一种女贞叶中抑制脲酶成分的提取方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种女贞叶中抑制脲酶成分的提取方法及应用，本发明提供一种女贞叶中抑制脲酶成分的提取方法及应用，揭示了以女贞叶为原料，以有机溶剂作溶剂辅以微波作粗提，再用丙烯酰胺层析纯化提取脲酶抑制成分-即尿素增效剂，并以该尿素增效剂用于抑制脲酶提高尿素氮利用的试验。结果表明，其抑酶率达到71.2%，尿素氮利用提高了。
【专利说明】—种女贞叶中抑制脲酶成分的提取方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于农业【技术领域】，涉及一种女贞叶中抑制脲酶成分的提取方法及应用。
【背景技术】
[0002]早在40年代，人们就发现，往土壤中加入某些可抑制脲酶活性的化合物能延缓尿素的水解。60年代人们开始了大量的脲酶抑制剂筛选工作，发现氨荒酸盐、含硼化合物、尿素衍生物、原子量大于50的重金属、含氟化合物、多元酚及多元醌和抗代谢物等对脲酶活性具抑制作用；Burn，R.G (1978)认为酚类和醌类是比较有希望的脲酶抑制剂，其中多元酚醌的效果好于单元酚醌；Bremner等(1971)证实，酚醌对脲酶的抑制效果比无机物好；Bundy等(1973)对醌的同系物研究表明，被卤素取代的P-苯醌对脲酶抑制效率较高；Mishra (1979)发现，在IOOppm时，除蒽醌外，1.4-萘醌等许多醌类化合物均有抑制脲酶活性和抑制硝化作用；RodgerS等(1984)用5种氨基甲酚进行试验表明，4-氨基邻甲酚和4-氨基间甲酚对脲酶活性有显著的抑制作用；Calamea等(1984)用15N标记的尿素，开展了氢醌(HQ)对尿素氮利用率影响的研究，发现HQ能促进植株对土壤氮和尿素氮的吸收；Bremner (1978)指出，HQ是最有希望的抑制剂；周礼恺(1988)等发现10mg/5公斤土的HQ可使春小麦增产10%，提高尿素氮利用率3.7%，减少尿素氮的损失率4.7% ;汤树德等(1993)报道HQ能有效抑制土壤中尿素氮的挥发；张春兴(1996)报道尿素混拌HQ作基肥施用可以减慢尿素分解速度和挥发速度，提高玉米和水稻的产量；从抱1(1(1977)发现磷酸胺类化合物可作为脲酶抑制剂以来，相继有不少这类化合物作为脲酶抑制剂申请了专利；Martens (1984)用10余个磷酸胺类化合物进行试验表明，在IOPPm时,这些化合物抑制尿素水解百分率从11%至93%不等，其中O-苯基磷酰二胺(PPD)抑制率最高；Vlek (1980)发现，在水田中2%的PPD (与尿素重量比)与尿素一起施用，可减少氨的挥发；Kampte(1982)的工作表明，PH)可显著减少尿素氮以氨的形式损失；ByrneS (1983)报道，5% PPD与尿素表施或混施后，氨的挥发减少了 2% ;Tomar等(1984)发现，2%的PH)有延缓尿素水解的趋势；NBPT (N- 丁基硫代磷酰三胺)是另一类效果较好的脲酶抑制剂；Bremner和KrogmeieK 1988)报道，当NBPT的用量0.01 %时，尿素肥料对种子萌发的负效应大为减少；王小彬(1995)报道了春小麦施尿素时，配用NBPT因减缓了尿素的水解和减少了 NH3的挥发；Phongpans等(1995)报道，NBPT与PTO —起施用时，尿素N的挥发损失从15%降低至少3%;唐建阳等(1998)报道稻田配合尿素施用NBPT对水稻有增产效果；陈济深等(1996)报道微生物代谢产物I36N抑制脲酶活性较NBPT特久而有效。但是由于各抑制剂或存在成本过高或存在对环境的污染和应用效果不稳定的情况，目前仍无一抑制剂得到大面积的推广应用。我们多年来在进行脲酶抑制剂筛选工作中，首次发现女贞叶提取物对脲酶具强烈抑制作用。并且具有用量少，作用迅速且持久的特性。
[0003]尿素是目前世界及我国农业生产中应用面积最广，数量最多的一种氮肥。但尿素施用到土壤中，经脲酶分解 成碳酸铵，作物来不及吸收，碳酸铵便以氨的形式挥发，造成肥效降低，一般尿素肥效仅达30~50%。若能抑制土壤中脲酶的活性，使尿素缓慢分解成碳酸铵，作物对尿素氮的利用率则可大大提高。
【发明内容】
[0004]为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种女贞叶中抑制脲酶成分的提取方法及应用，揭示了以女贞叶为原料，以有机溶剂作溶剂辅以微波作粗提，再用丙烯酰胺层析纯化提取脲酶抑制成分-即尿素增效剂，并以该尿素增效剂用于抑制脲酶提高尿素氮利用的试验。其抑酶率达到71.2%，尿素氮利用提高了。揭示出该成果巨大的应用前景。
[0005]其技术方案如下:
[0006]一种女贞叶中抑制脲酶成分的提取方法，包括以下步骤:
[0007]A.女贞叶中脲酶抑制成分粗提
[0008]Al女贞叶脲酶抑制剂成分的超声波辅助提取[0009]称取40g女贞叶粉末，加入800mL60%的乙醇溶液，进行微波辅助提取2min，微波功率为231W，再进行水提，水提温度60°C，时间30min，每隔IOmin轻轻摇匀，浸提所得粗液进行离心，转速为5000r/min,离心时间为15min,得浸提上清液；
[0010]A2提取液减压浓缩、萃取
[0011]将乙醇提液于真空旋转蒸发仪中50°C减压浓缩至乙醇完全分离出，将浓缩液与正丁醇以体积比1:2进行萃取，每次萃取六小时，重复萃取2次，得正丁醇(A)和水相；将水相与氯仿以体积比1:2进行萃取，每次萃取6小时，重复萃取2次，得氯仿相(B)和水相；将水相与石油醚相以体积比1:2进行萃取，每次萃取六小时，重复萃取2次，得石油醚相(C)和水相(D)；
[0012]B.女贞叶中脲酶抑制成分聚酰胺凝胶层析分离
[0013]BI准备上样液:将萃取得到的水相用旋转蒸发仪浓缩，温度不宜过高，45°C —55°C，超过60°C抑制脲酶活性成分会被破坏，浓缩至IOmL以下，备用；
[0014]B2基质的处理:称取所需的聚酰胺凝胶，以95%的乙醇浸泡24小时，充分膨胀后用乙醇法装柱；
[0015]B3装柱:将酒精浸泡好的基质约50ml，通过漏斗缓慢倒入柱中，边加边用木夹子轻敲柱子，同时用竹签轻轻压实，流速控制在20滴/min，待装至25cm柱高；
[0016]B4平衡:用95%乙醇洗柱，不时检查流出的乙醇液，待乙醇液与去离子水以1:3的体积比混合，振摇至不显白色浑浊，结束洗柱，用纯水将柱中树脂洗至无醇味后备用；
[0017]B5上样与吸附:将A步骤准备的样液缓慢上柱，吸附20min，流速20滴/min，去离子水洗脱；
[0018]B6洗脱:先用蒸馏水进行洗脱，将试管放在试管架上按序接收洗脱液，每管接收SmL洗脱液，每接收3管吸取少量试样进行生化检测试验；待水洗样液颜色很浅检测不出任何成分时，再依次用95%、80%、70%、60%、50%、40%的乙醇溶液洗脱，每管接收8mL洗脱液，每接收3管吸取少量试样进行生化检测试验；待洗脱样液颜色很浅检测不出任何成分时，结束洗脱；
[0019]B7聚酰胺再生。
[0020]一种本发明所述的女贞叶中抑制脲酶成分的应用方法，水稻全生育期氮肥用尿素，分基肥、分蘖肥、长粗肥3次施用，各次比例为0.42:0.28:0.3，在各次施尿素2天后，施以3750g/hm2量的女贞叶中脲酶抑制成分，使用方法为将女贞叶中脲酶抑制成分溶解于水中再泼浇到稻田。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果:
[0022](I)本发明产品女贞叶中抑制脲酶成分为一生物制品，其原料为植物女贞叶片，产品制备过程也不涉及有毒有害产品，提取工艺也不致引起所提取脲酶抑制剂成分的致毒变化。与现有的已报道的一百多种脲酶抑制剂多为无机或有机化学成分比较，具有不污染环境的特点；
[0023](2)本发明产品由于抑制脲酶效果好，较之目前公认最好的几种脲酶抑制剂，如O-苯基磷酰二胺(pro)、N-丁基硫代磷酰三胺(NBPT)、氢醌(HQ)的抑酶效果要高10~30% ；
[0024](3)本发明提取脲酶抑制剂工艺采取了微波辅助提取的工艺，较与不加微波辅助工艺可以较大幅度地提高其提取效率，大约可以降低生产成本的10~20% ；
[0025](4)本发明提取脲酶抑制剂工艺采取了聚酰胺凝胶精制工艺，聚酰胺凝胶可以反复使用，可降低产品生产成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1是女贞叶中脲酶抑制成分的分离纯化流程图；
[0027]图2是微波功率单因素抑制率；
[0028]图3是料液比单因素抑制率；
[0029]图4是微波助提时间单因素抑制率；
[0030]图5是乙醇浓度单因素抑制率；
[0031]图6是女贞叶提取物对脲酶的抑制作用动力学曲线。
【具体实施方式】
[0032]下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0033]实施例1、女贞叶抑制脲酶活性成分提取工艺条件试验
[0034]1、不同微波功率对脲酶抑制物提取的影响
[0035]精确称取10份女贞叶粉末，每份1.5g，分两组，每个料液比处理2瓶，用60%乙醇浸提，以料液比1:20投料，在不同微波功率(119W、231W、385W、539W、700W)下提取2min，再进行水提，水提温度60°C，时间30min，每隔IOmin轻轻摇匀。浸提所得粗液进行离心(5000r/min, 15min)，得浸提上清液，70°C水浴5min。移液管移取2mL上清液置于试管中，加
1.0mL脲酶提取液，摇匀，室温放置Ih后加入4mL柠檬酸盐缓冲液(pH为6.7)及ImL0.025g/mL的尿素溶液，同时以不加尿素的为对照组，用蒸馏水定容到20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色、定容。Ih内在分光光度计上于波长578nm处比色。从而确定抑酶作用最佳的微波功率。
[0036]由图2可知，随着微波功率的增大，抑制率逐渐上升，达到231W时，抑制率达到最大值，之后随着微波功率的增大，抑制率逐渐降低。其原因可能是因为在低功率的时候，细胞破坏程度较小，有效抑制成分没有溶出，而在高功率时，溶出的有效成分失活，使得抑制率明显降低。故可以确定最佳微波功率为231W，可选择119W、231W、385W作为正交的三个水平。
[0037]2、不同料液比对脲酶抑制物提取的影响
[0038]精确称取10份女贞叶粉末，每份1.5g，分两组，每个料液比处理2瓶，微波功率设为231W，用60%乙醇浸提，按不同料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)投料，在微波辅助条件下提取2min，再进行水提，水提温度60°C，时间30min，每隔IOmin轻轻摇匀。浸提所得粗液进行离心(5000r/min，15min)，得浸提上清液，70°C水浴5min。移液管移取2mL上清液置于试管中，加1.0mL脲酶提取液，摇匀，室温放置Ih后加入4ml柠檬酸盐缓冲液(pH为6.7)及ImL0.025g/mL的尿素溶液，同时以不加尿素的为对照组，用蒸馏水定容到20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色、定容。Ih内在分光光度计上于波长578nm处比色。从而确定抑酶作用最佳料液比。
[0039]由图3可知，女贞叶中抑制脲酶成分的抑制率随着液料比的增加而增大，但达I: 20后，几乎没有太大的变化。这是因为料液比达1:20时，基本上能将有效物质溶出，再增大液料比时，萃取效果不明显，也可能会增大有效成分与空气接触的机会，因氧化而失活，同时考虑到乙醇用量太大，溶剂消耗增大，而且还会使得后续浓缩分离操作繁琐，浪费时间和资源，因此最佳料液比确定为1:20。选择1:10、1:15、1:20作为正交实验的三水平。
[0040]3、不同微波辅助提取时间对脲酶抑制物提取的影响
[0041]精确称取10份女贞叶粉末，每份1.5g，分两组，每个料液比处理2瓶，微波功率设为231W，用60%乙醇浸提 ，以料液比1:20投料，在微波辅助下提取不同的时间(lmin、2min、3min、4min、5min),再进行水提,水提温度60°C,时间30min,每隔IOmin轻轻摇匀。浸提所得粗液进行离心(5000r/min，15min)，得浸提上清液，70°C水浴5min。移液管移取2mL上清液置于试管中，加1.0mL脲酶提取液,摇匀,室温放置Ih后加入4mL柠檬酸盐缓冲液(pH为
6.7)及ImL0.025g/mL的尿素溶液，同时以不加尿素的为对照组，用蒸懼水定容到20mL,再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色、定容。Ih内在分光光度计上于波长578nm处比色。从而确定抑酶作用最佳提取时间。
[0042]由图4可知，女贞叶中抑制脲酶成分的抑制率随着微波提取时间的增加，变化幅度很小。微波提取达2min时，抑制率达到最大值。当提取时间太短时，浸提可能不充分，抑制脲酶成分的含量较少。超过2min时，抑制率反而减小，可能是因为随着提取时间的延长抑制脲酶的活性成分被氧化的较多，结构受到破坏；虽然提取充分，但杂质增多；也可能因为提取时间到一定程度后会导致纤维结构网络松散紊乱使得物质成分进入显微结构中而不易被浸提出，因此选择2min为最佳提取时间，选择lmin、2min、3min作为正交实验的三水平。
[0043]4、不同乙醇浓度对脲酶抑制物提取的影响
[0044]精确称取10份女贞叶粉末，每份1.5g，分两组，每个料液比处理2瓶，微波功率设为231W，以料液比1:20投料，用不同浓度(20%、40%、60%、80%)的的乙醇在微波辅助条件下提取2min，再进行水提，水提温度60°C，时间30min，每隔IOmin轻轻摇匀。浸提所得粗液进行离心(5000r/min，15min)，得浸提上清液，70°C水浴5min。移液管移取2mL上清液置于试管中，加1.0mL脲酶提取液，摇匀，室温放置Ih后加入4mL柠檬酸盐缓冲液(pH为6.7)及ImL0.025g/mL的尿素溶液，同时以不加尿素的为对照组，用蒸懼水定容到20mL,再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色、定容。Ih内在分光光度计上于波长578nm处比色。从而确定抑酶作用最佳的乙醇浓度。
[0045]由图5可知在乙醇浓度不超过60%时，随着乙醇浓度增大，抑制率不断增大，即抑制脲酶成分含量在不断增加。当乙醇浓度达60%时，抑制率明显下降。在乙醇浓度为60%时抑制率最大，即女贞叶中抑制脲酶成分得率最高。由此可以看出，乙醇的体积分数不宜过高或过低，乙醇浓度低于60%时，提取液中的杂质含量较高，提取液粘度较大，过滤、浓缩、分离较难，增加浓度有利于有效成分溶出。而乙醇浓度高于60%时，溶剂挥发过大，同时高浓度乙醇使细胞蛋白质凝固,妨碍乙醇向细胞内扩散。极性增大,会加大醇溶性杂质、色素以及亲脂性强的成分的溶出，这些成分与有效成分竞争同乙醇水分子结合，组织的通透性下降，从而导致有效成分溶解度下降。故选择60%乙醇作提取剂为宜，选定40%、60%、80%作为正交实验的三水平。
[0046]实施例2、女贞叶抑制脲酶活性成分提取工艺条件优化(正交试验)
[0047]1、实验原理
[0048]经单因素实验的结果分析，各因素间的影响程度差别很大，为探索各因素间的交互作用，设计正交实验进行研究。由单因素实验的结果，得到每个因素不同水平的前三名，如果做全面试验需34 = 81次试验，而用正交实验设计L9 (34)来做只要9次。
[0049]2、实验操作:
[0050]表1正交实验设计
【权利要求】
1.一种女贞叶中抑制脲酶成分的提取方法，其特征在于，包括以下步骤: A.女贞叶中脲酶抑制成分粗提 Al女贞叶脲酶抑制剂成分的超声波辅助提取 称取40g女贞叶粉末，加入800mL60%的乙醇溶液，进行微波辅助提取2min，微波功率为231W，再进行水提，水提温度60°C，时间30min，每隔IOmin轻轻摇匀，浸提所得粗液进行离心，转速为5000r/min，离心时间为15min，得浸提上清液； A2提取液减压浓缩、萃取 将乙醇提液于真空旋转蒸发仪中50°C减压浓缩至乙醇完全分离出，将浓缩液与正丁醇以体积比1:2进行萃取，每次萃取六小时，重复萃取2次，得正丁醇和水相；将水相与氯仿以体积比1:2进行萃取，每次萃取6小时，重复萃取2次，得氯仿相和水相；将水相与石油醚相以体积比I '2进行萃取，每次萃取六小时，重复萃取2次，得石油醚相和水相； B.女贞叶中脲酶抑制成分聚酰胺凝胶层析分离 BI准备上样液:将萃取得到的水相用旋转蒸发仪浓缩，温度为45°C — 55°C，浓缩至IOmL以下，备用； B2基质的处理:称取所需的聚酰胺凝胶，以95%的乙醇浸泡24小时，充分膨胀后用乙醇法装柱； B3装柱:将酒精浸泡好的基质约50ml，通过漏斗缓慢倒入柱中，边加边用木夹子轻敲柱子，同时用竹签轻轻压实，`流速控制在20滴/min，待装至25cm柱高； B4平衡:用95%乙醇洗柱，检查流出的乙醇液，待乙醇液与去离子水以1:3的体积比混合，振摇至不显白色浑浊，结束洗柱，用纯水将柱中树脂洗至无醇味后备用； B5上样与吸附:将A步骤准备的样液缓慢上柱，吸附20min，流速20滴/min，去离子水洗脱； B6洗脱:先用蒸馏水进行洗脱，将试管放在试管架上按序接收洗脱液，每管接收SmL洗脱液，每接收3管吸取少量试样进行生化检测试验；待水洗样液颜色很浅检测不出任何成分时，再依次用95%、80%、70%、60%、50%、40%的乙醇溶液洗脱，每管接收8mL洗脱液，每接收3管吸取少量试样进行生化检测试验；待洗脱样液颜色很浅检测不出任何成分时，结束洗脱； B7聚酰胺再生。
2.—种权利要求1所述的女贞叶中抑制脲酶成分的应用方法，其特征在于，水稻全生育期氮肥用尿素，分基肥、分蘖肥、长粗肥3次施用，各次比例为0.42:0.28:0.3，在各次施尿素2天后，施以3750g/hm2量的女贞叶中脲酶抑制成分，使用方法为将女贞叶中脲酶抑制成分溶解于水中再泼浇到稻田。
【文档编号】C05G3/08GK103601602SQ201310596731
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】邱业先, 汪金莲, 黄凯玲 申请人:苏州科技学院