°C烘箱中10 min，然后于80°C下烘48 h，用等离子质谱测定根、茎、叶中Na+、K+离子的含量；
7.结果分析与筛选耐盐品种:对步骤6.1测得的萌动种子与步骤6.2测得的盐胁迫处理幼苗的每个样品中Na+、K+离子的含量数据，采用EXcel2007软件进行数据处理，所有实验数据统计分析SPSS16.0进行处理，试验结果用平均值土标准偏差(SD)表示，采用Duncan进行差异显著性多重比较，对各处理间的差异显著性进行分析；根据萌动种子与盐胁迫处理幼苗的每个样品中Na+、K+离子的含量和K+/Na+比值的变化筛选耐盐品种。在上述耐盐种质筛选中，步骤4)培养皿和滤纸都要进行高压灭菌后使用。步骤4、步骤5中，为了得到更好的胁迫效果，种子经步骤2消毒后，应立即进入步骤3，在相应浓度的NaCl溶液浸泡12 h。本发明主要通过测定萌动种子的种皮、胚、胚乳以及幼苗根、茎、叶中Na+、K+离子含量和K+/Na+比值的变化来筛选耐盐种质，当处理材料和处理浓度多时，此方法不仅可以减少筛选的工作量，缩短筛选时间，而且能够大大提高了耐盐种质的筛选效率和筛选结果的准确性，为耐盐育种工作奠定了坚实的基础，具有很高的应用价值。
具体实施方式
本发明下述实施例中所用的方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规试剂、器材。实验例，玉米耐盐种质筛选的方法，按以下步骤进行:
1.收集材料:收集了 81162、8723、P138三份玉米种质材料，供实验所用。2.种子消毒:精选无破损、大小一致的种子，用0.5%的次氯酸钠消毒10 min，蒸馏水冲洗3次，用滤纸吸干附着水。3.盐胁迫下浸种:种子消毒后,将种子分别在0 mmol/L,60 mmol/L, 140 mmol/1,220 mmol/L的NaCl溶液中浸泡12 h，蒸馏水浸种处理为对照；。4.种子萌发实验:将步骤3处理后的种子置于直径为12 cm的培养皿中，双层滤纸作发芽床，每皿30粒。分别加入0 mmol/L、60 mmol/L> 140 mmol/L与220 mmol/L的NaCl溶液，实验设3次重复，以蒸馏水为对照。培养皿置于培养箱中25°C暗中萌发。萌发期间每天补加一次15 ml对应浓度的盐溶液，待种子萌发处理4 d后，每个样品留取生长一致的10粒萌动种子测定种皮、胚乳和胚中的Na+、K+离子含量。5.幼苗生长实验:将 0 mmol/L、60 mmol /I,、140 mmol/L 与 220 mmol/L 的 NaCl 溶液各100 mL分别与500 g已灭菌的蛭石搅拌均勻，而后分装于15 cmX 13 cm的营养钵中。3个玉米自交系的种子经步骤3后，分别播在各对应盐浓度的消毒蛭石中，每钵30粒，实验设3次重复。播种后置于植物生长室中培养，生长室的昼夜温度为(25±2)/ (20±2)°C，每天光照12 h，光照强度为600 u mol/(s m2)，相对湿度60%_80%。3个自交系的幼苗生长10 d后，对照叶片生长到三叶一心时，每个样品留取生长一致的10株幼苗测定根、茎、叶中的Na+、K+尚子含量。6.离子含量测定:萌发期胁迫处理4 d后，每个样品留取生长一致的10粒萌动种子用60 mmol/L的NaCl溶·液冲洗干净，将种皮、胚、胚乳分离，用等离子质谱测定Na+、K+离子的含量，实验结果如表I所示。幼苗生长期胁迫处理10 d后，对照幼苗长到三叶一心时，每个样品留取生长一致的10株幼苗用60 mmol/LNaCl溶液冲洗干净，将根、茎、叶分离，置105°C烘箱中10 min，然后于80°C下烘48 h，用等离子质谱测定Na+、K+离子的含量，实验结果如表2所示。第一，萌动种子中Na+、K+含量的变化
如表I所示，3个玉米自交系萌动种子中的Na+含量都随NaCl浓度的增加而增加。与对照相比，60 mmol/L、140 mmol/L,220 mmol/L NaCl处理后，81162萌动种子中Na+含量分别上升 2.82,4.02,6.03 倍；8723 分别上升 1.88,4.91,5.94 倍、P138 分别上升 2.97,6.35、9.34倍。由此可见，萌发期81162和8723的Na+积累速度小于P138，反映81162和8723的拒Na+能力较强，而P138的拒Na+能力较弱，在体内聚集了过多的Na+，从而造成了对种子萌发的影响。随着NaCl浓度的增加，3个自交系萌动种子中K+含量均呈下降趋势。与对照相比，220 mmol/L NaCl处理后，81162萌动种子中的K+含量分别下降34.46%, 8723分别下降36.84%，P138分别下降44.31%。由此可见，萌动种子中K+离子在P138中的降低幅度大于81162和8723。在胚和种皮中，81162和8723中K+的积累量几乎在每个浓度下都大于P138，而在胚乳中没有差异。
权利要求
1.一种耐盐种质筛选方法，其特征在于包括如下步骤: (1)收集材料:收集3个玉米自交系材料； (2)种子精选与消毒:精选无破损、大小一致的种子，将3个玉米自交系分别用0.5%的次氯酸钠消毒10 min，用蒸馏水冲洗3-5次，用滤纸吸干附着水，得3个自交系玉米消毒种子; (3)盐胁迫下浸种:将3个玉米自交系消毒种子分别浸泡在0mmol/L、60 mmol/L> 140mmol/L与220 mmol/L的NaCl溶液中12 h ;得3个玉米自交系盐胁迫种子分别进入步骤4与步骤5 ；0 mmol/L即蒸馏水浸种处理为对照样品； (4)种子萌发:将步骤3所得的3个玉米自交系盐胁迫种子分别置于直径为12cm的培养皿中，双层滤纸作 发芽床，每皿30粒；分别加入0 mmol/L、60 mmol/L、140 mmol/L与220mmol/L的NaCl溶液，实验设3次重复；培养皿置于培养箱中25°C暗萌发；萌发期间每天补一次15ml对 应浓度的盐溶液，待种子萌发处理4 d后，每个样品留取生长一致的10粒萌动种子进入步骤6.1测定萌动种子的种皮、胚乳、胚的Na+、K+离子含量； (5)幼苗生长:将0 mmol/L、60 mmol /I,、140 mmol/L 与 220 mmol/L 的 NaCl 溶液各`100 mL分别与500 g已灭菌的蛭石搅拌均勻，而后分装于15 cmX 13 cm的营养钵中；将步骤3所得的3个玉米自 交系盐胁迫种子，分别播在各对应盐浓度的消毒蛭石中，每钵30粒，进行胁迫处理，实验设3次重复；播种后置于植物生长室中培养，生长室的昼夜温度为`25±2°C/20±2°C，每天光照12 h，光照强度为600 umol/(s.m2)，相对湿度60-80% ;期间，每隔I d补加I次50 ml的去离子水，每3 d补加一次对应浓度的NaCl溶液50 ml，胁迫处理10 d后，待对照样品叶片生长到三叶一心时，每个样品留取生长一致的10株盐胁迫处理幼苗进入步骤6.2测定幼苗根、茎、叶的Na+、K+离子含量； (6)离子含量测定 `6.1将步骤4所得的萌动种子用60 mmol/L的NaCl溶液冲洗干净，将种皮、胚、胚乳分离，置105°C烘箱中10 min，然后于80°C下烘48 h，而后用等离子质谱测定Na+、K+离子的含量; `6.2将步骤5所得的盐胁迫处理幼苗用60 mmol/L NaCl溶液冲洗干净，将根、茎、叶分离，置105°C烘箱中10 min，然后于80°C下烘48 h，用等离子质谱测定根、茎、叶中Na+、K+离子的含量； (7)结果分析与筛选耐盐品种:对步骤6.1测得的萌动种子与步骤6.2测得的盐胁迫处理幼苗的每个样品中Na+、K+离子的含量数据，采用EXcel2007软件进行数据处理，所有实验数据统计分析SPSS16.0进行处理，试验结果用平均值土标准偏差(SD)表示，采用Duncan进行差异显著性多重比较，对各处理间的差异显著性进行分析；根据萌动种子与盐胁迫处理幼苗的每个样品中Na+、K+离子的含量和K+/Na+比值的变化筛选耐盐品种。
全文摘要
玉米耐盐种质的筛选方法，步骤是将种子消毒后在不同浓度盐溶液中浸泡12h，进行萌发和幼苗生长实验。在萌发期的胁迫实验中，每天补一次15ml对应浓度的盐溶液，待种子萌发处理4d后，每个样品留取生长一致的萌动种子，测定Na+、K+离子的含量。在幼苗生长实验中，直接将经过消毒和浸泡过的玉米种子播在含有0mmol/L、60mmol/L、140mmol/L与220mmol/L的NaC1溶液的消毒蛭石中，置于温室中进行胁迫处理，对照幼苗长到三叶一心时，测定Na+、K+离子的含量。本发明通过萌发期和幼苗生长期不同玉米自交系各个部位的Na+、K+离子含量和K+/Na+比值的变化筛选耐盐种质，能有效减少筛选工作量，缩短筛选时间，提高筛选效率和结果的准确性。
文档编号A01C1/04GK103238396SQ20131020321
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月28日 优先权日2013年5月28日
发明者彭云玲, 赵小强, 闫慧萍 申请人:甘肃农业大学