高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生及用其生产甘草次生代谢产物的方法
【专利摘要】本发明涉及一种采用发根农杆菌侵染乌拉尔甘草幼苗茎节诱导产生毛状根的方法，并用此毛状根生产药用次生代谢产物，例如甘草苷和甘草酸等，尤其是高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法及用毛状根生产甘草次生代谢产物的方法。其特征在于，包括如下步骤：（1）无菌外植体的获得：取乌拉尔甘草种子，灭菌后接种于幼苗培养基进行培养，获得株龄12～15d的无菌幼苗，切除根部后作为外植体；（2）发根农杆菌工程菌液的制备；（3）针刺幼苗茎节诱导毛状根产生。本发明提供了一种高效、稳定诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，并对获得的甘草毛状根选用适当的液体培养基进行悬浮培养并应用于生产药用次生代谢产物（甘草苷和甘草酸等）。
【专利说明】高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生及用其生产甘草次生代谢产物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种采用发根农杆菌侵染乌拉尔甘草幼苗茎节诱导产生毛状根的方法，并用此毛状根生产药用次生代谢产物，例如甘草苷和甘草酸等，尤其是高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法及用毛状根生产甘草次生代谢产物的方法。
【背景技术】
[0002]乌拉尔甘草(Glycyrrihiza uralensisi Fisch.)是我国重要的传统中药,具有清热解毒、润肺祛痰、缓急止痛、补气益脾胃等功效，被誉为“百草之王”，其药用价值是其它资源不能替代的。甘草的主要药效成分包括甘草酸和甘草苷，其中甘草酸是非常珍贵的解毒齐?，可防治病毒性肝炎、高血脂和癌症等疾病；甘草黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗衰老和保肝等药理作用，此外，甘草不仅是重要的药材，还广泛应用于日用化工品及食品领域，其中甘草酸还是一种天然甜味剂，甘草苷是一类天然抗菌剂和防腐剂。随着甘草资源的不断开发与利用，国内市场甘草的需求总量为9.0万~10.0万吨，但全国甘草总量只有2.5万~3.0万吨，资源短缺已趋白热化，严重影响了医药企业的生产。2001年9月，我国为了保护日益匮乏的甘草资源，限制了对野生甘草的采挖，使甘草资源缺乏加剧，目前人工栽培仍是甘草生产的主要途径，然而，人工栽培周期长，并且受地域限制，特别是在有效成分含量上，人工种植甘草与野生甘草还存在很大的差距，还不能满足市场需求。人工栽培的甘草中的甘草酸含量基本在2%以下，较野生甘草的平均值低30~40%，达不到我国药典2%的最低要求，甘草资源匮乏及其质量下降成为限制甘草资源深度开发利用的瓶颈。 [0003]随着生物工程技术的不断提高,利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)诱导药用植物产生毛状根，并对毛状根进行离体培养，迅速大量提取有效成分，是药用植物资源可持续发展的有效途径之一。
[0004]毛状根培养技术是20世纪80年代后期在植物细胞领域发展起来的一项新技术，与一般的植物细胞培养相比，毛状根可以生长在不含激素的培养基上。这一培养系统对传统药材来说很重要，因为约1/3的传统中药材是植物的根部，曾经被认为难以通过细胞培养来生产的许多源于植物根部的药物，现在正被设法通过培养毛状根来生产，发根农杆菌Ri质粒转化的毛状根生长快，易于培养，活性成分含量高，具有表达完整的代谢通路，为药用植物次生代谢产物的工业化生产提供了广阔前景；目前，关于乌拉尔甘草毛状根培养的研究并不多，大部分报道的毛状根诱导方法都是采用离体子叶节、子叶、下胚轴进行毛状根诱导。但目前所公开的乌拉尔甘草毛状根诱导培养都采用离体组织进行遗传转化，因此诱导率相对较低，并且获得的毛状根大量携带农杆菌，除菌比较困难，不利于继续进行毛状根悬浮培养，实际应用价值不大，无法满足生产需求。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是提供一种高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，能够高效、稳定诱导乌拉尔甘草毛状根的产生；
[0006]本发明的目的之二是提供一种用上述乌拉尔甘草毛状根生产甘草次生代谢产物的方法，能够得到生产甘草苷、甘草酸的原料，生产出甘草苷、甘草酸。
[0007]—种高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特别之处在于，包括如下步骤:
[0008](I)无菌外植体的获得:
[0009]取乌拉尔甘草种子，灭菌后接种于幼苗培养基进行培养，获得株龄12~15d的无菌幼苗，切除根部后作为外植体；
[0010](2)发根农杆菌工程菌液的制备:[0011]取含有Ri质粒的发根农杆菌，经活化培养，挑取单菌斑接种于YMB液体培养基培养至菌液OD6tltl值为0.6~0.8，离心后弃上清液，加入等体积Ms液体培养基稀释至菌液OD6tltl值为0.6~0.8，添加乙酰丁香酮至终浓度为100~150 μ M，制成工程菌液待用；
[0012](3)针刺幼苗茎节诱导毛状根产生:
[0013]按照步骤(1)中获得的外植体，经步骤(2)中获得的工程菌液进行农杆菌介导转化，再将介导转化过的外植体接种于共培养基中，培养24h~48h，然后将外植体接入抑菌培养基中，除菌培养10~15d，直至在外植体上子叶茎节处长出毛状根。
[0014]步骤(3)中针刺幼苗茎节诱导毛状根产生的具体步骤为:用注射器针头蘸取制备好的发根农杆菌工程菌液，在处理好的外植体即无菌甘草幼苗的子叶节处穿刺1-2次，将穿刺过的外植体置无菌滤纸上吸去多余的菌液，然后移栽到不含激素和抗生素的Ms培养基中，置25土 1°C下共培养2~3天，然后转移到含头孢霉素300~500mg/L的Ms培养基中，培养10-15天即可在子叶节处出现白色凸起，3~5天后在凸起处长出簇状绒毛根系。
[0015]步骤(1)中幼苗培养基采用Ms培养基；或者采用MS培养基，并且调整其中蔗糖至30g/L，琼脂粉至5.5g/L，无激素；步骤(2)中的Ms液体培养基是在MS培养基的基础上去掉了琼脂。
[0016]步骤(2)中发根农杆菌为含有Ri质粒的发根农杆菌ATCC15834。
[0017]步骤(2 )中YMB液体培养基的成分为酵母抽提物1.0g/L, MgSO4.7H200.2g/L, K2HPO40.5g/L, NaCl0.1 g/L,甘露醇 10.0g/L。
[0018]步骤(3)中共培养基采用Ms培养基；或者采用MS培养基，并且调整其中琼脂粉至
5.5g/L，蔗糖至30.0g/L,乙酰丁香酮至50~100 μ M ;步骤(3)中抑菌培养基采用l/2Ms培养基，即在MS培养基的基础上其中的大量兀素和微量兀素添加量为Ms培养基的一半,铁盐和有机成分含量同Ms培养基，并且添加头孢霉素300mg/L~500mg/L。
[0019]其中置25±1°C共培养2~3天的同时应处于弱散射光条件下。
[0020]一种利用乌拉尔甘草毛状根生产甘草次生代谢产物的方法，其特别之处在于，包括如下步骤:剪取权利要求1或2中所述方法得到的毛状根，长度约1.5~2.0cm，接种到含有头孢霉素100~300mg/L的l/2Ms培养基进行除菌培养，每5~7天转入新的l/2Ms培养基，直至除菌完毕，将得到的无菌毛状根根尖剪成1.0-1.5cm的段，接种于无激素的l/2Ms液体培养基中，置25 ± I °C，转速110~120rpm，暗培养条件下的恒温振荡器上振荡培养15~20天，收集毛状根，冷冻干燥后粉碎成100~200目粉末即可。
[0021]从得到的甘草毛状根粉末中提取出甘草酸、甘草苷。
[0022]其中含有头孢霉素100~300mg/L的l/2Ms培养基，即在MS培养基的基础上其中的大量兀素和微量兀素添加量为Ms培养基的一半,铁盐和有机成分含量同Ms培养基,并且添加头孢霉素100~300mg/L ;其中无激素的l/2Ms液体培养基，即在MS培养基的基础上其中的大量兀素和微量兀素添加量为Ms培养基的一半,铁盐和有机成分含量同Ms培养基，并且去掉了琼脂也无激素。
[0023]针对目前存在的乌拉尔甘草野生药用资源的严重短缺，而人工栽培甘草品质难以达到药用标准的困境，本发明提供了一种高效、稳定诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，并对获得的甘草毛状根选用适当的液体培养基进行悬浮培养并应用于生产药用次生代谢产物(甘草苷和甘草酸等)。本发明首次以乌拉尔甘草活体幼苗为受体材料，采用“针刺幼苗茎节法”，即用蘸有发根农杆菌工程菌液的针尖穿刺侵染乌拉尔甘草幼苗茎节处，快速诱导乌拉尔甘草毛状根产生，既缩短了甘草毛状根产生时间，诱导培养7天就出现毛状根，又提高了转化率，达98%以上，同时减少了毛状根除菌次数(经2次除菌培养即可)，并且，毛状根中活性成分甘草苷含量高较高，含量达干重的，接近于3年生甘草有效成分含量，为利用甘草毛状根来生产次生代谢产物奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】 [0024]图1为“针刺幼苗茎节法”诱导乌拉尔甘草毛状根的产生及液体悬浮培养生产毛状根，此时在Ms共培养基中用ATCC15834发根农杆菌工程菌液侵染幼苗的茎节位点；
[0025]图2为“针刺幼苗茎节法”诱导乌拉尔甘草毛状根的产生及液体悬浮培养生产毛状根，此时受侵染的节间位点长出白色突起；
[0026]图3为“针刺幼苗茎节法”诱导乌拉尔甘草毛状根的产生及液体悬浮培养生产毛状根，此时白色突起位点形成绒毛状；
[0027]图4为“针刺幼苗茎节法”诱导乌拉尔甘草毛状根的产生及液体悬浮培养生产毛状根，此时绒毛状侵染点长出多条毛状根；
[0028]图5为“针刺幼苗茎节法”诱导乌拉尔甘草毛状根的产生及液体悬浮培养生产毛状根，此时将长出的毛状根切下后转入含头孢霉素的l/2Ms培养基中除菌培养；
[0029]图6为“针刺幼苗茎节法”诱导乌拉尔甘草毛状根的产生及液体悬浮培养生产毛状根，此时毛状根扩大培养；
[0030]图7为“针刺幼苗茎节法”诱导乌拉尔甘草毛状根的产生及液体悬浮培养生产毛状根，此时毛状根液体悬浮培养；
[0031]图8为本发明方法得到的乌拉尔甘草毛状根PCR检测结果，其中Mimarker ；N:阴性对照；P阳性对照甘草毛状根，该图是以乌拉尔甘草毛状根基因组DNA为模板扩增ι.ο1Α基因的结果；可以看出发根农杆菌中的基因片段rolA已完全整合到了乌拉尔甘草毛状根中；
[0032]图9为本发明方法得到的乌拉尔甘草毛状根PCR检测结果，其中Mimarker ；N:阴性对照；P阳性对照甘草毛状根，该图是以乌拉尔甘草毛状根基因组DNA为模板扩增IOlC基因的结果；可以看出发根农杆菌中的基因片段IOlC已完全整合到了乌拉尔甘草毛状根中；
[0033]图10为乌拉尔甘草毛状根毛细管凝胶电泳检测结果，其中M为marker ;泳道1，3分别为阴性对照；泳道2为甘草毛状根rolC(490bp)DNA片段；泳道4为甘草毛状根rolA(248bp)DNA片段；泳道5为甘草毛状根中VirD2基因片段；泳道6，7，8分别为发根农杆菌阳性对照rolC、rolA和VirD2基因片段；毛细管电泳检测图可以证实，获得的甘草毛状根已除菌完毕，发根农杆菌中的rolA(248bp)片段和ioIC(490bp)片段已完全整合到了甘草毛状根基因组中。
[0034]【具体实施方式】
[0035]实施例1:
[0036]1、乌拉尔甘草无菌苗的培养:
[0037]挑选饱满、干净的乌拉尔甘草种子，加入浓硫酸拌匀(以浓硫酸浸润种子表面为宜),处理40min后用自来水冲洗干净,用0.1%升汞消毒15分钟，然后用无菌水冲洗4次，再加入70%的乙醇消毒30秒，用无菌水冲洗4次，然后接种于Ms (固体)培养基中，置25°C，每天16小时光照，8小时黑暗条件下培养14天，待幼苗长至3.0cm高度并展出2_3对叶时，取幼苗切除根后用作被侵染外植体。
[0038]上述Ms (固体)培养基即为MS培养基，即Murashige and Skoogl962培养基。
[0039]2、制备发根农杆菌工程菌液:
[0040]将发根农杆菌ATCC15834 (Rhizobium rhizogenes (Riker et al.) Young etal.(ATCC15834)CIP104786 ;通过美国ATCC公司在中国的代理公司-北京中原公司购买)从_70°C冰箱中取出，划线接种于YMB固体培养基(添加琼脂粉12.0g/L)上，于28°C下活化培养48小时，挑取单菌斑接种于50mLYMB液体培养基(不加琼脂粉)中，28°C下120rpm暗培养条件下振荡培养，发根农杆菌菌液OD6tltl值达到0.6~0.8时，取菌液置离心管中，8000rpm离心lOmin，弃去上清液，用Ms液体培养基稀释至菌液0D_值达0.6~0.8，加入乙酰丁香酮至终浓度为100uM，28°C下180rpm振荡培养2h后用于侵染。
[0041]上述YMB液体培养基的成分为酵母抽提物(Yeast extract) 1.0g/L, MgSO4.7Η200.2g/L, K2HPO40.5g/L, NaCl0.lg/L,甘露醇(Mannitol )10.0g/L。在该 YMB 液体培养基的基础上添加琼脂粉12.0g/L即可得到YMB固体培养基。
[0042]上述Ms液体培养基与Ms培养基的成分相同，但去掉了其中的琼脂，使培养基成为液体，即Ms液体培养基采用无琼脂的Ms培养基。
[0043]3、“针刺幼苗茎节法”诱导乌拉尔甘草毛状根的产生:
[0044]用无菌注射器针头吸取上述制备好的发根农杆菌工程菌液，用针尖穿刺幼苗子叶节处，共穿刺2次，然后将侵染的幼苗转移至Ms (固体)培养基中于25°C，12小时光照12小时暗培养条件下共培养2天，然后移栽到含头孢霉素500mg/L的l/2Ms (固体)培养基中培养10天，即可在被侵染部位出现白色凸起(图1)，随后在白色凸起处长出簇状绒毛状根系(图2、3、4)。将诱导出的毛状根剪下，用含头孢霉素500mg/L的无菌水溶液清洗毛状根，然后用无菌水冲洗2次，吸干水后接种于含有头孢霉素300mg/L的l/2Ms培养基上进行除菌培养，每周转接一次，直至除菌完毕后接种于不含抗生素和激素的l/2Ms (固体)培养基上培养(图5、6)。
[0045]上述含头孢霉素500mg/L的l/2Ms (固体)培养基采用l/2Ms培养基，即在MS培养基的基础上，其中的大量兀素和微量兀素添加量为Ms培养基的一半,铁盐和有机成分含量同Ms培养基，并且添加头孢霉素500mg/L。
[0046]上述l/2Ms培养基，即在MS培养基的基础上,其中的大量兀素和微量兀素添加量为Ms培养基的一半,铁盐和有机成分含量同Ms培养基。
[0047]上述不含抗生素和激素的l/2Ms (固体)培养基，即在MS培养基的基础上，其中的大量兀素和微量兀素添加量为Ms培养基的一半,铁盐和有机成分含量同Ms培养基,无激素也不含抗生素。
[0048]4、乌拉尔甘草毛状根的悬浮培养:
[0049]将除菌彻底、分支多、生长快的毛状根根尖剪取2.0cm左右，接种于无激素的l/2Ms液体培养基(蔗糖含量为40.0g/L)中，每瓶接种200mg，置25°C下120rpm，暗培养条件下的恒温摇床上振荡培养，15天后收集毛状根，置滤纸上吸干水分后称重，毛状根增殖倍数达30倍，切取生长旺盛的毛状根根尖，用于继代及大量培养。(图7)
[0050]上述无激素的l/2Ms液体培养基(蔗糖含量为40.0g/L),即在MS培养基的基础上，其中的大量兀素和微量兀素添加量为Ms培养基的一半,铁盐和有机成分含量同Ms培养基，蔗糖含量调整为40.0g/L，无激素。
[0051]5、乌拉尔甘草毛状根的分子鉴定:
[0052](I )、毛状根基因组DNA和未转化甘草根基因组DNA的微量提取(采用CTAB法):
[0053]取乌拉尔甘草毛状根和未转化的根200mg，加液氮研磨成粉末，迅速转入1.5ml离心管中，加入700 μ I CTAB抽提液并迅速摇匀，于65°C水浴45min，中途轻微振荡二次以混匀。冷却后加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，轻柔颠倒混匀至乳化状，再以8000rpm离心lOmin。取上清液于 1.5mL离心管,重新加入等体积的氯仿:异戍醇(24:1),轻柔颠倒混匀至乳化状再以8000rpm离心lOmin，取上清液于1.5mL离心管中，加入2/3体积的异丙醇，颠倒混匀，于_20°C下放置30min,4°C下10000r/min离心5min,弃去上清液,沉淀用70%乙醇洗2-3次，3000rpm离心lmin，彻底挥发除去乙醇，加入40 μ I双蒸水溶解沉淀，即为所需DNA样品，-20°C保存。
[0054](2 )、发根农杆菌质粒DNA的提取:
[0055]取2mL发根农杆菌菌液于2mL离心管中，室温下以8000r/min离心8min,弃上清液，收集菌体，加入预冷的溶液1300 μ 1，快速颠倒离心管10次以混合均匀，室温下放置lOmin，再加入600 μ I溶液II，快速颠倒离心管10次，置冰浴中lOmin，加入冰溶液III溶液450 μ I,充分混匀，冰浴IOmin后以12000rpm离心5min,转移上清液于另一 2mL离心管中，加ImL冰异丙醇，充分混匀，静置IOmin后以1000Orpm离心lOmin，弃上清液，加70%冰乙醇漂洗沉淀，3000rpm离心Imin彻底挥去乙醇，加入40 μ I双蒸水溶解DNA，_20°C保存备用。
[0056](3)、乌拉尔甘草毛状根分子检测:
[0057]取IOOng甘草毛状根基因组DNA为模板，以甘草细胞基因组DNA阴性对照，以发根农杆菌质粒DNA为阳性对照，rolA基因的引物序列为:Forward Primer:5/ -CGTTGTCGGAATGGCCCAGACC-3 '，Reverse Primer:5 ' -CGTAGGTCTGAATATTCCGGTCC-3 ' ;rolC 基因的引物序列为:Forward Primer: 5 ' -TGTGACAAGCAGCGATGAGC-3 ' , Reverse Primer:5' -GATTGCAAACTTGCACTCGC-3'。
[0058]为了进一步确定获得的甘草毛状根已成功导入了发根农杆菌Ri质粒的rolA和rolC基因，转化毛状根未受到发根农杆菌污染，对发根农杆菌Ri质粒的病毒区特征基因VirD2 进行 PCR 检测，引物序列为:Forward Primer: 5 ' -ATGCCCGATCGAGCTCAAGT-3 '，Reverse Primer:-CCTGACCCAAACATCTCGGCTGCCCA-3'。PCR 反应采用 25 μ L 体系，94°C变性3min，55°C退火0.5min, 72°C延伸3min，35个循环，最后于72°C延伸5min，扩增产物用
0.8%琼脂糖凝胶电泳和QLAxcel全自动DNA/RNA分析系统检测(见图8、9、10)。
[0059]结果表明，甘草毛状根的DNA经PCR扩增得到了 248bp的RolA片段和490bp的RolC片段，而对照没有PCR扩增产物，同时，对甘草毛状根毛细管凝胶电泳检测中没有发现发根农杆菌ATCC15834的特异性片段VirD2说明甘草毛状根没有携带农杆菌，除菌很彻底，RolA, RolC基因片段已成功插入到乌拉尔甘草基因组中，所得到的甘草毛状根确实为发根农杆菌ATCC15834侵染后形成的。
[0060]登陆http//: www.ncb1.nlm.nih.gov,应用 BLAST 程序将测定的 RolA、RolC 序列与GenBank中的RolA、RolC (GenBank:X64255.1)、的DNA序列进行同源性比较，BLAST比对结果显示，RolA、RolC序列相似度达97.5%。
[0061]6、甘草毛状根悬浮培养生产培养基的筛选:
[0062]选取在无激素Ms (固体)培养基上生长旺盛且分枝较多的毛状根，切取根尖1.0~
1.5cm部位0.1g转入1/2MS液体培养基(蔗糖浓度为40.0g/L), (150mL三角瓶，50mL/瓶)，置25°C下转速为IlOrpm的恒温振荡箱中暗培养，IOd后毛状根开始进入对数生长期，生长至21d，毛状根生物量达到最大，收集毛状根，置滤纸上吸干水分后称重测量，增殖倍数达到29.13倍(鲜重)，将收集到的毛状根冷冻干燥，粉碎成100目干粉。
[0063]采用2010年版《中国药典》中甘草酸、甘草苷提取方法进行提取，高效液相色谱法测定毛状根中甘草苷、甘草酸 ，其中甘草苷含量为0.526%，甘草酸含量1.26%，接近于3年生甘草中的含量，因此，l/2Ms液体培养基(蔗糖浓度为40.0g/L)可作为毛状根高效生产甘草酸、甘草苷等药用次生代谢产物的生产培养基。
[0064]上述的无激素Ms (固体)培养基，即无激素的Ms培养基。
[0065]上述的1/2MS液体培养基(蔗糖浓度为40.0g/L),即在MS培养基的基础上其中的大量兀素和微量兀素添加量为Ms培养基的一半,铁盐和有机成分含量同Ms培养基,并且去掉了琼脂，调整蔗糖浓度为40.0g/L。
[0066]序列表
[0067]<110>宁夏农林科学院
[0068]〈120〉高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生及用其生产甘草次生代谢产物的方法
[0069]<160>8
[0070]<210>1
[0071]<211>282
[0072]<212>DNA
[0073]<213>RolA 片段 DNA 序列(GenBank = XM255.1)
[0074]〈400〉I
[0075]
【权利要求】
1.一种高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)无菌外植体的获得: 取乌拉尔甘草种子，灭菌后接种于幼苗培养基进行培养，获得株龄12~15d的无菌幼苗，切除根部后作为外植体； (2)发根农杆菌工程菌液的制备: 取含有Ri质粒的发根农杆菌，经活化培养，挑取单菌斑接种于YMB液体培养基培养至菌液0D_值为0.6~0.8，离心后弃上清液，加入等体积Ms液体培养基稀释至菌液0D_值为0.6~0.8，添加乙酰丁香酮至终浓度为100~150 μ M，制成工程菌液待用； (3)针刺幼苗茎节诱导毛状根产生: 按照步骤(1)中获得的外植体，经步骤(2)中获得的工程菌液进行农杆菌介导转化，再将介导转化过的外植体接种于共培养基中，培养24h~48h，然后将外植体接入抑菌培养基中，除菌培养10~15d，直至在外植体上子叶茎节处长出毛状根。
2.如权利要求1所述的高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特征在于:步骤(3)中针刺幼苗茎节诱导毛状根产生的具体步骤为:用注射器针头蘸取制备好的发根农杆菌工程菌液，在处理好的外植体即无菌甘草幼苗的子叶节处穿刺1-2次，将穿刺过的外植体置无菌滤纸上吸去多余的菌液，然后移栽到不含激素和抗生素的Ms培养基中，置25土1°C下共培养2~3天，然后转移到含头孢霉素300~500mg/L的Ms培养基中，培养10-15天即可在子叶节处出现白色凸起，3~5天后在凸起处长出簇状绒毛根系。
3.如权利要求1所述的高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特征在于:步骤(1)中幼苗培养基采用Ms培养基；或者采用MS培养基，并且调整其中蔗糖至30g/L，琼脂粉至5.5g/L，无激素；步骤(2)中的Ms液体培养基是在MS培养基的基础上去掉了琼脂。
4.如权利要求1所述的高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特征在于:步骤(2)中发根农杆菌为含有Ri质粒的发根农杆菌ATCC15834。
5.如权利要求1所述的高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特征在于:步骤(2)中YMB液体培养基的成分为酵母抽提物1.0g/L, MgSO4.7Η200.2g/L，K2HPO40.5g/L, NaCl0.1 g/L,甘露醇 10.0g/L。
6.如权利要求1所述的高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特征在于:步骤(3)中共培养基采用Ms培养基；或者采用MS培养基，并且调整其中琼脂粉至5.5g/L，蔗糖至30.0g/L,乙酰丁香酮至50~100 μ M ; 步骤(3)中抑菌培养基采用l/2Ms培养基，即在MS培养基的基础上其中的大量元素和微量元素添加量为Ms培养基的一半，铁盐和有机成分含量同Ms培养基，并且添加头孢霉素300mg/L ~500mg/L。
7.如权利要求2所述的高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特征在于:其中置25± 1°C共培养2~3天的同时应处于弱散射光条件下。
8.一种利用乌拉尔甘草毛状根生产甘草次生代谢产物的方法，其特征在于，包括如下步骤:剪取权利要求1或2中所述方法得到的毛状根，长度约1.5~2.0cm，接种到含有头孢霉素100~300mg/L的l/2Ms培养基进行除菌培养，每5~7天转入新的l/2Ms培养基，直至除菌完毕，将得到的无菌毛状根根尖剪成1.0-1.5cm的段，接种于无激素的l/2Ms液体培养基中， 置25± 1°C，转速110~120rpm，暗培养条件下的恒温振荡器上振荡培养15~20天，收集毛状根，冷冻干燥后粉碎成100~200目粉末即可。
9.如权利要求8所述的利用乌拉尔甘草毛状根生产甘草次生代谢产物的方法，其特征在于:从得到的甘草毛状根粉末中提取出甘草酸、甘草苷。
10.如权利要求8所述的利用乌拉尔甘草毛状根生产甘草次生代谢产物的方法，其特征在于:含有头孢霉素100~300mg/L的l/2Ms培养基，即在MS培养基的基础上其中的大量元素和微量元素添加量为Ms培养基的一半，铁盐和有机成分含量同Ms培养基，并且添加头孢霉素100~300mg/L ;其中无激素的l/2Ms液体培养基，即在MS培养基的基础上其中的大量兀素和微量兀素添加量为Ms培养基的一半,铁盐和有机成分含量同Ms培养基,并且去掉了琼脂也无激素。`
【文档编号】A01H5/06GK103695458SQ201310551834
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】郭生虎, 王敬东, 马洪爱, 石磊 申请人:宁夏农林科学院