秸秆降解生防链霉菌及其应用的制作方法
【专利摘要】一种土壤修复【技术领域】的秸秆降解生防链霉菌及其应用，包括：菌种保藏和菌种活化，其中：菌种保藏采用-20℃低温冷冻保藏法，是微生物孢子处于较低的温度下，以降低其代谢速度从而达到保藏菌种的目的；菌种活化将冷冻保藏状态的菌种接种到YEME液体培养基中，待菌种逐渐适应培养环境进行繁殖，以获得数量足够、活力旺盛的培养物。另外，本发明涉及将链霉菌JSD-1用于生物防治。本发明利用已知的JSD-1菌株所未公开的硝态氮降解转化能力、以及对高温(如70℃)和高浓度硝酸盐(3%)有很强的耐受性，对植物病原(如番茄灰霉病和水稻恶苗病)微生物具有很好的抑制作用等特性，实现秸秆中的“难利用的碳”与设施次生盐渍化土壤中“过量的氮”的原位降解，并在高温堆肥外接菌剂和生物肥料的研制上有很好的应用潜力。
【专利说明】秸秆降解生防链霉菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种土壤修复【技术领域】的方法，具体是一株具有高效硝态氮转化能力的秸杆降解生防链霉菌及其应用。
【背景技术】
[0002]设施栽培农业中，由于温室、大棚等栽培条件下特殊的水分运输方式，人为切断外界自然降雨对土壤的淋洗，且温度、湿度、通气状况和水肥管理等均与露地栽培有较大差另IJ，加之设施栽培长期处于高集约化、高复种指数、高肥料施用量的生产状态下，大量未被植物吸收的盐分离子便会在土壤沉积下来。
[0003]土壤盐分积累过多会造成作物根际土壤溶液渗透势下降，导致蔬菜生长矮小，发育迟缓，严重时枯萎死亡；根毛生长分化能力差，营养不良，植株抗病能力下降，引起其他生理病害，造成作物产量降低品质下降。当土壤盐分含量达到lg/kg，植物正常生长就会受到影响；达到2-5g/kg时，根系吸水困难，植物生长收到严重阻碍；当土壤含盐量超过10g/kg时，作物会出现明显的生理性干旱和生长不良反应，甚至导致植物死亡。设施栽培次生盐溃化土壤含盐量一般在2.0g/kg以上，严重的可达5.0g/kgo此外，过量的化肥通过农田地表径流和农田渗漏不仅造成肥料浪费而且导致农业面源污染。
[0004]研究表明，设施次生盐溃化土壤的离子组成，阳离子以Ca2+为主，其含量约占阳离子总量的60%以上，Mg2+含量在15%-20%之间；阴离子则以NO3 —和S042—为主，N03—含量约占阴离子总量的56%-76%。土壤中过量的N03—如被植物吸收最终会在人体内富集，经还原生成的NO2—对人体具有毒害作用。
[0005]于此同时，全国各地区每年都会收获大量农作物秸杆，秸杆主要组分是纤维素、半纤维素、果胶以及木质素等高分子聚合物，性质稳定、难降解。如利用不当，不仅造成环境污染而且还浪费资源，因此秸杆是自然界中最丰富同时也是最难以利用的碳库；同时，硝酸盐的积累是导致设施土壤次生盐溃化`的主要原因，过量的硝态氮不仅会直接影响作物生长，而且当硝态氮超出土壤微生物和植物的生长需求，便变向导致了土壤“碳贫瘠”。于是如何同时实现秸杆中的“难利用的碳”与设施次生盐溃化土壤中“过量的氮”的原位降解，即既快速降解作物秸杆，将秸杆中难利用的碳转化为土壤中易利用的碳如有机质，又可以降低设施次生盐溃化土壤中硝态氮的水平，这具有重大的意义。由于环境中的微生物具有增殖速度快、功能丰富多样、适应性强等特点，筛选一株同时具有秸杆分解能力和硝酸盐降解能力的菌株便成为工作的重中之重。
【发明内容】
[0006]本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种秸杆降解生防链霉菌及其应用，利用已知的JSD-1菌株所未公开的硝态氮降解转化能力、以及对高温(如70°C )和高浓度硝酸盐(3%)有很强的耐受性，对植物病原(如番茄灰霉病和水稻恶苗病)微生物具有很好的抑制作用等特性，实现秸杆中的“难利用的碳”与设施次生盐溃化土壤中“过量的氮”的原位降解，并在高温堆肥外接菌剂和生物肥料的研制上有很好的应用潜力。
[0007]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0008]本发明涉及一种基于秸杆降解生防链霉菌JSD-1的量产方法，包括:菌种保藏和菌种活化，其中:
[0009]菌种保藏:采用_20°C低温冷冻保藏法，是微生物孢子处于较低的温度下，以降低其代谢速度从而达到保藏菌种的目的。
[0010]菌种活化:将冷冻保藏状态的菌种接种到YEME液体培养基中,待菌种逐渐适应培养环境进行繁殖，以获得数量足够、活力旺盛的培养物。
[0011]所述的JSD-1为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens),保藏编号为CGMCCN0.5706。现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学微生物研究所；保存日期为2012年I月9日，保藏编号为CGMCC N0.5706 ;分类种名为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)。
[0012]所述的YEME液体培养基每升中的组分及含量为=Oxoid酵母提取物3g/L、Oxoid蛋白胨5g/L、麦芽提取物3g/L、葡萄糖10g/L、蔗糖340g/L、2mL2.5M的MgCl2溶液，余量为超纯水。
[0013]所述的YEME液体培养基优选经过高压灭菌；
[0014]所述的高压灭菌进一步优选为8磅灭菌，温度为113_114°C，灭菌时间为15min。
[0015]所述的秸杆降解生防链霉菌JSD-1的降解通过以下方式进行测试:将链霉菌的孢子悬浮液接入到不同浓度梯度的以NO3 —为唯一氮源无机盐发酵液中，在30°C、150rpm环境下培养5d，每24h取样，稀释后利用AA3流动注射仪测定发酵液中剩余硝态氮的含量。
[0016]所述的不同浓度梯度是指lg/L、5g/L和10g/L。
[0017]本发明涉及一种秸杆降解生防链霉菌JSD-1的应用方法，将链霉菌JSD-1用于生物防治。
[0018]所述的生物是指:植物病原菌,进一步优选为水稻恶苗病和番茄灰霉病。
技术效果
[0019]与现有技术相比，本发明优点包括:
[0020]1、本发明的灰略红链霉菌不仅有很强的秸杆降解能力，还可以环境中的NO3 —为氮源，快速繁殖生长进而降低环境中NO3-的含量；该菌5d内对发酵液[KN03(lg/L)]中硝态氮降解转化率达99%以上。该菌适用于利用农业废弃物秸杆对设施次生盐溃化土壤进行原位修复和改良，实现降解硝酸盐的同时增加土壤有机质含量；
[0021]2、本发明的灰略红链霉菌还对高温(如70°C )和高浓度(30g/L)硝酸盐(如KNO3)环境有很强的耐受性，对植物病原(如番茄灰霉病和水稻恶苗病)微生物的生长具有很好的抑制作用。因此，该菌还在高温堆肥外接菌剂和生物肥料的研制上有很好的应用潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为本发明链霉 菌JSD-1对发酵液(KN03=lg/L)硝态氮降解图；
[0023]图2为本发明链霉菌JSD-1对发酵液(KN03=5g/L)硝态氮降解图；
[0024]图3为本发明链霉菌JSD-1对发酵液(KN03=10g/L)硝态氮降解图；
[0025]图4为本发明链霉菌JSD-1耐高浓度KN03(30g/L)示意图；[0026]图5为本发明链霉菌JSD-1耐高温(70°C )示意图；
[0027]图6为本发明链霉菌JSD-1拮抗番茄灰霉病示意图；
[0028]图7为本发明链霉菌JSD-1拮抗水稻恶苗病示意图。
【具体实施方式】
[0029]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
[0030]链霉菌JSD-1孢子悬浮液的制备
[0031]取在高氏I号固体培养基生长3d的链霉菌斜面，加入9mL无菌水。用无菌环将孢子轻轻刮下来，使孢子呈悬浮状态。将粗制的孢子悬浮液倒入50mL离心管中，并在振荡器上尽可能地震荡Imin左右。用装有脱脂棉的试管过滤悬液，并将绿叶倒入离心管中，3000rpm离心5min使孢子沉淀,倒出适量的上清液使混合后孢子悬浮液的浓度为2X109cfu/mL.
[0032]所述的高氏I号培养基组分为:可溶性淀粉20.0g、KNO3L 0g、K2HPO40.5g、MgSO4.7Η200.5g、NaCl0.5g、FeSO4.7Η200.01g、超纯水 1L,调节 pH 至 7.2-7.4。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入一定量的热水中，在火上加热，边搅拌边依次溶化其他成分，待溶化后，补足水分到1000ml，调pH为7.2，121°C灭菌20min。
实施例2
[0033]链霉菌JSD-1对发酵液(KN03=lg/L)中硝态氮降解测试
[0034]取0.5mL链霉菌孢子悬浮液接入50mL KNO3浓度为lg/L的发酵液中，以模拟轻度设施次生盐溃化土壤中盐分浓度(含量≥lg/L)环境。30°C、150rpm培养5d,每24h取样并稀释30倍后用AA3流动注射仪测定发酵液中硝态氮的含量。测定的发酵液中硝态氮的含量如图1所示，发酵液第Id硝态氮浓度迅速下降；到第3天时，发酵液中硝态氮含量已经下降到14.3mg/L，相对于初始浓度已将降低近90%;当到第4d，发酵液中硝态氮的含量下降到很低的水平，含量约为3.5mg/L ;到第5天，发酵液中已经几乎检测不出硝态氮。在KNO3含量为lg/L的发酵液中，链霉菌5d内对硝态氮的降解率可达99%以上，效果十分显著。
[0035]所述的以KNO3 (lg/L)为唯一氮源的发酵液组分为:葡萄糖20g、KNO3L 0g、KCll.0g、MgS04.7Η200.5g、CaCl20.0Olg^FeSO4.7Η200.01g^KH2PO40.5g、超纯水 lL、pH7.0。
实施例3
[0036]链霉菌JSD-1对发酵液(KN03=5g/L)中硝态氮降解测试
[0037]取0.5mL链霉菌孢子悬浮液接入50mL KNO3浓度为5g/L的发酵液中，以模拟中度设施次生盐溃化土壤中盐分浓度(含量≥5g/L)环境。30°C、150rpm培养5d,每24h取样并稀释200倍后用AA3流动注射仪测定发酵液中硝态氮的含量。测定的发酵液中硝态氮的含量如图2所示，发酵液第Id硝态氮浓度便开始下降，并无明显的适应环境过程；整个5天的发酵时间内，硝态氮降解速率相对稳定。在KNO3含量为5g/L的发酵液中，链霉菌5d内对硝态氮的降解率为49.7%，效果显著。
[0038]所述的以KNO3 (5g/L)为唯一氮源的发酵液组分为:葡萄糖20g、KN035.0g、KCll.0g、MgS04.7Η200.5g、CaCl20.0Olg^FeSO4.7Η200.01g^KH2PO40.5g、超纯水 lL、pH7.0。
实施例4
[0039]链霉菌JSD-1对发酵液(KN03=10g/L)中硝态氮降解测试
[0040]取0.5mL链霉菌孢子悬浮液接入50mL KNO3浓度为10g/L的无机盐液体培养基中，模拟重度设施次生盐溃化土壤中盐分浓度(含量> 10g/L)环境。30°C、150rpm培养5d，每24h取样并稀释300倍后用AA3流动注射仪测定发酵液中硝态氮的含量。测定的发酵液中硝态氮的含量如图3所示，发酵液第Id硝态氮浓度便开始下降；整个5天的发酵时间内，硝态氮降解速率相对稳定，其中第5天硝态氮降解速率相对较快。在KNO3含量为10g/L的发酵液中，链霉菌5d内对硝态氮的降解率为30.1%。
[0041]所述的以KN03(10g/L)为唯一氮源的发酵液组分为:葡萄糖20g、KNO3I0.0g、KCll.0g、MgS04.7Η200.5g、CaCl20.0Olg^FeSO4.7Η200.01g^KH2PO40.5g、超纯水 lL、pH7.0。
实施例5
[0042]链霉菌JSD-1对高浓度KNO3 (30g/L)耐受能力测试
[0043]将链霉菌在30g/L以KNO3为唯一氮源无机盐固体培养基和高氏I号固体培养基上划线后，置于32°C的恒温恒湿培养箱培养，4d后观测菌在平板上的生长状况。与高氏I号上菌体生长状况相比，4d后在高浓度 的KNO3无机盐固体培养基上形成了浓密的菌落，菌体生长良好，未观测到高浓度KNO3对菌体生长有抑制(如图4)。
[0044]无机盐培养基的组分为:葡萄糖20g、ΚΝ0330.0g、KCll.0g、MgSO4.7Η200.5g、CaCl20.0Olg^FeSO4.7Η200.01g、KH2PO40.5g、琼脂 20.0g，超纯水 1L, ρΗ7.0。
实施例6
[0045]链霉菌JSD-1对高温(70°C )耐受能力测试
[0046]将链霉菌在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)固体平板上进行划线后，置于70°C培养箱中放置3d后取出，再将平板置于30°C恒温培养箱中，4d后观察平板菌落生长状况。如图5所示，菌体在70°C环境下无法正常生长，平板上为未出现菌落；将高温处理的平板置于30°C培养4d后，平板形成浓密的菌落。表明高温(如70°C)处理并未将链霉菌孢子杀死，当恢复合适外界温度(如30°C )，孢子仍然可以迅速萌发并繁殖。
[0047]秸杆废弃物的高温堆肥一般会经过一个高温过程(一般为65°C -70°C，持续2-3d)，以此推论，链霉菌孢子的耐热性可以确保该菌在经历高温堆肥发酵后仍然存活。该菌可用于制备高温堆肥发酵外接菌剂。
[0048]所述的CMC-Na 固体培养基组分为:CMC_Nal0.0g、(NH4) 2S042.0g、NaCl1.0g、KCll.0g、KH2PO40.5g、MgSO4.7H200.5g、FeSO4.7H200.01g、CaCl20.001g、琼脂 20.0g，超纯水 1L，pH7.0。
实施例7
[0049]链霉菌JSD-1生物防治上的应用
[0050]将链霉菌孢子悬浮液浓密涂布于高氏I号固体培养基上，第4天待平板长满菌落时，用无菌打孔器取下菌饼；PDA平板中心接种植物病原菌一水稻恶苗病和番茄灰霉病，周边3cm处等间距放置3块链霉菌菌饼。30°C培养4d，观察菌落之间有无抑菌带、抑菌带的宽度以及拮抗方向等。结果如图6和图7所示，本实施例的灰略红链霉菌对植物病害中番茄灰霉病和水稻恶苗病的病原微生物具有较强的拮抗作用。该菌可以用于研制具有生防能力的生物菌肥。`
【权利要求】
1.一种基于秸杆降解生防链霉菌JSD-1的量产方法，其特征在于，包括:菌种保藏和菌种活化，其中: 菌种保藏:采用_20°C低温冷冻保藏法，是微生物孢子处于较低的温度下，以降低其代谢速度从而达到保藏菌种的目的； 菌种活化:将冷冻保藏状态的菌种接种到YEME液体培养基中,待菌种逐渐适应培养环境进行繁殖，以获得数量足够、活力旺盛的培养物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的JSD-1为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens),保藏编号为 CGMCC N0.5706。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的YEME液体培养基每升中的组分及含量为=Oxoid酵母提取物3g/L、Oxoid蛋白胨5g/L、麦芽提取物3g/L、葡萄糖10g/L、蔗糖340g/L、2mL2.5M的MgCl2溶液，余量为超纯水。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的YEME液体培养基经过高压灭菌。
5.根据上述任一权利要求所述的方法，其特征是，所述的降解通过以下方式进行测试:将链霉菌的孢子悬浮液接入到不同浓度梯度的以NO3-为唯一氮源无机盐发酵液中，在300C、150rpm环境下培养5d，每24h取样，稀释后利用AA3流动注射仪测定发酵液中剩余硝态氮的含量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是，所述的不同浓度梯度是指lg/L、5g/L和10g/L。
7.—种秸杆降解生防链霉 菌JSD-1的应用方法，其特征在于，将链霉菌JSD-1用于生物防治。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是，所述的生物是指:植物病原菌。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征是，所述的生物是指:水稻恶苗病和番茄灰霉病。
【文档编号】A01N63/00GK103555623SQ201310512364
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月25日 优先权日:2013年10月25日
【发明者】周培, 冯海玮, 支月娥, 罗艳青, 毛亮, 孙玉静, 唐冬, 卫星, 时唯伟 申请人:上海交通大学