一种产acc酶活性促生菌sc-12及其在促进植物生长中应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种产ACC酶活性促生菌SC-12及其在促进植物生长中应用；菌株SC-12分离自江苏省如东县沿海滩涂植物根际土壤中，经鉴定为同温层芽孢杆菌（Bacillus?stratosphericus），保藏号为CGMCC?No.7622；该菌在以ACC为唯一氮源条件下，其ACC脱氨酶活性为23.57μmolα-丁酮酸.mg-1pro.h-1。另外，SC-12菌株还具有产生吲哚乙酸(IAA)、耐盐以及溶磷的特性，同时该菌对酸碱具有良好的适应性。耐盐条件下，菌剂SC-12能显著促进辣椒、番茄发芽率和芽长。田间试验结果表明，利用SC-12菌株研制的促生菌肥能够显著提高番茄生物量和产量。
【专利说明】—种产ACC酶活性促生菌SC-12及其在促进植物生长中应用
【技术领域】
[0001]本发明属于农业集约化生产【技术领域】，尤其涉及一种SC-12菌株在促进大棚逆境环境中辣椒、番茄等茄果类蔬菜的生长。
【背景技术】
[0002]由于设施栽培(主要是塑料大棚、日光温室和地膜覆盖技术)在我国蔬菜和其他重要经济作物的反季节供给和跨地区种植中所起的重要作用，设施农业在全国各地得到了大面积的推广应用。
[0003]温室、大棚等栽培条件下的土壤缺少雨水淋洗，且温度、湿度、通气状况和水肥管理等均与露地栽培有较大差别(殷永娴，刘鸿雁.设施栽培下土壤中硝化、反硝化作用的研究.生态学报，1996，16(3):246-250.)，设施栽培又长期处于高集约化、高复种指数、高肥料施用量的生产状态下，其特殊的生态环境与不合理的水肥管理措施导致了土壤次生盐溃化、养分不平衡、土壤酸化等诸多生产问题，其中最为突出的是土壤次生盐溃化，已成为农业生产中的重要限制因子(余海英，李廷轩，周健民.设施土壤次生盐溃化及其对土壤性质的影响.土壤，2005，37(6):581-586.)。土壤的盐溃化不仅影响植物代谢和光合作用，还会降低植物对土壤养分及微量元素的摄入，由于土壤中的铁主要以难溶性的高价氧化物等形式存在，而盐碱土又会进一步降低土壤可溶性铁的含量，从而导致植物的缺绿症。因此，生长在盐溃化土壤中的植物往往同时受到盐胁迫的危害以及铁缺乏的威胁。
[0004]盐碱地改良是一项复杂而艰巨的工作，而在当今提倡生态效益为重的前提下，生物改良措施已成为研究的热点。植物促生菌(plant growth-promotingrhizobacteria,PGPR)可以通过间接产生抗生素和分泌铁载体等方式抑制或减轻植物病害对植物产生的不良影响，并通过解磷、固氮、产生植物激素、酶解降低乙烯水平等方式直接刺激和调节植物生长(Kloepper J ff, Schroth M N.Plant growth-promoting rhizobacteria onradishes//Proceedings of the Fourth International Conference on Plant PathogenBacteria[C], vol.2.1NRA, 1978:879 - 882)。其中，一种含 1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclo-propane-l-carboxylic acid, ACC)脱氨酶的PGPR受到了各国科研工作者的关注。ACC脱氨酶是一种有效降低逆境乙烯含量的外源促生物质，该酶在干旱、盐胁迫及重金属污染等逆境条件下能显著提高农作物的抗逆性和增加产量(Glick BR, Cheng Z, CzarnyJ, Duan J.Promotion of plant growth by ACC deaminase-producing soil bacteria.European Journal of Plant Pathology, 2007，119:329 - 339)。有些微生物可以分泌 1-氨基环丙烷-1-羧酸(简称ACC)脱氨酶从而显著促进植物生长，如番茄、黄瓜、辣椒等蔬菜瓜果类和小麦、豆科等粮食作物。它能水解植物体内生物合成乙烯的直接前体ACC，产生羟基丁酸和氨，阻止乙烯的释放。当这种菌附着在种子表皮时，它能水解ACC，降低种子在逆境条件下大量产生的植物生 长抑制剂和植物衰老促进剂——乙烯的浓度，促进根伸长和植物生长(许煜泉，石荣，林志新.具有ACC脱氨酶活性及抗枯萎病菌的假单胞菌株B*8.上海交通大学学报，1999，33 (2): 206-209.)。
[0005]在实际生产中，若能筛选到既能促生、又能增强作物抗逆能力的促生菌，并在理论上揭示其作用机制，不仅能够有效降低过量施用化肥、农药给环境和人类健康带来的危害，还能广泛促进处于各种逆境环境中植物的生长，对于当前绿色可持续农业的发展具有重要的理论及实际意义。
【发明内容】
[0006]本发明提供一株新的促生菌，可在促进大棚逆境环境中辣椒、番茄等蔬菜瓜果类等生长。
[0007]本发明的技术解决方案为:本发明采用的菌株是同温层芽孢杆菌SC-12，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏日期为2013年5月15号，保藏号为=CGMCC N0..7622。
[0008]本发明菌株SC-12系从江苏省如东县沿海滩涂植物根际土壤中分离得到，观察分析了该菌形态特征、培养特征、生理生化特性以及16SrDNA序列:
[0009]( I)菌落和菌体形态特征以及生理生化特征
[0010]菌株SC-12呈短杆状，菌落黏稠半透明，表面湿润光滑，边缘整齐，革兰氏染色阴性，其电镜图片为图1。生理生化鉴定结果表明:菌株SC-12能充分地利用淀粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖，但不能液化明胶；甲基红试验、伏-普试验、氧化酶试验、硝酸盐还原试验均为阴性；D引哚试验、柠檬酸盐试验、接触酶试验结果均为阳性。
[0011](2)16SrDNA 序列`
[0012]菌株SC-12的16Sr DNA核苷酸序列含有1422bp，序列如SEQ ID N0.1所示，将其与GeneBank等数据库中进行最大同源性比较，发现SC-12的16S rDNA序列与同温层芽孢杆菌 Bacillus stratosphericus KC172060 序列同源性达到 100%。
[0013]本发明还提供了一种促生菌肥，是将所述菌株SC-12接种到腐熟的猪粪秸杆堆肥中发酵得到，所得促生菌肥中含有SC-12菌株IX 108/g以上。
[0014]具体的方法是:将活化的权利要求1所述菌株SC-12接种到LB液体培养基中，30°C，摇床培养20h后，将发酵液按20% (千克/升)的量接种到腐熟的猪粪秸杆堆肥中，并充分混合均匀，调节堆体湿度，进行固体发酵，发酵过程中每天搅拌肥料，控制堆体温度，发酵20天，肥料中含有SC-12菌株I X 108/g以上，即为促生菌肥。
[0015]本发明以ACC为唯一氮源采用富集定向筛选方法，从江苏省如东县沿海滩涂植物根际土壤中分离到4株产ACC脱氨酶的植物促生菌。对其ACC脱氨酶活性大小、产IAA、产铁载体和溶磷能力进行了测定。结果显示，菌株SC-12产脱氨酶的能力最强，同时也具有较强的产IAA和溶磷能力。耐盐及耐酸碱性试验也表明菌株SC-12对盐具有一定的耐性，对酸碱的耐性尤为明显，在PH4~10范围内正常生长。通过对其进行生理生化特性和16SrDNA序列分析，该株菌株初步鉴定为同温层芽孢杆菌。在此基础上，在盐胁迫条件下，菌株SC-12对辣椒、番茄种子发芽率和芽长具有明显的促生作用。由于菌株SC-12株具有较强的产ACC酶活力和很强的环境适应能力，对也具有明显的促生作用。从植物根际盐碱土中筛选出的PGPR相对于肥沃土壤中筛出的PGPR更能适应盐碱环境，所以用于盐碱地改良、盐碱地绿化，更具有实用性。因此，该菌有望应用于大棚辣椒、番茄等茄果类蔬菜，提高植物对逆境的适应能力，增加产量。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1SC-12菌株的透射电镜图；
[0017]图2SC-12菌株的16S rDNA全序列的系统发育树；
[0018]图3不同硝酸盐浓度下菌株SC-12对辣椒和番茄种子发芽率和芽长的影响。【具体实施方式】
[0019]以下结合实例对本发明作进一步的描述:
[0020]实施例1:
[0021]I材料与方法
[0022]1.1 菌种
[0023]从江苏省如东县沿海滩涂植物根际土壤中分离。
[0024]1.2培养基
[0025]LB培养基:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg, pH7.0，去离子水IL ；
[0026]SM培养基:葡萄糖1.0g,鹿糖1.0g，柠檬酸钠1.0g，苹果酸1.0g，甘露醇1.0g，醋酸钠 1.0g, KH2PO40.4g, K2HP042.0g, MgSO40.2g, CaCl20.lg, CuSO4Img, NiSO4Img, ZnS045mg,FeS045mg, MnS043mg, CoSO4Img, Na2MoO4Img, H3B032mg,生物素 2 (VB6) IOmg,硫胺(VB1) 2mg,氰钴维生素(VB12) 0.lmg,泛酸(VB3) 5mg,叶酸2mg,核黄素5mg,烟酸5mg,蒸懼水1000mL,pH6.4。维生素过滤除菌后加入。
[0027]SMA培养基:SM培养基中加入过滤除菌的ACC，使其浓度为0.5g.L'
[0028]SMN培养基:SM培养基中加入(NH4) 2S04,使其浓度为0.5g.L'
[0029]SRSM 培养基:葡萄 H 10g/l ；Ca3 (PO4) 25g/l ； (NH4)SO40.5g/l ；KC10.2g/l ；MgSO4.7H200.3g/l ；MnSO40.004g/l ；FeS04, 0.00 2g/l ；NaC120g/l ;酵母提取物，0.5g/l ;溴甲酹红紫0.lg/lo
[0030]1.3产1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶细菌的筛选
[0031]将菌株接入LB液体培养基中28°C摇床培养18h，离心收集菌体，将菌体用无菌水洗两次后等量(100 U L)分别接入SM液体培养基、SMA液体培养基、SMN液体培养基(3mL)。28°C振荡培养48h，用722分光光度计比色法测定不同处理菌悬液的0D_值，并进行比较。在SM培养基中不长，在SMA和SMN培养基中良好生长的细菌具有ACC脱氨酶活性。
[0032]1.4ACC脱氨酶活性测定
[0033]分离菌株接种于SMN培养液中摇床振荡培养20h，4°C离心收集菌体，用SM培养液洗涤离心两次，菌体悬浮于SM培养液，并按5%接种量接种于SMA培养液，280C 150rpm的条件下培养48h，以诱导产生ACC脱氨酶。4°C离心收集菌体，用0.lmol.L^Tris-HCl缓冲液(pH值为7.6)洗涤离心两次，重悬浮于600 ii L0.lmol.L1Tris-HCl缓冲液(pH值为8.5)中，加入30 ii L甲苯并迅速振荡30s以破碎细胞。
[0034]取IOOii L含甲苯的细胞提取物于1.5mL离心管中，加入10 U L0.5mol.L-1ACC M匀，30°C反应30min。加1.0mL0.56N HCl终止反应，14000rpm离心5min去除细胞碎片，吸取ImL上清液于7mL离心管中，加入0.15mL0.1%的2，4-二硝基苯肼(溶于2M HC1)，30°C反应15-30min。取出加lmL2N NaOH0以加ImL Tris-HCl缓冲液(pH值为8.5)进行同样反应为空白管调零，以ImL浓度为0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0mM的a - 丁酮酸为标准溶液，测定540nm波长下吸光值。
[0035]菌体总蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定。以ImL浓度为0、20、40、60、80和IOOmg.L—1的牛血清白蛋白为标准溶液，加5mL考马斯亮蓝G250染色液，反应5min后测定595nm波长下吸光值。ACC脱氨酶的活性以在测酶体系中每毫克蛋白每分钟形成的a-丁酮酸的量表示，单位为 y mo I a - 丁酮酸? mg—iprotein.mirf1。
[0036]1.5菌株产铁载体、3-吲哚乙酸(IAA)、溶磷能力的测定
[0037]铁载体的测定方法:将分离菌株接种于MSA液体培养基中，摇床30°C 150r/min振荡培养48h后，发酵液6000r/min离心lOmin，取1.5ml上清液加1.5mlCAS检测液，充分混匀，静置Ih后测定630nm波长处的吸光值(A)，以去离子水作为对照调零。另取1.5ml CAS检测液与1.5ml未接菌的MSA液体培养基上清液充分混匀，同法测定吸光值即为参比值(Ar)。以A/Ar作定量指标。比值越小,反映铁载体的产量越大。一般参考标准为:A/ArO~
0.2, +++++ ；0.2 ~0.4, ++++ ；0.4 ~0.6, +++ ；0.6 ~0.8, ++ ；0.8 ~1.0, +。
[0038]IAA测定方法:将色氨酸配置成2.5mg/ml的溶液，LB液体培养基分装于试管中，每管4ml，121°C高压灭菌后加入过滤除菌的色氨酸溶液1ml，使培养基中色氨酸的浓度为0.5mg/ml，将供试菌株接种于上述培养基中，摇床振荡培养3天，离心取Iml上清，加50 u 110mmol/L的正磷酸，再加2ml Salkowski ’ s显色剂，黑暗下25°C显色30min,测定530nm波长下的吸光值。以蒸馏水代替培养液同样反应作为对照调零，用不同浓度的IAA标准液同法作标准曲线，计算发酵液中IAA的浓度。
[0039]溶磷能力的测定方法:将待测的菌株先在LB固体培养基上活化，然后用灭菌牙签点接种菌株至固体改良SRSM培养基上。每菌株在一个皿上接4个重复。在28°C培养箱中培养5d后观察菌株透明圈的大小。
[0040]1.6菌种鉴定
[0041]1.6.1菌落和菌体形态观察
[0042]在LB培养基上划线得到单菌落，观察单菌落边缘形状、大小、隆起情况、表面形态、菌落颜色、透明度、色素产生情况等。将菌株培养16_18h后，进行革兰氏染色，并观察革兰氏染色的阴阳性和菌体的形态。
[0043]1.6.2生理生化鉴定:
[0044]生理生化特征测定参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)。
[0045]1.6.3分子生物学鉴定
[0046]用16S rDNA 通用引物 27F (正向引物):5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (SEQ IDN0.2);1492R (反向引物):5' -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3' (SEQ ID N0.3)，以分离菌株的总DNA为模板进行PCR扩增。扩增反应体积50 u 1，反应条件为94°C预变性5min ；94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸1.5min，循环30次；最后72°C延伸IOmin0取PCR产物2.5 ii L于0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物送至生物公司进行纯化和测序。将测序结果提交GenBank数据库，用BLAST软件进行比对分析。将测序结果用BLAST软件与GenBank中得到的16S rDNA相关菌株的序列一起输入MEGA4.0进行DNA同源性比较和排列，构建系统发育谱系图。[0047]1.7温度、初始pH值和盐浓度对菌株生长的影响
[0048]将供试菌株点接于固体平板，分别在15°C、25°C、35°C、45°C的温度下培养72h，在600nm波长下测量各处理菌液的OD值，用OD值来表示其在梯度盐浓度培养基中培养的生物量，OD值越大，则表明生物量就越大。
[0049]用lmol.L-1的NaOH和lmol.L-1的HCl将LB培养基的pH值分别调节至4.0,5.0、
6.0,7.0,8.0,9.0,10.0。将活化的供试菌株分别点接于上述不同pH的平板上，28°C培养72h，观察其能否生长及生长情况，方法同上。
[0050]将过夜培养的供试菌株的菌悬液接入到Ca(NO3)2浓度分别为0，50，100，150，200，250gkg^的液体LB培养基中(色氨酸浓度为0.5mg mF1)，28°C震荡培养24h，观察其能否生长及生长情况，方法同上。
[0051]1.8不同盐分条件下菌株SC-12对辣椒、番茄耐盐性的影响
[0052]将去离子水(CK)，8、16、24g/kg Ca(NO3)2溶液灭菌后加入灭菌的培养皿中(内置3~5层滤纸)，每平皿10ml。将消毒过的辣椒、番茄(70%酒精lmin，1%次氯酸钠IOmin)，浸于 0.03mol/L MgSO4 菌悬液(OD600=0.5)或 0.03mol/L MgSO4 灭活菌悬液(CK)中 Ih 后，置于上述灭过菌的培养皿中。每天向平皿中加3mL无菌水保湿催芽(25°C-28°C )，4天后调查发芽率及芽长。每培养皿20粒种子，设置5个重复。
[0053]1.9SC-12菌肥田间促生试验
[0054]1.9.1促生菌肥的制备将活化的菌株SC-12接种到IOOmL (500mL摇瓶)LB液体培养基中，30°C，ZOOrmirT1摇床培养20h后，将发酵液按20% (v/m)(千克/升)的量接种到腐熟的猪粪秸杆堆肥中，并充分混合均匀，调节堆体湿度，进行固体发酵，发酵过程中每天搅拌肥料，控制堆体温度，发酵20天，肥料中含有SC-12菌株IX 108/g以上，即为促生菌肥。
[0055]1.9.2番爺育苗番爺品种为金鹏9号,选取健康饱满的番爺种子,在75%酒精中浸泡lmin，用0.1%升汞消毒2min，用灭菌水冲洗3次后浸泡吸胀,然后铺在装有无菌湿润滤纸的培养皿上，30°C催芽，直到种子露白。将种子播入育苗穴盆，栽培土为扬州大学环境科学与工程学院蚯蚓生产基地生产的蚯蚓粪育苗基质，育苗20天后选择生长一致的移栽到大棚。
[0056]1.9.3试验设计试验于2013年在扬州市扬子蔬菜公司大棚内进行。大棚土壤理化性状:有机质29.2g/kg,碱解氮240mg/kg,速效磷140mg/kg,速效钾240mg/kg, pH7.95,全盐1.65g/kg和EC值为0.67mS/cm。大棚面积50 X 6m2,分3畦。每畦双行植株距40cm，行距70cm。每行15株，共30株。田间试验设4个处理:1.促生菌肥(10000kg ha—1) ;2.天辅有机肥(12000kg ha-1) ；3.保利复合肥(1125kg ha—1) ;4.对照。肥料施入土壤后立即浅翻15cm混匀，起垄，覆膜，移苗定植。随机区组排列，4次重复。小区日常管理一致。于番茄采收期，在每个小区中随机选取株挂牌于采收期进行取样，测定植株地上部、地下部和果实鲜重、干重和株高。
[0057]2结果与分析
[0058]2.1产1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶细菌的筛选
[0059]植物在逆境(旱、涝、盐、重金属等)条件下，其体内的乙烯含量会迅速增加，过量乙烯的积累会使植物生长受阻甚至死亡。Glick et al (2005) (Glick BR.Modulation ofplant ethylene levels by the bacterial enzyme ACC deaminase.FEMS MicrobiologyLetter, 2005, 251:1 - 7)研究表明微生物能够产生ACC脱氨酶，通过分解乙烯的前体物质ACC，来减少胁迫环境下乙烯在植物体内的积累，从而促进植物生长发育。本研究通过将供试菌株的细菌悬液分别等量接种于SM、SMA, SMN培养液中，以检测菌株是否能以ACC为唯一氮源进行生长。将供试细菌接种于SM培养基可以排除菌株固氮作用引起的判断误差，接种于SMN培养基可以排除细菌培养和培养基配方等对菌株产ACC脱氨酶能力的判断误差。试验结果表明，有多株菌在SMA培养液的生长势明显好于SM培养液的生长势，表明菌株能以ACC为唯一氮源进行生长，将这些菌株命名为SC-3、SC-12、D18、D25。
[0060]2.2分离菌株ACC脱氨酶活性、产铁载体，IAA和溶磷能力的测定[0061 ] 本研究对上文中的以ACC为唯一氮源生长的分离菌株进一步定量测定其ACC脱氨酶活性，结果见表1。结果表明，4株菌均表现出ACC脱氨酶活性，LSD多重比较结果表明，4株菌在0.05显著水平上存在显著差异，其ACC脱氨酶活性表现为SC-12>D18>D25>SC-3。
[0062]PGPR既可以通过解磷、产生植物激素等直接作用促进植物的生长，也可以通过分泌铁载体和产生抗生素等间接作用提高植物的抗逆性(丁延芹，杜秉海.玉米根际细菌中PGPR的筛选及初步鉴定.土壤肥料，2001, (3):41-43.)，本实验室通过对4株菌株产铁载体、IAA和溶磷能力的测定，LSD多重比较结果表明，菌株SC-3和D25产IAA能力显著大于菌株SC-12和D18 (P < 0.05)，菌株D18产IAA能力最低；溶磷能力SC-12 > D25 > SC-3> D18，4株菌株均能产生铁载体，菌株SC-12和D18产铁载体能力较强，而菌株SC-3和D25产铁载体能力较弱。综合以上分析菌株SC-12对大棚逆境环境中植物的潜在促生效果可能优于其余3株菌。以下SC-12菌株被选用于进一步的研究。
[0063]表1供试菌株ACC脱氨酶活性及产吲哚乙酸、铁载体和精氨酸脱羧酶情况
[0064]
【权利要求】
1.一株产ACC酶活性促生菌SC-12,是同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus),它的保藏号为CGMCC N0.7622。
2.权利要求1所述的SC-12菌株在促进大棚逆境环境中茄果类蔬菜生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述茄果类蔬菜是番茄、辣椒。
4.一种促生菌肥，是将所述菌株SC-12接种到腐熟的猪粪秸杆堆肥中发酵得到，所得促生菌肥中含有SC-12菌株I X 108/g以上。
【文档编号】A01N63/00GK103642730SQ201310646842
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】王小兵, 封克, 汪晓丽 申请人:扬州大学