专利名称：一种用于降解秸秆的菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于降解秸秆的菌剂。
背景技术：
农作物秸秆是一种潜在的非竞争资源，具有数量大、分布广和种类多等特点。
据报道，我国各类农作物秸秆年总产量达7亿吨以上，其中稻草2.3亿吨，玉米秸 秆2.2亿吨，豆类和秋杂粮秸秆10亿吨，花生、薯类藤蔓和甜菜叶等1.0亿吨， 占世界总秸秆量的30%左右。但是，这些秸秆资源却长期没有得到合理的开发，传 统上，秸秆被作为农户生产燃料或用于牲畜的粗饲料，少量用于造纸。近年来，由 于农户生活燃料锐减，秸秆直接还田或腐熟还田量少，而田间直接焚烧量大，全国 每年约有2/3的秸秆被直接焚烧。所有的秸秆中经过技术处理后利用的仅占2. 6%。
秸秆中碳占绝大部分，其次为钾、硅、钙、镁、硫、磷，焚烧后的产物主要有 C02、 C0、 S02、 N02和N20，这些有害气体进入大气后造成了严重的环境污染。如果将 这些秸秆堆腐后还田，将成为丰富的有机肥培肥土壤，改善土壤性状。
自然状态下，纤维素降解主要通过三种方式
1)物理方式，包括粉碎、蒸煮、热喷等；2)化学方式，包括酸性水解、碱性 水解、氨化和氧化降解；3)微生物降解。物理或化学方法处理秸秆，只能略为提 高半纤维素的消化率，对纤维素和木质素的作用不大，未能提高秸秆的营养价值和 消化率。化学方法能破坏木质素与多糖之间的酯键结合，使纤维素、半纤维素与木 质素分离，将不溶的木质素变成较易溶解的羟基木质素，使秸秆结构变得疏松，结 晶纤维素变成无定型纤维素，进而使得秸秆易于分解。但化学方法的缺点在于纤 维素含量太高，蛋白质含量低(5%-10%左右)；矿物质含量不平衡，缺乏维生素A、 维生素D和维生素E等；能量值低等(钱辉跃，2004;杨连玉，2001)。微生物 对纤维素的降解是通过分泌到胞外的游离纤维素酶，以水解酶机制和氧化酶机制降 解纤维素(张颖，2005)。利用微生物可将纤维素最终分解成为二氧化碳和水，而 通过微生物自身的生长又可产生大量的菌体蛋白，因此运用微生物法处理秸秆，可 以大幅度提高其营养价值，与物理化学方法相比，具有许多无可比拟的优点。
上世纪70年代报道了利用混合菌株发酵可以提高纤维素酶的产率和活性。在我国，利用混合菌株发酵提高纤维素酶的产率和活性也引起研究者的广泛关注。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于降解秸秆的菌剂。
本发明所提供的用于降解秸秆的菌剂，它的活性成份包括绿色木霉 (7]rz'c力oofer历a n'riofe)、黄绿木霄(7>_/c/ oofen a awrec^irj'afe)禾口词料类芽抱 杆菌(尸3e"i力aci22〃51 / aZw2i)。
本发明所提供的用于降解秸秆的菌剂的活性成份也可仅有由所述的绿色木霉 (7r/c/ 。<yei7Z7<3 wWfife)、黄绿木霉(7Wc力。ofer鹏awre。ririofe)禾口饲料类芽孢 杆菌(尸ae/2j'/ 3cj J〃51 / s/wJ力组成。
其中，所述菌齐仲，绿色木霉(Wc力oofer鹏k/"Ve)、黄绿木霉(Wc/ oofer鹏 朋reow'nVe)和饲料类芽孢杆菌(尸ae/w'/^cW7iAs ; 3Zw2j')的集落形成单位数目比 为(0.8—1.2) : (0.8—1.2) : (0.8—1.2)。
所述绿色木霉(Wc力ocfer鹏w'riofe)具体可为绿色木霉(7Wc力。ofer鹏w'"Ve) ACCC 30166，所述黄绿木霉(7Wc力ookr鹏awreow'n'fife)具体可为黄绿木霉
(WcvWe，ACCC 32248，所述饲料类芽孢杆菌(尸s冊.力aci流？ pa力"h')具体可为饲料类芽孢杆菌(尸aew7^ciWiAs ACCC 10273。
所述降解秸秆的菌剂中，所述绿色木霉(7^'c力oofer历a w'^We) ACCC 30166、 所述黄绿木霉(yyi'c力oofer/^朋reow'riWe) ACCC 32248和所述饲料类芽孢杆菌 (尸ae/^7^ciW^ paZw7力ACCC 10273可分别独立包装，也可混合在一起。
本发明的用于降解秸秆的菌剂可为液体制剂，也可为固体制剂。在液体制剂中 加入吸附剂即可获得固体制剂，如加入轻质碳酸钙或草炭等。
本发明的用于降解秸秆的菌剂能快速腐熟玉米、小麦、水稻等农作物秸秆制备 有机肥料，比正常堆腐发酵时间至少提前15天。使用制备的有机肥料的土壤中碱 解氮、速效磷、钾和有机质含量、土壤脲酶活性和纤维素酶活均比直接使用秸秆和 未使用肥料的土壤高，本发明制备的有机肥料用作基肥，可显著改善蔬菜的品质， 施用这种有机肥料的油菜和白菜，其叶绿素含量可维持在较高水平，与直接施用秸 秆的油菜和白菜相比，生长中期油菜和白菜叶绿素含量分别提高25. 99%和10. 98%; 同时可促进油菜和白菜对氮、磷、钾的吸收利用，与直接施用秸秆的油菜和白菜相 比，油菜和白菜产量分别提高22.97%和2.80%;并且，油菜还原糖与Vc含量分另ij 提高21. 8%和6. 89%;白菜还原糖与Vc含量分别提高9%和23. 53%。
具体实施例方式
如下实施例所用菌种来自于中国农业科学院农业资源与农业区划研究所中国
农业微生物菌种保藏管理中心(简称ACCC，地址北京市海淀区中关村南大街12 号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)。 实施例1、用于降解秸秆的菌剂的制备
用于降解秸秆的菌剂由试剂A、试剂B和试剂H组成，试剂A、试剂B和试剂H 独立包装。试剂A、试剂B和试剂H按照如下方法制备
菌株发酵培养基玉米面0. 5 g/L、玉米秸秆粉15 g/L、麸皮0. 25 g/L、豆饼 粉0.25 g/L、 4 ml/100ml Vogel， s母液，pH值8. 5。
绿色木霉(7^'c力oofer/^ w'nVe) ACCC 30166，在菌株发酵培养基中28°C ， 200r/min摇床振荡培养3d，收集所有的发酵液作为试剂A。
黄绿木霉(ri^c力oofenmg awreow'nVe) ACCC 32248，在菌株发酵培养基中28 °C， 200r/min摇床振荡培养3d，收集所有的发酵液作为试剂B。
饲料类芽孢杆菌(Bacillus paenibacillus pabuli) ACCC 10273在菌株发酵培 养基中28'C， 200r/min摇床振荡培养3d，收集所有的发酵液作为试剂H。
试剂A中绿色木霉(7^'c力oofery^ WnVe) ACCC 30166，试剂B中黄绿木霉 (7Wc力oafenra朋reow'nVe) ACCC 32248，和试剂H中饲料类芽孢杆菌 (尸ae/ ^3w7^s 的集落形成单位数目比为1: 1: 1 。
2)用于降解秸秆的菌剂中的纤维素酶活、滤纸酶活和0-葡萄糖苷酶活
测定用于降解秸秆的菌剂中纤维素酶活、滤纸酶活和e-葡萄糖苷酶活。
DNS还原糖法测定纤维素酶活方法如下首先采用3， 5-二硝基水杨酸(DNS)， 550nm处测定吸光度，以无水葡萄糖梯度溶液绘制标准曲线；(用CMC酶活力 (CMCase activity)代表内切酶活，取1. 5mL 0. 05mol/L醋酸钠的醋酸溶液配制的 1. 0%羧甲基纤维素钠溶液,加入0. 5mL适当稀释降用于解秸秆的菌剂，5(TC反应30 min后加入3mL DNS试剂，沸水浴5min，冷却后加水稀释到25mL，在550nm测还原 糖。
滤纸酶活(filter paper activity, FPA)的测定方法如下取1. 5raL 0. 05mol,/ L醋酸钠的醋酸溶液加入1. 5mL适当稀释的用于降解秸秆的菌剂和1条Whatman No. 1滤纸条(约50mg， lcmX6cra) ， 50。C保温60min后加入3mL DNS试剂，沸水浴 5min，冷却后加水稀释至25raL，在550nm测还原糖。
50 -葡萄糖苷酶活力的测定方法如下取1. 5mL 0. 05 mol/L醋酸钠的醋酸溶液 配制的1. 0%水杨苷溶液加入0. 5 mL适当稀释的用于降解秸秆的菌剂，5(TC反应30 min后加入3mLDNS试剂，沸水浴5min，冷却后加水稀释到25mL，在550nm测还原 糖，然后根据绘制的标准曲线计算酶活数值。
测定结果表明，用于降解秸秆的菌剂的CMC酶活(CMCA)达3813.06U/mL，滤纸 酶活(FPA)达2107. 57 U/mL， P -葡萄糖苷酶达3227. 17U/mL。
上述实验结果说明三菌株间不仅存在FPA酶和0 -葡萄糖苷酶的优势互补，而 且降低了整体的纤维素酶类对营养物质的依赖性和代谢产物抑制的敏感性，使酶活 力在较长时间内维持高水平。
实施例2、用于降解秸秆的菌剂的制备
用于降解秸秆的菌剂由试剂A、试剂B和试剂H组成，试剂A、试剂B和试剂H
混合均匀制成用于降解秸秆的菌剂。
试剂A、试剂B和试剂H按照如下方法制备
菌株发酵培养基玉米面0.5g/L、玉米秸秆粉15g/L、麸皮0.25g/L、豆饼粉 0. 25g/L、 4 ml/100ml Vogel， s母液，pH值8. 5。
绿色木霉(rric力oofer/z/s w'ride) ACCC 30166在菌株发酵培养基中28°C ， 200r/min摇床振荡培养3d，收集所有的发酵液作为试剂A。
黄绿木霉(7Wc力oofer鹏朋reow'nVe) ACCC 32248在菌株发酵培养基中28°C ， 200r/min摇床振荡培养3d，收集所有的发酵液作为试剂B。
饲料类芽孢杆菌广尸aew7^cj7^/s pa/w7i) ACCC 10273在菌株发酵培养基中28 °C， 200r/min摇床振荡培养4d，收集所有的发酵液作为试剂H。
试剂A、试剂B和试剂H混合均匀后制得的用于降解秸秆的菌剂中绿色木霉 (Zric力oaferffla pa>i(ye) ACCC 30166、黄纟录木霄(7]ric力ooferffls si/reoi/i/v-c/e) ACCC 32248和饲料类芽孢杆菌(尸a朋Wsc^L ^ paZwh') ACCC 10273的集落形成单位数 目比为0.8: 0.8: 1.2。
实施例3、用于降解秸秆的菌剂
用于降解秸秆的菌剂由试剂A、试剂B和试剂H组成，试剂A、试剂B和试剂H 分别独立包装。试剂A、试剂B和试剂H按照如下方法制备
菌株发酵培养基玉米面0.5g/L、玉米秸秆粉15g/L、麸皮0.25g/L、豆饼 粉0.25 g/L、 4 ml/100ml Vogel， s母液，pH值8. 5。绿色木霉(7>ic/ o￡/eryz7a w'nVe) ACCC 30166在菌株发酵培养基中28°C ， 200r/min摇床振荡培养5d，收集所有的发酵液作为试剂A。
黄绿木霉(7Wc力oofe/mg awreow>We) ACCC 32248在菌株发酵培养基中28°C ， 200r/min摇床振荡培养5d，收集所有的发酵液作为试剂B。
饲料类芽孢杆菌(尸ae/^'力aciWws patoh') ACCC 10273在菌株发酵培养基中28 °C， 200r/min摇床振荡培养3d，收集所有的发酵液作为试剂H。
试剂A、试剂B和试剂H混合均匀后制得的用于降解秸秆的菌剂中绿色木霉 (7Wc力ofifer鹏w>_zVe) ACCC 30166、黄绿木霉(7Wc力0(^ara a soreow.nVe) ACCC 32248和饲料类芽孢杆菌(尸se/n'力sci"〃s pa力w7力ACCC 10273的集落形成单位数 目比1.2: 1,2: 0,8。
实施例4、实施例1和实施例3的用于降解秸秆的菌剂降解秸秆制备秸秆有机
肥料
1) 制备秸秆有机肥料
将玉米秸秆用粉粹机粉粹，获得的秸秆片段小于1.0cm，作为处理物。向处理 物中按照15kg尿素/吨秸秆的比例加入尿素，按照1 X 1()Scfu黄绿木霉(7^'c力o^/7Z7a 3weow>We) ACCC 32248孢子/kg秸秆接入实施例1的试剂B;然后按照1 X 105cfu 饲料类芽孢杆菌(/^e/7"sw77^ pa力W力ACCC 10273孢子/kg秸秆接入实施例1的 试剂H发酵1. 5天；最后，按照1X 105cfu绿色木霉(7^'c力ooferazs Ki'ric/e)ACCC 30166 孢子/kg秸秆接入实施例1的试剂A，发酵25d，制得秸秆有机肥料l。
将玉米秸秆用粉粹机粉粹，获得的秸秆片段小于1.0cm，作为处理物。向处理 物中按照15kg尿素/吨秸秆的比例加入尿素，按照1. 5X 104cfu黄绿木霉 ，. (7Wc力oofer鹏3wreow>_zVe) ACCC 32248孢子/kg秸秆接入实施例1的试剂B;然 后按照1. 0X 105cfu饲料类芽孢杆菌(尸ae/7i/7sci"tAs pa/wh') ACCC 10273孢子/kg 秸秆接入实施例1的试剂H发酵2天；最后按照1. 5 X 104cfu绿色木霉(7^'c力o^ r/zH w'nVe) ACCC 30166孢子/kg秸秆接入实施例1的试剂A，发酵20d，制得秸秆有 机肥料3。
2) 步骤1)制备的有机肥料的WSC和总有机氮测定
秸秆有机肥料总有机氮测定采用H2S04-HA消煮，凯氏定氮法，秸秆有机肥料 WSC (水溶性碳)测定采用重铬酸钾容量法。实验重复3次。
WSC和总有机氮的测定结果表明，秸秆有机肥料1的WSC (水溶性碳)为
76.42g/kg ， WSC与总有机氮的比值为0.71， T值(终点C/N与起始C/N的比值)为 0.44，达到腐熟要求，比正常堆腐发酵时间至少提前15天；秸秆有机肥料3的WSC (水溶性碳)为5. 82g/kg ， WSC与总有机氮的比值为0. 75T值(终点C/N与起始C./N 的比值)为0.42，达到腐熟要求，比正常堆腐发酵时间至少提前20天。 土述数值均为3次重复的平均值。
实施例5、实施例2的用于降解秸秆的菌剂降解秸秆制备肥料
1) 制备有机肥料
将小麦秸秆用粉粹机粉粹，获得的秸秆片段小于L0cm，作为处理物。向处理 物中按照15kg尿素/吨秸秆的比例加入尿素，按照1. OX 104cfu黄绿木霉
(7^ic力ocfei^a awreow'nVe) ACCC 32248孢子/kg秸秆或按照1. 5X 104cfu饲料类 芽孢杆菌(尸3eyH7^ciZ/M / aZw力')ACCC 10273孢子/kg秸秆或按照1. OX 104cfu绿 色木霉(7y7'c力oofem3 w'nWe) ACCC 30166孢子/kg秸秆接入实施例2的制备的用 于降解秸秆的菌剂发酵30d，制得秸秆有机肥料2。
2) 步骤l)制备的有机肥料的WSC和总有机氮测定 秸秆有机肥料的WSC和总有机氮测定方法同实施例4。
WSC和总有机氮的测定结果表明，有机肥料2的WSC (水溶性碳)为6. 40g/kg ， WSC与总有机氮的比值为0.70， T值(终点C/N与起始C/N的比值)为0.48，达到腐 熟要求，比正常堆腐发酵时间至少提前10天。
实施例6、秸秆有机肥料的田间实验
田间实验分别选择油菜和白菜田，采用完全随机区组设计，3个区组，每个区 组设5个小区，试验组为秸秆有机肥料l、 2和3在播种期或移栽期作为基肥施用， 对照l为直接施用秸秆，对照2为未使用任何肥料，每小区面积为15平方米。
对照与试验组除施肥不同外，其他田间管理均相同。
在移栽40天后测定土壤中的碱解氮、速效磷、钾和有机质含量及土壤脲酶活 性和纤维素酶活。
以碱解扩散法测定土壤碱解氮；用0.5 mo" L—'NaHC(V法测定土壤速效磷；用 浓H2S0厂&&204容量法一外加热法测定土壤有机质含量；用DNS还原比色法测定纤维 素酶活性；用苯酚钠比色法测定脲酶活性。
测定结果表明，使用秸秆有机肥料1的土壤中碱解氮、速效磷、钾和有机质含 量与对照2相比分别提高7. 38±1. 54 mg/kg、 8. 52±2. 36 mg/kg、 15. 30±5. 60mg/kg， 1. lg/kg±0.43， 土壤脲酶活性与对照2相比平均提高14.38±1.35%，纤维 素酶活与对照2相比平均提高103.61±12. 58%，且比对照1高49.23士6. 32%。
使用秸秆有机肥料2的土壤中碱解氮、速效磷、钾和有机质含量与对照2相法 分别提高7. 08±2.40mg/kg、 8. 00± 1. 58mg/kg、 13. 25±4. 56mg/kg， 1.31±0. 15mg/kg， 土壤脲酶活性与对照2相比平均提高15.00±3.65%，纤维素酶 活与对照2相比平均提高106. 37 ±5. 84%，且比对照1高55. 45 ±7. 56%。
使用秸秆有机肥料3的土壤中碱解氮、速效磷、钾和有机质含量与对照2相比 分别提高6. 23±1.50mg/kg、 6. 78± 1. 84mg/kg、 10. 34±5. 21mg/kg，
I. 76±0.62mg/kg， 土壤脲酶活性与对照2相比平均提高16±2. 35%，纤维素酶活与 对照2相比平均提高95. 37 ±13. 42%，且比对照1高56. 47±9. 65%。
在生长中期，测定油菜和白菜叶绿素；在移栽26天后测定油菜和白菜的还原 糖与Vc含量；在收获期测定油菜和白菜的产量，实验重复三次。 叶绿素测定方法如下
分别取新鲜除去叶脉的油菜和白菜叶片，剪碎置于20ml具塞刻度管中，加乙 醇和丙酮按体积比l : l混合的混合液，30'C浸泡过夜，分别在440nm、 644 nm、 662 nm处测定浸提液吸光度，根据Ca=9. 784XD662-0. 990XD644、 Cb=21. 426XD644-4.6550 X D662 、 Ca+b=5. 134 X D662+20. 436 X D644、 Cc=4. 695 X D44。-0. 268 X (Ca +Cb)等公式计 算叶绿素含量(mg/L)。计算叶绿素含量(mg/L)。
还原糖测定采用蒽铜比色法。
Vc含量测定采用2， 6—二氯靛酚滴定法。
实验结果表明，秸秆有机肥料1施入土壤可促使油菜和白菜叶绿素含量可维持 在较高水平，与对照1相比，生长中期油菜和白菜叶绿素含量分别提高 25.99±2. 36%和10.98±1.48%;秸秆有机肥料1施/^士壤可促进油菜和白菜对氮、 磷、钾的吸收利用，与对照2相比，油菜和白菜产量分别提高22.97±3.34%和. 2.80±1.03%;秸秆有机肥料1施入土壤与对照2相比，油菜还原糖与Vc含量分别 提高21. 8±2. 85%和6. 89±1. 52%;白菜还原糖与Vc含量分别提高9±0. 58%和 23. 53 ±3. 59%。
秸秆有机肥料2施入土壤可促使油菜和白菜叶绿素含量可维持在较高水平，与 对照1相比，生长中期油菜和白菜叶绿素含量分别提高26. 45±4. 07%和
II. 89±2.36%;秸秆有机肥料2施入土壤可促进油菜和白菜对氮、磷、钾的吸收利
9用，与对照2相比，油菜和白菜产量分别提高24.05±1.29%和3.25±1.30%;秸秆 有机肥料2施入土壤与对照2相比，油菜还原糖与Vc含量分别提高25. 30±2. 87% 和8. 03±1. 29%;白菜还原糖与Vc含量分别提高10. 36±1. 32%和25. 36±2. 20%。
秸秆有机肥料3施入土壤可促使油菜和白菜叶绿素含量可维持在较高水平，与 对照1相比，生长中期油菜和白菜叶绿素含量分别提高26. 00±2. 40%和 11.28±1.68%;秸秆有机肥料3施入土壤可促进油菜和白菜对氮、磷、钾的吸收利 用，与对照2相比，油菜和白菜产量分别提高21.07±2.34%和1.80±1.03%;秸秆 有机肥料3施入土壤与对照2相比，油菜还原糖与Vc含量分别提高19. 8±3. 85% 和7.69±2. 52%;白菜还原糖与Vc含量分别提高8.91士1.58。/。和20. 53±4. 59%。
权利要求
1、一种用于降解秸秆的菌剂，它的活性成份包括绿色木霉(Trichoderma viride)、黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)和饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)。
2、 根据权利要求l所述的菌剂，其特征在于所述菌剂中，所述绿色木霉(7yic力ooferj773 pa'i"/ofe)、所述黄纟录木雾(7]ric力of/e2ma aoreon'ricfe)禾口所述词茅斗 类芽孢杆菌(尸se/7i力ac^^^ pato"')的集落形成单位数目比为(0.8-1.2): (0.8-1.2) : (0.8-1.2)。
3、 根据权利要求1或2所述的菌剂，其特征在于所述绿色木霉(7^'c力oofei7M w'rjWe)为绿色木霉(7^'c力ot/e27z 3 ACCC 30166，所述黄绿木霉(7>ic/ oGfe'7Z73 awreow'n'afe)为黄绿木霉(7>ici ot/e27i73 awreow'rit/e) ACCC 32248，所述饲料类芽 孢杆菌(尸ae/n'/ aci"〃s /^/wh)为饲料类芽孢杆菌(尸3e7W'力scJ'"ws pa/wh') ACCC 10273。
4、 根据权利要求1至3中任一所述的菌剂，其特征在于所述降解秸秆的菌剂 中，所述绿色木霉(7>icA^fera a Wr7'Je) ACCC 30166、所述黄绿木霉(:Trj'c力oafenBa 朋reow力We) ACCC 32248和所述饲料类芽孢杆菌(/^e^7^cW勿s; ^"h') ACCC 10273 分别独立包装。
5、 根据权利要求1至3中任一所述的菌剂，其特征在于所述降解秸秆的菌剂 中，所述绿色木霉(7yic力of/eryag Wrid/e) ACCC 30166、所述黄绿木霉(7rj'c力ofifen M 朋reo^riofe) ACCC 32248和所述饲料类芽孢杆菌(尸3e/^7^c2'〃iAs，/wh')ACCC 10273 混合在一起。
全文摘要
本发明公开了一种用于降解秸秆的菌剂。本发明公开的用于降解秸秆的菌剂，它的活性成份包括绿色木霉(Trichoderma viride)、黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)和饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)。所述菌剂中，所述绿色木霉(Trichoderma viride)、所述黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)和所述饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)的集落形成单位数目比为(0.8-1.2)∶(0.8-1.2)∶(0.8-1.2)。本发明的用于降解秸秆的菌剂能快速腐熟秸秆制备有机肥料，所制备的有机肥料用作基肥，可显著改善蔬菜的品质。
文档编号C12N1/14GK101638622SQ20081022424
公开日2010年2月3日 申请日期2008年10月14日 优先权日2008年10月14日
发明者姜瑞波, 张晓霞, 张瑞颖, 李世贵, 阮志勇, 顾金刚, 马晓彤 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所