生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法

生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法
【专利摘要】本发明涉及转基因动物领域，具体而言，涉及生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法。其用荧光蛋白表达载体转染五指山猪体细胞，生产表达红色荧光蛋白的转基因五指山猪。由于五指山猪的基因序列与人类相近度在90%以上，其血型类似人类O型血，血液生理生化指标、各组织脏器对药物的代谢等特征均与人类相似，则其细胞、组织或器官的移植得到了推广应用，广泛应用于药学、畜牧、兽医学，尤其应用于人类比较医学的各种试验中。尤其为人类器官移植的研究及各类动物模型培育、人源化猪器官移植开发应用研究提供科学依据。
【专利说明】生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及转基因动物领域，具体而言，涉及生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法。
【背景技术】
[0002]随着细胞、组织和器官移植应用的增多，能够提供可供移植的细胞、组织和器官的动物和方法得到了广泛的关注和研究。其中，利用遗传工程获得转基因动物，尤其是能够表达荧光的转基因猪得到了广泛的研究，近年来，带有不同荧光基因的转基因猪不断被研制成功。
[0003]相关技术中，通过将荧光蛋白基因转入到猪体内，使转基因猪的全身表达荧光蛋白。使用该转基因猪的能够表达荧光的细胞、组织或器官进行移植时，可以根据荧光对移植后的细胞、组织或器官进行监视和追踪。
[0004]但是，相关技术中生产转基因猪的受体由于其基因序列与人类相近度低，因此，其细胞、组织或器官的移植应用受到了一定的限制。

【发明内容】

[0005]本发明的目的在于提供生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法，以解决上述的问题。
[0006]在本发明的实施例中提供了生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法，用荧光蛋白表达载体转染五指山猪体细胞，生产表达红色荧光蛋白的转基因五指山猪。
[0007]本发明实施例提供的生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法，与现有技术中的转基因猪相比，其选用五指山猪，通过将荧光蛋白基因导入到其体内，生产全身能够表达荧光蛋白的转基因五指山猪。由于五指山猪的基因序列与人类相近度在90%以上，其血型类似人类O型血，血液生理生化指标、各组织脏器对药物的代谢等特征均与人类相似，则其细胞、组织或器官的移植得到了推广应用，广泛应用于药学、畜牧、兽医学，尤其应用于人类比较医学的各种试验中。尤其为人类器官移植的研究及各类动物模型培育、人源化猪器官移植开发应用研究提供了科学依据。
【专利附图】

【附图说明】
[0008]图1示出了生产表达红色荧光蛋白的转基因五指山猪的方法流程；
[0009]图2示出了经G418筛选15d后得到的转基因细胞稳定表达的红色荧光；
[0010]图3示出了转基因细胞的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
[0011]图4示出了重构卵细胞体外培养时的卵裂情况和囊胚胎发育情况。
【具体实施方式】
[0012]下面通过具体的实施例并结合附图对本发明做进一步的详细描述。[0013]本发明实施例提供的生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法，可以采用如下步骤进行操作:
[0014]步骤一，获得可转染的五指山猪体细胞。
[0015]五指山猪，主产于海南省五指山区，是中国著名的小型猪种之一。具有体型小、性成熟早、遗传稳定、适应性强等诸多特性，是一种非常适合进行实验的动物模型。
[0016]而且五指山猪的基因序列与人类相近在90%以上，其血型类似人类O型血，血液生理生化指标、各组织脏器对药物的代谢等特征均与人类相似。上述特性决定了五指山猪非常适合于人类细胞、组织或器官移植的研究，为人源化猪器官移植开发应用研究提供了资源。
[0017]本发明实施例提供的生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法，其中，可转染的五指山猪细胞可以选用五指山猪的耳皮细胞为体细胞，相对于胎儿细胞获得更加容易。
[0018]由于五指山猪耳成纤维细胞取材方便，操作简单，本发明实施例中，优选五指山猪的耳成纤维细胞。
[0019]参见图1，步骤二，用抗性荧光蛋白表达载体转染上述五指山猪体细胞。
[0020]荧光蛋白可以用来标记细胞，利用荧光蛋白标记细胞这种方法在监视移植细胞和组织上非常有效。用荧光蛋白标记的细胞进行移植后，可以对其进行监视和追踪，从而可以实时观察细胞的生长、转移、血管生成及药物疗效等。例如荧光蛋白标记的细胞在研究和治疗癌症中的应用。
[0021]按照本领域的常规方法，制备荧光蛋白的表达载体，并将抗性基因插入到上述荧光蛋白的表达载体中，形成抗性荧光蛋白表达载体，有利于后续在选择性培养基中进行阳性克隆的转基因体细胞的筛选操作。
[0022]用抗性荧光蛋白表达载体转染上述得到的五指山猪体细胞。转染操作之前，对可转染的五指山猪体细胞进行培养。
[0023]使用培养中的五指山猪体细胞进行转染实验，由于正在生长繁殖中的五指山猪体细胞处于活跃的状态，因此，其代谢活性强，进行转染时，载体进入细胞的速度以及与载体的结合速度等都比较快，有助于转染的进行。同时，在培养过程中，控制细胞生长的汇合度为75%~85%时，将其用PBS清洗I次后更换无血清培养基待用，从而进一步提高转染的速度以及成功的转染率。
[0024]本发明实施例中，转染的方法选自:FuGENE HD试剂转染，Lipofectamine TM2000试剂转染或Nucleofector TM转染。
[0025]其中，FuGENE HD试剂转染法可以具体按照如下步骤进行操作:按照FuGENE HD试剂转染说明书进行，首先用opt1-MEM清洗细胞2次，在培养细胞用的6孔培养板中的每孔加1.5mL opt1-MEM于待转染细胞中，放入培养箱中备用。取6个灭菌L 5mL Eppendorf管，分别加入100 μ L opt1-MEM和2.Ομ g pCX-mRFPl手指弹匀，再分别添加3、4、5、6、7、8 μ LFuGENE HD试剂漩涡混合充分，室温放置40min后形成FuGENE HD与DNA复合物，加入到准备好细胞板中，38.5°C培养，6~8 h后换为10%FBS+90%DMEM培养液继续培养，48h后评价转染效率。
[0026]LipofectamineTM2000试剂转染可以具体按照如下步骤进行操作:按照脂质体转染说明书进行，取12个1.5mL Eppendorf管加250 μ L Opt1-MEM培养液，前6个分别加4μ g pCX-mRFPl，后 6 个分别加入 4、6、8、10、12 和 14 μ L LipofectamineTM2000 脂质体，静置5min，两组液体轻轻混匀后室温放置30min，然后加至准备好WMP培养液中，38.5°C培养，6-8 h后换为10%FBS+90%DMEM培养液继续培养，48h后评价转染效率。
[0027]Nucleofector TM转染可以具体按照如下步骤进行操作:使用AmaxaTM BasicNucleofector TM Kit Primary Fibroblasts试剂盒，按照说明书加入电转液及2 μ g pCX-mRFPI质粒，混合后移入Amaxa电转杯，将小杯放入Nucleofector TM转染仪中，选择成纤维细胞转染程序A-024、T-016、U-012、U-023、V-013电转，取出小杯用500 μ L10%FBS+90%DMEM培养基冲洗后移入6孔板一孔中培养，48h后评价转染效率。
[0028]上述三种转染方法，技术成熟，转染效率高，是本领域的常用转染方法。
[0029]转染操作之后，对其转染效率进行评价，其中，转染效率的评价可以按照本领域的常规方法进行操作。本发明实施例中，转染效率可以采用如下方法进行评价:
[0030]将转染细胞放在激发波长为520_550nm荧光显微镜下观察红色荧光的表达，以放大200倍显微镜视野为标准，转染4次，统计5个显微镜视野表达红色荧光细胞数，计算其占转染细胞数的比率，以此比率来评价转染效率。
[0031]根据上述转染效率的评价方法，转染48h后评价转染效率，选择转染效率最高的细胞作为筛选能够稳定表达红色荧光蛋白的转基因体细胞。
[0032]本发明实施例中，优选Nucleofector TM转染法，且其条件为:2X106，红色荧光蛋白表达载体的添加量为:2ug，转染程序为:U-023电转。在该优化的转染条件下，转染效率可达到83.33%。而采用LFuGENE HD试剂转染和LipofectamineTM2000试剂转染法时，转染效率最高可达65%和9.70%。因此，本发明实施例中优选使用Nucleofector TM转染法，将在上述转染条件下进行转染获得的细胞作为筛选能够稳定表达红色荧光蛋白的转基因体细胞，进行后续的能够稳定表达红色荧光蛋白的转基因体细胞的筛选操作。
[0033]步骤三，筛选能够稳定表达荧光蛋白的转基因体细胞。
[0034]使用选择性培养基筛选阳性克隆细胞。为了能够选择能够稳定表达荧光蛋白的转基因体细胞，本发明实施例中，用选择性培养基连续筛选15d。筛选时间短，可能不能获得能稳定表达荧光蛋白的五指山猪转基因体细胞，本发明实施例中，选择连续筛选15d，足以获得纯的、能稳定表达荧光蛋白的五指山猪转基因体细胞。
[0035]步骤四，用上述转基因体细胞作为供体，培养成熟的去核的猪卵母细胞作为受体，采用体细胞核移植的方法获得转基因五指山猪重构卵细胞。
[0036]经过卵母细胞体外成熟培养并去核操作之后，采用转基因体细胞核移植方法，将转基因体细胞移植到培养成熟的去核的五指山猪卵母细胞中，并对其进行融合与激活，获得转基因五指山猪重构胚胎。
[0037]选择培养成熟的去核的五指山猪卵母细胞作为受体，与供体结合后，能够形成重构胚胎，从而重构胚胎发育后，可以获得全身的细胞、组织和器官都能表达红色荧光的转基因五指山猪，从而其任何的细胞、组织和器官都能够用于移植应用。
[0038]步骤五，将上述重构胚胎进行体外培养后，移植到代孕的五指山猪体内，上述猪分娩后，得到表达荧光蛋白的转基因五指山猪。
[0039]上述得到的克隆仔猪，通过一系列分子生物学检测，选出带有红色荧光蛋白基因的转基因猪并将其扩繁，生产红色荧光蛋白的五指山猪。[0040]利用上述红色荧光的五指山猪，与普通的非转基因五指山猪杂交，得到杂合的五指山猪，其中有一些为红色荧光阳性。
[0041]上述结果说明采用本发明实施例提供的方法能够生产能够稳定遗传的红色荧光五指山猪。
[0042]利用本发明实施例提供的生产表达红色荧光蛋白的转基因五指山猪的方法生产的转基因五指山猪，在自然光下全身发红，在紫外灯下表现强烈的红色荧光；解剖后各脏器在紫外灯下都表现强烈的红色荧光。
[0043]因此，上述红色荧光转基因五指山猪为追踪猪组织、细胞和器官在受者体内存活和机能状况提供了重要标识，其将成为异种移植研发的理想动物模型，并将为人类器官移植的研究及各类动物模型培育、人源化猪器官移植开发应用研究提供科学依据。
[0044]实施例:生广表达红色突光蛋白的转基因五指山猪的方法
[0045]本发明提供的生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法，可以用于生产表达红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白等多种荧光蛋白的转基因五指山猪。本发明实施例中采用生产表达红色荧光蛋白的转基因五指山猪的方法。
[0046]步骤一，获得可转染的五指山猪的耳成纤维细胞，具体可以按照如下方法进行操作:
[0047]通过无菌操作取供体猪的耳部组织，采用常规组织块接种培养，获得五指山猪的耳成纤维细胞。
[0048]用眼科剪剪掉猪耳部周围的皮毛，用75%的酒精充分清洗消毒，无菌条件下剪取耳部皮肤，置于含有双抗的PBS中，用镊子将猪多于耳毛拔掉，并用手术刀片背面将耳部多于脂肪刮掉，反复漂洗3-5次，直到漂洗液清亮透明为止，移至培养皿中，用眼科剪将其剪成0.5-lmm3大小的组织块，放于DMEM培养基(Gibco)包含0.25%胰蛋白酶中，在38.5°C的C02培养箱中消化4分钟，取出后加入含血清的DMEM培养基终止消化，用吸管将组织块转移至15ml离心管内，1500rmp离心10分钟，离心后去掉上清液，加入新鲜DMEM培养基(Gibco)添加20%胎牛血清(FBS，Gibco)重悬，移入38.5°C预温的新鲜DMEM培养基添加20%胎牛血清约3ml，用无菌吸管将组织块转移至处理过的专用培养皿中，并均匀铺开在培养皿中，每小块间距5mm左右，将培养皿置于在38.5°C, C02培养箱进行培养，每日在观察细胞形态和生长情况，当细胞长出后，将其转入培养瓶中继续培养。细胞在体外经3-5次传代后用于细胞转染实验。
[0049]步骤二,抗性单体红色突光蛋白表达载体pCX-mRFPl-pgk-neo的构建
[0050]本发明实施例中，优选红色荧光蛋白表达载体。
[0051]红色荧光蛋白简称RFP，其基因所产生的蛋白质，在紫外波长范围的光线激发下，会发出现红色荧光。由于具有自发荧光等特征，在分子生物学和细胞生物学领域得到广泛应用。RFP作为为一种报告分子，在检测蛋白表达、蛋白和细胞荧光示踪、研究蛋白质之间相互作用和构象变化中，起到了重要作用。
[0052]本发明实施例中的红色荧光蛋白优选采用单体红色荧光蛋白(mRFPl)。该单体红色荧光蛋白能够快速成熟，且其激发与发射波长长。克服了红色荧光蛋白(DsRed)成熟缓慢，在体内形成四聚体，组织分布不均等缺点。
[0053]本发明实施例中，更优选具有抗性基因的单体红色荧光蛋白表达载体。该载体中增加了抗性基因，有利于后续在选择性培养基中进行阳性克隆的转基因体细胞的筛选操作。
[0054]本发明实施例中，具有抗性基因的单体红色荧光蛋白表达载体pCX-mRFPl-pgk-neo的构建具体可以按照如下方法进行制备:
[0055]从市售的模板质粒PGKneotpAlox2中扩增磷酸激酶启动子的新霉素抗性基因(pgk-neoR)片段(1321bp)，然后将该抗性基因片段从SalI位点插入到单体红色荧光蛋白的表达载体PCX-mRFPl (该载体由吴晓辉博士提供，发育生物学和分子医学研究所，复旦大学，中国上海)中，得到具有抗性的能够表达单体红色荧光蛋白的载体pCX-mRFPl-pgk-neo。如本领域技术人员可以想到的，得到pCX-mRFPl-pgk-neo载体后,采用本领域的常规技术手段进行酶切鉴定，并对目的条带进行扩繁用于后续的五指山猪体细胞的转染。
[0056]步骤三，对可转染的五指山猪耳成纤维细胞进行处理，具体按照如下方法进行:将将I~2X IO5个五指山猪耳成纤维细胞接种到6孔培养板中培养，待细胞长到75%~85%汇合度时，将其用PBS清洗I次后更换无血清培养基待用。
[0057]步骤四，用pCX-mRFPl-pgk-neo转染上述步骤三种得到的五指山猪耳成纤维细胞，可以按照如下方法进行操作:
[0058]本发明实施例中，为了能够筛选出阳性克隆细胞，向细胞培养基中加入G418，形成选择性培养基。由于本发明实施例中，能够表达单体红色荧光蛋白的载体pCX-mRFPl-pgk-neo中具有抗性基因，因此，凡是阳性克隆都能在上述选择性培养基中生长。
[0059]为了能够选择能够稳定表达红色荧光蛋白的转基因体细胞，本发明实施例中，分别用浓度为100、150、200、250、300和400 μ g.mL_1的G418连续筛选15d。结果发现，G418的浓度为200μ g.ml/1，筛选15d时，可以获得纯的、能稳定表达单体红色荧光蛋白的猪耳成纤维细胞，如图2所示，其中，A表示在普通光学显微镜下的成像结果(放大倍数为100)；B表示在荧光显微镜下的成像结果(放大倍数为100)。从图中可以看出，采用上述方法，获得了纯的、能稳定表达单体红色荧光蛋白的猪耳成纤维细胞。
[0060]实验结果显示,浓度为200 μ g.ml/1的G418对转基因细胞的毒性最小。
[0061]利用QIAGEN公司提供的试剂盒对上述转基因细胞进行PCR扩大培养，并提取扩大培养后的转基因细胞总基因组DNA，对其进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图3所示。其中，P表示质粒pCX-mRFPl,作为阳性对照；N表示阴性对照；M表示Mark ;胃表示转基因细胞,大小为711bp。从图中可以看出:采用上述方法，成功得到了 PCR扩增培养后的转基因细胞。
[0062]其中，PCR扩大培养条件为:
[0063]上游引物:5'ATTCTCGAGATGGCCTCCTCCA3'；
[0064]下游引物:5'AATGGATCCTTAGGCGCCGGTG3'；
[0065]预计扩增产物大小为71 Ibp ；
[0066]PCR 反应条件:94°C预变性 4min，98°C变性 10s, 56°C退火 30s, 72°C延伸 lmin，30循环，72 °C再延伸5min。 [0067]步骤五，获得体外成熟培养的普通猪卵母细胞:
[0068]取初情期前青年母猪卵巢，用吸卵泵抽吸卵巢上直径为3~8mm卵泡。挑选卵丘包裹3层以上、致密且胞质均匀卵丘细胞-卵母细胞复合体(CumuLus-oocyte-complexes, COCs),用TALP液洗漆3遍,放在卵母细胞体外成熟培养液(IVM液)中，在38.5°C、5%饱和湿度的CO2培养箱中培养38h后，移入含0.1 %透明质酸酶中，用直径为170~180μ m的剥卵针，反复吹吸卵母细胞脱去卵丘细胞，挑选卵周隙明显，卵细胞完整，且排出第一极体的卵母细胞备用。[0069]其中，IVM培养液成分为:TCM-199添加10%猪卵泡液(pFF)、0.6mmol.L^1L-半胱氨酸、IOIU.mL—1人绒毛膜促性腺激素(hCG)、10IU.mL—1孕马血清促性腺激素(PMSG)和IOng.mL—1表皮生长因子(EGF)。22h后更换无激素IVM液。
[0070]步骤六，转基因体细胞核移植:
[0071]按照已经报道的去核方法(HyunS，Lee G, Kim D, et al.Production of nucleartransfer-derived piglets using porcine fetal fibroblasts transfected with theenhanced green fluorescent protein [J].Biol.Reprod.2003, 69, 1060-1068.),选取上述受体卵母细胞在含有0.4ug.ml/1的秋水酰胺(Demecolcine)和0.05mol.L-1的鹿糖培养液中处理Ih后，移入含5mg *mL_1的细胞松弛素b (CB)和0.4mg *mL_1的Demecolcine操作液中。在显微操作系统(1X71，Olympus, Japan)下,利用去核针先去除卵母细胞第一极体及突起处的细胞核，然后在注核液中用注入针将体细胞从去核切口放入卵黄间隙，得到重构卵细胞。
[0072]步骤七，重构胚胎的融合与激活:
[0073]将重构卵在融合液(0.28mmol.L-1甘露醇+0.1m mo I.T1MgCl2)中平衡后，放入铺满融合液的融合槽内，用玻璃针使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，再用融合仪(LF301)，施加I次2kV.cm^\20y s直流电脉冲进行融合。融合后重构卵在含有0.4mg.mL 1的demecolcine培养液中培养Ih后，在激活液(0.28mmol.L 1甘露醇+0.1mmo1.L-1MgCV0.1mmol.1^Ca2—)中给予一次1.5kV.CnT1UOOy s直流电脉冲进行激活，然后在含有2mmol.L—1的6-DMAP培养液中培养4h，得到融合的重构胚胎。
[0074]步骤八，重构胚胎的体外培养:
[0075]将融合的重构胚胎于NCSU-37培养液中，38°C，5%饱和湿度的C02培养箱中培养，以重构卵细胞构建当天为第O天，对重构卵细胞培养7~8d后，在第38小时和第7天时分别观察卵裂情况和囊胚胎发育情况并记录，结果如图4所示，其中，A为光学显微镜下卵裂图；B为荧光显微镜下卵裂图；C为光学显微镜下囊胚发育图；D为荧光显微镜下囊胚发育图。从图中可以看出:重构胚胎的卵裂和囊胚胎发育情况均良好。
[0076]步骤九，胚胎移植:
[0077]以发情周期正常生殖器官无疾病的大白猪作为受体，注射1000IU孕马血清促性腺激素(PMSG) 72h后，对肌肉注射1000IU人绒毛膜促性腺激素(hCG)进行诱导发情，在注射hCG后48h，用手术法将培养I~3d卵裂正常的I~8细胞期的胚胎移植到代孕母猪输卵管内。胚胎移植一个月以后，用超声波诊断仪检测代孕母体是否妊娠，妊娠个体分离饲养管理，诱导分娩，得到4头表达红色荧光蛋白的五指山克隆仔猪。
[0078]上述克隆仔猪，通过一系列分子生物学检测，选出2头带有红色荧光蛋白基因的转基因猪并将其扩繁，生产红色荧光蛋白的五指山猪。
[0079]利用上述2头红色荧光的五指山猪，与普通的非转基因五指山猪杂交，生下11头杂合的五指山小型猪，3头为红色荧光阳性。[0080]上述结果说明采用本发明实施例提供的方法能够生产能够稳定遗传的红色荧光五指山猪。
[0081]利用本发明实施例提供的生产表达红色荧光蛋白的转基因五指山猪的方法生产的转基因五指山猪，在自然光下全身发红，在紫外灯下表现强烈的红色荧光；解剖后各脏器在紫外灯下都表现强烈的红色荧光。
[0082]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均 应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法，其特征在于，用荧光蛋白表达载体转染五指山猪体细胞，生产表达红色荧光蛋白的转基因五指山猪。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括: 获得可转染的五指山猪体细胞； 用抗性荧光蛋白表达载体转染上述五指山猪体细胞； 筛选能够稳定表达荧光蛋白的转基因体细胞； 用上述转基因体细胞作为供体，去核的体外培养成熟的猪卵母细胞作为受体，采用体细胞核移植的方法获得转基因五指山猪重构胚胎； 将上述重构胚胎进行体外培养后，移植到代孕的大白猪体内，上述猪分娩后，得到表达突光蛋白的转基因五指山猪。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光蛋白表达载体为红色荧光蛋白表达载体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述红色荧光蛋白表达载体为单体红色荧光蛋白表达载体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述单体红色荧光蛋白表达载体包含有磷酸激酶启动子的新霉素抗性基因片段。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述转染的方法为NucleofectorTM转染法，其条件为:所述五指山猪体细胞的个数为:2X106，红色荧光蛋白表达载体的添加量为:2ug，转染程序为:U-023电转。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述转染之后，所述筛选能够稳定表达红色荧光蛋白的转基因体细胞之前，还包括下列步骤: 对转染的效率进行评价； 所述筛选能够稳定表达红色荧光蛋白的转基因体细胞的步骤具体为:选择转染效率最高的五指山猪体细胞筛选能够稳定表达红色荧光蛋白的转基因体细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述对转染的效率进行评价的方法具体为:将转染细胞放在激发波长为520~550nm荧光显微镜下观察红色荧光的表达，以放大200倍显微镜视野为标准，转染4次，统计5个显微镜视野表达红色荧光细胞数，计算其占转染细胞数的比率，以此比率评价转染的效率。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述五指山猪体细胞为五指山猪的耳成纤维细胞。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述筛选能够稳定表达荧光蛋白的转基因体细胞为用选择性培养基连续筛选15d。
【文档编号】A01K67/027GK103642837SQ201310631272
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月2日 优先权日:2013年12月2日
【发明者】尹熙俊, 康锦丹, 李所, 崔成哲, 王晓明, 李秀元 申请人:尹熙俊