一种促进马尾松组培继代芽生根方法
【专利摘要】本发明公开了一种促进马尾松组培继代芽生根方法，单个截取生长健壮、半木质化、2-3cm高的马尾松组培继代芽，采用不同的培养基以两步生根法，先接种在含有萘乙酸、吲哚丁酸、蔗糖的1/2改良MS培养基Ⅳ中，诱导处理不定根原基21-28d；然后转接至没有生长素，而是含有活性炭或抗坏血酸、蔗糖的1/2改良MS培养基Ⅴ中，促进不定根的表达与伸长；将已生根的再生植株移栽于泥炭土、蛭石和珍珠岩混合基质中培育，极大地促进和改善了继代芽生根情况，马尾松继代芽生根率达82.5%以上，最高生根率达90.6%，且根系质量较高，移栽成活率达85.1%以上，最高成活率达93.0%，具有较好的经济效益和社会效益。
【专利说明】一种促进马尾松组培继代芽生根方法
【技术领域】
[0001]本发明属植物繁殖【技术领域】，涉及组织培养育苗技术，尤其是一种促进马尾松组培继代芽生根方法。
【背景技术】 [0002]马尾松(Pinusmassonianan)原产我国，是我国南方重要的荒山绿化、造纸原料林和采脂林、自然风景林的重要树种之一，在我国分布范围极为广阔。作为一种综合利用价值高、推广潜力大的树种，马尾松不仅可用来生产三板、造纸及化纤工业制造，还可用来生产松香、松节油等工业原料。近年来，随着人们日益增长的生活需求与木材资源短缺和石油等不可再生资源逐渐枯竭等矛盾的激化，生态、经济和社会的可持续发展越来越受到社会关注。基于我国生态安生、资源安全与社会安全等问题，马尾松作为我国主要的工业用材树种和生物质能源树种之一，大力发展马尾松人工林很有必要。
[0003]我国自“六五”国家科技攻关以来，在马尾松良种选育和速生丰产栽培技术等方面取得了较大突破。目前，马尾松良种主要以种子园和母树林的有性繁殖为主。然而，有性繁殖存在着分化的问题，不能最大限度地提高遗传改良增益，而无性繁殖却能克服有性繁殖的上述不足。但马尾松的传统无性繁殖技术(扦插和嫁接)目前仍难满足造林的需求，制约了马尾松良种繁育的进程。现代林业发展讲究速生丰产、优质高效，植物组培技术的使用，是实现马尾松优良无性系苗木快速繁育的有效途径。
[0004]马尾松属组织培养生根较为困难的树种。以往众多学者研究表明，以初代培养的马尾松单芽进行生根通常能获得较为理想生根率，而经过继代以后，其单芽生根率明显偏低。如以马尾松成熟种子为外植体来源，吴小芹等(2009)和季孔庶等(2010)将经过丛芽诱导和伸长的初代培养后单芽直接进行生根，其生根率分别为85%和92.5% ;而薛鹰(2006)在经过继代培养以后取单芽生根，其生根率仅为26.7%。要实现马尾松组培苗工厂化生产，必须突破继代芽生根困难瓶颈因素。
【发明内容】
[0005]本发明的目的主要针对马尾松组培继代芽生根率低的现状，为实现马尾松组培苗规模化生产，提供一种促进马尾松组培继代芽生根方法。
[0006]本发明是这样实现的:
[0007]—种促进马尾松组培继代芽生根方法，包括丛芽诱导、丛芽伸长、继代培养、不定根诱导、不定根伸长、试管苗移栽的两步生根法，获得马尾松组培继代芽生根苗，其操作步骤如下:
[0008](I)丛芽诱导:将马尾松种子消毒后，在无菌条件下进行种子萌发，然后截取带
0.5cm长下胚轴的无菌苗顶芽为外植体，在诱导培养基I中进行丛芽诱导；
[0009](2)丛芽伸长:将诱导出的丛生芽在伸长培养基II中进行伸长培养；
[0010](3)继代培养:将单个切下伸长芽的顶芽接种到继代增殖培养基III中进行增殖，获得继代芽I ;将继代芽I重复步骤(2)进行伸长，单个切下伸长的继代芽I并分成顶芽和带侧芽芽段，然后在步骤(3)继代增殖培养基中继续增殖获得继代芽II，将继代芽II再重复步骤(2)和步骤(3)，获得新的增殖继代芽；重复循环步骤(2)和(3)，直至获得大量足够生根培养继代芽；
[0011](4)不定根诱导:单个切下生长健壮、半木质化、高2_3cm的继代芽，接种在含有萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、蔗糖的1/2改良MS培养基IV中，诱导处理不定根原基21-28d ；
[0012](5)不定根伸长:将具有肉眼可见不定根外植体转入含有活性炭(AC)或抗坏血酸(Vc)、蔗糖的1/2改良MS培养基V中，促进不定根的表达与伸长；
[0013](6)试管苗移栽:将已生根的再生植株移栽于泥炭土、蛭石和珍珠岩(I: I: I)混合基质中培育，喷水保湿。
[0014]以上所述的培养基I其原料含量为:6-BA 2.5-4.0mg.L'NAA 0.05-0.1mg.L'蔗糖30000mg.L'酸水解酪蛋白500mg.l-1和改良MS培养基。
[0015]以上所述的培养基II其原料含量为:NAA 0.25-0.4mg.l-1或活性炭3000-5000mg.l-1、蔗糖 30000mg.l-1 和改良 MS 培养基。
[0016]以上所述的培养基III其原料含量为:6-BA 1.0-3.0mg.L' KT 0-1.0mg.L' NAA0-0.3mg.L'蔗糖30000mg.l-1和改良MS培养基。
[001l-]以上所述的培养基IV其原料含量为=NAA 0.05-0.1mg.L' IBA 1.0-2.5mg.L'蔗糖1.0-2.0%和1/2改良MS培养基。
[0018]以上所述的培养基V其原料含量为:AC 3000-5000mg.L—1或Vc 10_30mg.L—1、蔗糖2.0%和1/2改良MS培养基。
[0019]以上所述的改良MS培养基的基本组成为:KN031650mg.l-1 ；NH4N03600mg.l-1 ；CaCl2 *2H20260mg.1l-1 ；MgS04.l-Η20 3l-0mg.1l-1 ；Ca(NO3)2.4Η20 400mg.1l-1 ；KH2PO41l-0mg.1l-1 ；MnSO4.H2022.3mg.L-1 ；ZnSO4.l-H208.6mg.L-1 ；CuSO4.5H200.025mg.L-1 ；H3B036.2mg.L-1 ；Na2MoO4.2H200.025mg.I/1 ；KI 0.83mg.L-1 ；CoCl2.6H200.025mg.L-1 ;维生素 B1L Omg.L-1 ；维生素 B60.5mg.L-1 ;烟酸 0.5mg.L-1 ;甘氨酸 2.0mg.L-1 ;肌醇 200mg.L'
[0020]以上所述的培育控制条件为:培养温度白天22_26°C，晚上16_20°C，光照1500-20001x，每日光照 16h。
[0021]本发明相对于现有的技术具有以下优点:
[0022]本发明的促进马尾松组培继代芽生根方法，选取生长健壮、半木质化及2-3cm高的马尾松组培继代芽，采用不同的培养基以两步生根法，先诱导处理21-28d天，然后转接至没有生长素，而是含有活性炭或抗坏血酸的培养基中，极大地促进和改善了继代芽生根情况。采用本生根方法，马尾松继代芽生根率达82.5%以上，最高生根率达90.6%，且根系质量较高，移栽成活率达85.1%以上，最高成活率达93.0%，具有较好的经济效益和社会效益。
【具体实施方式】
[0023]下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0024]实施例1
[0025]1、实验材料[0026]以马尾松当年成熟球果种子萌发无菌苗顶芽为外植体，球果采自广西宁明桐棉种源营建马尾松母树林中高产脂优良马尾松家系宁明3号。
[0027]2、实验方法
[0028](1)丛芽诱导
[0029]将无菌外植体接种到改良MS+6-BA3.0mg .L-1:+NAA 0.1mg *L-1鹿糖 30000mg *L-1+琼脂3500mg.L-1的培养基上进行诱导培养。培养26d后，平均丛芽诱导率达99.1%。
[0030]所述的改良MS培养基的基本组成为:KN031650mg.L-1 ；NH4N03600mg.L-1 ；CaCl2.2H20260mg.L-1 ；MgS04.7H20370mg.L-1 ；Ca (NO3)2.4H20400mg.L-1 ；KH2PO4170mg.L-1 ；MnSO4.H2022.3mg.L-1 ；ZnSO4.7H208.6mg.L-1 ；CuSO4.5H200.025mg.L-1 ；H3B036.2mg.L-1 ；Na2MoO4.2H200.025mg.L-1 ；KI 0.83mg.L-1 ；CoCl2.6H200.025mg.L-1 ;维生素 B1L Omg.L-1 ；维生素 B60.5mg.L-1 ;烟酸 0.5mg.L-1 ;甘氨酸 2.0mg.L-1 ;肌醇 200mg.L-1.
[0031](2)丛芽伸长
[0032]将诱导出的丛生小芽转接到改良MS+NAA 0.25mg.L—1+蔗糖30000mg.L—1+琼脂3500mg.L-1伸长培养基上，以促进培养物的伸长生长。伸长培养27d，丛芽高3_5cm。
[0033](3)继代芽培养
[0034]将丛生芽中株高2_3cm的单芽剪下，接种到改良MS培养基+6-BA 2.0mg.L-1+ΚΤ
1.0mg.L-1/1+NAA 0.2mg.L-1+ 蔗糖 30000mg.L-1+ 琼脂 3500mg.L-1 上进行继代芽增殖 23d。
[0035]将继代增殖芽放到步骤(2)伸长培养基上，以促进继代增殖芽伸长。伸长培养28d，继代增殖芽高3-5cm。将伸长继代芽分成2cm长顶芽及Icm长带侧芽芽段后，重复步骤(3)继代增殖和步骤(2)丛芽伸长。继代培养6次，平均增殖系数6.4，获得大批可供生根继代芽。
[0036](4)不定根诱导
[0037]单个切下生长健壮、半木质化、高2-3cm的继代芽，接种到1/2改良MS培养基+NAA0.1mg.L_1+IBA 2.5mg.L—1+鹿糖1.0%培养基中诱导不定根原基。诱导21d后,不定根诱导率达90.6%。
[0038](5)不定根伸长
[0039]将明显具有肉眼可见不定根外植体转入1/2改良MS培养基+AC 5000mg.L-1+蔗糖2.0%培养基中促进不定根表达与伸长，28d后统计不定根发生率，记录平均根数并观察根系质量(根茎之间愈伤组织发生情况)。具体数据见表1。
[0040](6)试管苗移栽
[0041]将再生植株根部琼脂洗净，移栽于泥炭土、蛭石和珍珠岩重量比为:1:1:1的混合基质中培育，喷水保湿，一个月后统计移栽成活率。具体数据见表1。
[0042]上述过程的培养条件温度:白天26°C，晚上20°C，光照20001x，每日光照16h。
[0043]实施例2
[0044]1、实验材料
[0045]以马尾松当年成熟球果种子萌发无菌苗顶芽为外植体，球果采自广西宁明桐棉种源营建马尾松母树林中高产脂优良马尾松家系宁明4号。
[0046]2、实验方法
[0047](1)丛芽诱导[0048]将无菌外植体接种到改良MS+6-BA4.0mg *L:+NAA 0.1mg *L k鹿糖 30000mg *L:+琼脂3500mg.1的培养基上进行诱导培养。培养26d后，平均丛芽诱导率达98.4%。
[0049]所述的改良MS培养基的基本组成同实施例1。
[0050](2)丛芽伸长
[0051]将诱导出的丛生小芽转接到改良MS+NAA 0.3mg.1+蔗糖30000mg.1+琼脂3500mg.1伸长培养基上，以促进培养物的伸长生长。伸长培养28d，丛芽高3_5cm。
[0052](3)继代芽培养[0053]将丛生芽中株高2-3cm的单芽剪下，接种到改良MS培养基+6-BA 2.5mg.'+ΚΤ
0.5mg.L-1+蔗糖30000mg.L-1+琼脂3500mg.L-1上进行继代芽增殖26d。
[0054]将继代增殖芽放到步骤(2)伸长培养基上，以促进继代增殖芽伸长。伸长培养25d，继代增殖芽高3-5cm。将伸长继代芽分成2cm长顶芽及Icm长带侧芽芽段后，重复步骤
(3)继代增殖和步骤(2)丛芽伸长。继代培养5次，平均增殖系数6.0。
[0055](4)不定根诱导
[0056]单个切下生长健壮、半木质化、高2-3cm的继代芽，接种到1/2改良MS培养基+NAA
0.1mg.'+ΙΒΑ 2.5mg.1+蔗糖1.0%培养基中诱导不定根原基。诱导22d后，不定根诱导率达89.8%。
[0057](5)不定根伸长
[0058]将明显具有肉眼可见不定根外植体转入1/2改良MS培养基+Vc IOmg.1+蔗糖
2.0%培养基中促进不定根表达与伸长，28d后统计不定根发生率，记录平均根数并观察根系质量(根茎之间愈伤组织发生情况)。具体数据见表1。
[0059](6)试管苗移栽
[0060]将再生植株根部琼脂洗净，移栽于泥炭土、蛭石和珍珠岩重量比为:1:1:1的混合基质中培育，喷水保湿，一个月后统计移栽成活率。具体数据见表1。
[0061]上述过程的培养条件温度:白天25°C，晚上20°C，光照20001x，每日光照16h。
[0062]实施例3
[0063]1、实验材料
[0064]以马尾松当年成熟球果种子萌发无菌苗顶芽为外植体，球果采自广西宁明桐棉种源营建马尾松母树林中高产脂优良马尾松家系宁明7号。
[0065]2、实验方法
[0066](I)丛芽诱导
[0067]将无菌外植体接种到改良MS+6-BA4.0mg *L:+NAA 0.1mg *L 工+鹿糖 30000mg *L:+琼脂3500mg.1的培养基上进行诱导培养。培养26d后，平均丛芽诱导率达99.0%。
[0068]所述的改良MS培养基的基本组成同实施例1。
[0069](2)丛芽伸长
[0070]将诱导出的丛生小芽转接到改良MS+AC 4000mg.L—1+蔗糖30000mg.L—1+琼脂3500mg.1伸长培养基上，以促进培养物的伸长生长。伸长培养28d，丛芽高3_5cm。
[0071](3)继代芽培养
[0072]将丛生芽中株高2_3cm的单芽剪下，接种到改良MS培养基+6_BA
2.5mg.L_1+KT0.5mg.L-1+NAA 0.25mg.L-1+ 蔗糖 30000mg.L-1+ 琼脂 3500mg.L-1 上进行继代芽增殖26d。
[0073]将继代增殖芽放到步骤(2)伸长培养基上，以促进继代增殖芽伸长。伸长培养25d，继代增殖芽高3-5cm。将伸长继代芽分成2cm长顶芽及Icm长带侧芽芽段后，重复步骤
(3)继代增殖和步骤(2)丛芽伸长。继代培养5次，平均增殖系数6.6。
[0074](4)不定根诱导
[0075]单个切下生长健壮、半木质化、高2-3cm的继代芽，接种到1/2改良MS培养基+NAA
0.05mg.L-1'+ΙΒΑ 1.0mg.L-1+蔗糖2.0%培养基中诱导不定根原基。诱导25d后，不定根诱导率达82.5%0
[0076](5)不定根伸长
[0077]将明显具有肉眼可见不定根外植体转入1/2改良MS培养基+AC 3500mg.L-1+蔗糖2.0%培养基中促进不定根表达与伸长，28d后统计不定根发生率，记录平均根数并观察根系质量(根茎之间愈伤组织发生情况)。具体数据见表1。
[0078](6)试管苗移栽
[0079]将再生植株根部琼脂洗净，移栽于泥炭土、蛭石和珍珠岩重量比为:1:1:1的混合基质中培育，喷水保湿，一个月后统计移栽成活率。具体数据见表1。
[0080]上述过程的培养条件温度:白天26°C，晚上19°C，光照20001x，每日光照16h。
[0081]以上实施例1至3中马尾松组培继代芽生根及移栽成活情况，详见表1所示。
[0082]表1马尾松组培继代芽生根及移栽成活情况
[0083]
【权利要求】
1.一种促进马尾松组培继代芽生根方法，其特征在于:包括丛芽诱导、丛芽伸长、继代培养、不定根诱导、不定根伸长、试管苗移栽的两步生根法，获得马尾松组培继代芽生根苗，其操作步骤如下: (1)丛芽诱导:将马尾松种子消毒后，在无菌条件下进行种子萌发，然后截取带0.5 Cm长下胚轴的无菌苗顶芽为外植体，在诱导培养基I中进行丛芽诱导； (2)丛芽伸长:将诱导出的丛生芽在伸长培养基II中进行伸长培养； (3)继代培养:将单个切下伸长芽的顶芽接种到继代增殖培养基III中进行增殖，获得继代芽I ;将继代芽1重复步骤(2)进行伸长，单个切下伸长的继代芽I并分成顶芽和带侧芽芽段，然后在步骤(3)继代增殖培养基中继续增殖获得继代芽II，将继代芽II再重复步骤(2)和步骤(3)，获得新的增殖继代芽；重复循环步骤(2)和(3)，直至获得大量足够生根培养继代芽； (4)不定根诱导:单个切下生长健壮、半木质化、高2-3cm的继代芽，接种在含有萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、蔗糖的1/2改良MS培养基IV中，诱导处理不定根原基21-28 d ； (5)不定根伸长:将具有肉眼可见不定根外植体转入含有活性炭(AC)或抗坏血酸(Vc)、蔗糖的1/2改良MS培养基V中，促进不定根的表达与伸长； (6)试管苗移栽:将已生根的再生植株移栽于泥炭土、蛭石和珍珠岩(I: I: I)混合基质中培育，喷水保湿。
2.根据权利要求1所述的一种促进马尾松组培继代芽生根方法，其特征在于:所述的培养基 1 其原料含量为:6-BA 2.5-4.0 mg.L'NAA 0.05-0.1 mg.L'蔗糖 30000 mg.L'酸水解酪蛋白500 mg.L-1和改良MS培养基。
3.根据权利要求1所述的一种促进马尾松组培继代芽生根方法，其特征在于:所述的培养基II其原料含量为=NAA 0.25-0.4 mg.L-1或活性炭3000-5000 mg.L-1、蔗糖30000mg.L-1和改良MS培养基。
4.根据权利要求1所述的一种促进马尾松组培继代芽生根方法，其特征在于:所述的培养基III其原料含量为:6-BA 1.0-3.0 mg.L—1、KT 0-1.0 mg.L—1、NAA 0-0.3 mg.L—1、蔗糖30000 mg.L-1和改良MS培养基。
5.根据权利要求1所述的一种促进马尾松组培继代芽生根方法，其特征在于:所述的培养基IV其原料含量为=NAA 0.05-0.1 mg.L'lBA 1.0-2.5 mg.171、蔗糖 1.0-2.0%和 1/2改良MS培养基。
6.根据权利要求1所述的一种促进马尾松组培继代芽生根方法，其特征在于:所述的培养基V其原料含量为=AC 3000-5000 mg.L-1或Vc 10-30 mg.L'蔗糖2.0%和1/2改良MS培养基。
7.根据权利要求1所述的一种促进马尾松组培继代芽生根方法，其特征在于:所述的改良 MS 培养基的基本组成为:ΚΝ03 1650 mg.L-1 ；NH4NO3 600 mg.L-1 ；CaCl2.2H20 260mg.171 ；MgS04.7Η20 370 mg.1/1 ;Ca (NO3)2.4Η20 400 mg.171 ；KH2PO4 170 mg.171 ；MnSO4.Η2022.3 mg.L-1 ；ZnSO4.7H20 8.6 mg.L-1 ；CuSO4.5H20 0.025 mg.L-1 ；H3BO3 6.2 mg.L-1 ；Na2MoO4.2H20 0.025 mg.L-1 ；KI 0.83 mg.L-1 ；CoCl2.6H20 0.025 mg.L-1 ;维生素 B1 1.0mg.I71 ;维生素 B6 0.5 mg.I71 ;烟酸 0.5 mg.I71 ;甘氨酸 2.0 mg.I71 ;肌醇 200 mg.L'
8.根据权利要求1所述的一种促进马尾松组培继代芽生根方法，其特征在于:所述的培育控制条件为:培养温度白天22-26°C，晚上16-20°C，光照1500-2000 lx，每日光照16h0`
【文档编号】A01H4/00GK103609450SQ201310617394
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】姚瑞玲, 吴幼媚, 蔡玲 申请人:广西壮族自治区林业科学研究院