一种甜菜内生微杆菌及其用于甜菜病害生物防治中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种甜菜内生微杆菌MicrobacteriummaritypicumTNJK2011CGMCCNo.8193及其在在用于甜菜病害生物防治中的应用。通过通过对所获菌株进行形态特征、生理生化特性及16SrDNA序列测定及系统发育分析，初步确定了其分类地位；同时对该细菌TNJK2011的发酵液的抑菌率、生防性、稳定性等特性进行了深入研究，从已经分离的甜菜内生菌中筛选甜菜根腐病、甜菜褐斑病、甜菜立枯病、甜菜蛇眼病内生拮抗细菌，以期获得防治甜菜主要病害的新途径，具有广泛的应用价值。
【专利说明】一种甜菜内生微杆菌及其用于甜菜病害生物防治中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业微生物应用【技术领域】，具体说，本发明涉及一种甜菜内生菌及其用于甜菜病害生物防治中的应用的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]植物体内的大量微生物，在与植物协同进化的过程中，由于长期生活在植物特定部位，因而与植物形成了一种特殊的关系，这些微生物在植物体内大量繁殖和扩散，有望成为生物防治中有潜力的微生物。内生细菌是植物体内种类和数量最多的微生物，具有在植株体内分布广、定殖能力强、防病效果好及增殖和扩散快等优点，因而成为具有良好应用前景的植物病害生防菌。
[0003]内生菌普遍存在于植物体内，与宿主形成和谐的共生体，产生大量次生代谢活性物质。据报道，内生菌可增强宿主的抗病性、提高植物的生产力、抗逆抗虫、具有除草剂活性等特性。因此，内生菌可作为生物促生中有潜力的因子，在生态农业和生物农药研制方面具有重要的用途。植物内生细菌(Endophytic bactena )可通过不同途径促进其宿主植物生长，其作用与植物根围细菌相似(PGPR)，植物根围细菌也就是常说植物根围促生细菌(Plant growth -promo ting rAizoAacteria,简称PGPR),生存于植物根际、根表,能够直接或间接地促进或调节植物 以及作物生长。植物内生细菌能固定大气中的氮供给其宿主植物利用；合成铁载体能够溶解并吸收土壤中铁供给其宿主植物利用；合成植物激素促进植物不同生长阶段的生长，具有溶解矿物质如磷的机制，使其更有利于植物利用；作用于生长有关的酶使其调节植物的生长发育。
[0004]甜菜内生菌0?而—是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康甜菜各种组织和器官内部或细胞间隙的真菌、细菌和放线菌。作为植物微生态系统的天然组成成员，内生细菌可在植物体内长期定殖，某些内生细菌可通过产生抗生素、水解酶类等抗菌活性物质在植物体内长期发挥生防作用；相对于腐生细菌、PGPR (植物促生菌)等生防因子，内生细菌不易受环境条件的影响，可在植物体内定殖和传导，更有利于发挥生防作用，已成为植物病害生物防治上一类极具应用潜能的新资源菌。已有研究者从棉花、水稻、烟草、辣椒、番茄、马铃薯等作物中分离到对宿主植物病害具有良好防治效果的内生细菌，但目前尚未见甜菜内生细菌用于病害生物防治的研究报道。
【发明内容】
[0005]针对现有技术未见有关甜菜内生细菌用于病害生物防治的研究报道的技术的现状，本发明旨在提供一种甜菜内生微杆菌及其用于甜菜病害生物防治中的应用，本发明基于植物内生菌与植物和谐联合的关系，在甜菜中分离出一批内生菌的菌株，从中筛选出一株编号为TNJK2011的菌株，并通过利用该编号为TNJK2011的内生菌有效地防治甜菜生育期的根腐病、褐斑病、立枯病、蛇眼病等病害，将病害对甜菜生产的不利影响降低到最低限度，有利于提高甜菜的产量和品质，获得良好的技术效果，作为甜菜病害生物防治中具有广泛而适用的价值。
[0006]本发明采用主要的技术方案:
通过甜菜内生菌的分离筛选，在甜菜中分离出一批甜菜内生的微生物菌株，经过进一步筛选、驯化选育，获得一株编号为TNJK2011。通过对所获菌株进行形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列测定及系统发育分析，初步确定了其分类地位；同时对该细菌TNJK2011的发酵液的抑菌率、生防性、稳定性等特性进行了深入研究，从已经分离的甜菜内生菌中筛选甜菜根腐病、甜菜褐斑病、甜菜立枯病、甜菜蛇眼病内生拮抗细菌，以期获得防治甜菜主要病害的新途径。通过内生菌有效地防治甜菜生育期的各类病害，将病害对甜菜生产的不利影响降低到最低限度，证明了编号为TNJK2011是一种优良的内生生防菌，有利于提高甜菜的产量和品质，充分保障糖厂原料的充足供应，对于稳定甜菜生产，提高农民种植甜菜的积极性，实现农户、糖厂的增产增收，增强新疆糖业的市场竞争力有着深远的意义。通过将此内生菌在甜菜栽培上的应用获得良好作用，具有突出的技术效果。
[0007]本发明具体提供的一种甜菜内生微杆菌Microbac terium mari typicum,通过在甜菜中分离、筛选和培养，获得一批内生的微生物菌株，从中筛选出一株编号为TNJK2011的菌株，经微生物学分类与鉴定，属于内生微杆菌#丨crobac teri um mari typi cum。
[0008]具体的，本发明提供的一种甜菜内生微杆菌Mi crobac teri um mari typi cum,菌株编号为TNJK2011。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101。保藏日期是2013年9月16日，保藏号是CGMCC N0.8193。该菌株最适生长条件为:温度32°C，培养基采用胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基，培养条件:pH7.2，时间48h;该菌株菌落较大且平滑，呈透明、黄色、表面湿润、边缘整齐，生长较快；通过革兰氏染色，镜检观察，发现该菌株为革兰氏阳性菌，经微生迦学鉴定％ Microbacterium mari typicum菌。依照第九版《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(JiBergey，s Manual of` Systematic和《常用细菌系统鉴定手册》对TNJK2011菌株进行形态学测定，生理生化检测确定TNJK2011Microbacterium属中的成员。通过BLAST同源比对，菌株TNJK2011的16S rDNA序列在NCBI数据库中进行BLAST分析后，构建系统进化树，该菌株TNJK2011maritypicumDSM 12512处于最小分支，是其近似种；进而将该菌株TNJK2011确定mari typi cum。
[0009]本发明提供的内生促生菌#/^/"0如<^ teria? mari typicum TNJK2011培养时使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨酵母粉；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、甘露糖、甘油、麦芽糖；使用的无机组分包括包括但不限于氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、氢二钾、磷酸三钙、二水氯化钙、七水合硫酸镁、七水和硫酸亚铁。本发明的根际促生菌发酵可在20-37 °C, pH5.5-9.1的环境下进行。并且该内生拮抗菌TNJK2011能有效抑制根腐病、褐斑病、立枯病、蛇眼病病原菌生长。
[0010]进一步，本发明提供一种甜菜内生微杆菌Microbacteriutn mari typicumTNJK2011 CGMCC N0.8193在用于甜菜病害生物防治中的应用。通过将该菌种TNJK2011菌株对于甜菜具有抑制根腐病、褐斑病、立枯病、蛇眼病病原菌作用，获得良好的技术效果。
[0011]本发明进一步提供了甜菜内生微杆菌mari typicum TNJK2011CGMCC N0.8193的保存条件，采用TSA培养基成分:TSA胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，葡萄糖 2.5g，氯化钠 5g K2HPO4 2.5g PH=7.2 定容至 1000ml ;培养条件:28°C, PH=7.0。
[0012]通过实施本发明具体的
【发明内容】
，可以达到以下有益效果:
本发明分离筛选提供的甜菜内生微杆菌crobac teri um mari typi cum TNJK2011CGMCC N0.8193是一种优良的内生拮抗菌，具有突出的生防特性，该内生促生菌TNJK2011甜菜根腐病、甜菜褐斑病、甜菜立枯病、甜菜蛇眼病内生拮抗细菌，以期获得防治甜菜主要病害的新途径。通过内生菌有效地防治甜菜生育期的根腐病、褐斑病、立枯病、蛇眼病等病害，将病害对甜菜生产的不利影响降低到最低限度，证明了编号为TNJK2011是一种优良的内生生防菌，获得良好的技术效果，有利于提高甜菜的产量和品质，充分保障糖厂原料的充足供应，对于稳定甜菜生产，提高农民种植甜菜的积极性，实现农户、糖厂的增产增收，增强新疆糖业的市场竞争力有着深远的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图！显不为甜菜内生微杆菌佑^/^如^從/應趟/分沙化"? TNJK2011 CGMCC N0.8193的菌落形态图。
[0014]图2显不为甜菜内生微杆菌#/^/'0如<^6?/'/?7?趟/分_7/^^"?TNJK2011 CGMCC N0.8193的生长曲线图。
[0015]图3显不为甜菜内生微杆菌#/^/'0如<^6?/'/?7?趟/分_7/^^"?TNJK2011 CGMCC N0.8193的16S rDNA系统发育树图。
【具体实施方式】
[0016]下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
[0017]本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备:DFsalts minimal medium(IL): 4.0g KH2PO4, 6.0g Na2HPO4, 0.2gMgS04 ? 7H20, 2.0g glucose, 2.0g gluconic acid,2.0g citricacid;痕量兀素:Img FeSO4 ? 7H20, IOmgH3BO3, 11.1mg MnSO4 ? H2O, 124.6mgZnSO4 ? 7H20, 78.22mg CuSO4 ? 5H20, IOmg MoO3; pH7.2; and2.0g (NH4) 2S04 中加入 L-色氨酸 IOOu g ? mL' 0.7mmol ? L-1 磷酸缓冲液(pH6.9):用 0.2606g ? L-1 Na2HPO4 ? 12H20 调0.1092g ? L-1 NaH2PO4 ? 2H20 至 pH6.9。
[0018]主要仪器与试剂:TG328A型分析天平，AB204-N型电子天平，PHS-3TC (0.01级)精密数显酸度计，101-2型干燥箱，UV-2100分光光度计，HYG-1I回转式恒温调速摇瓶柜，LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器，超净工作台，3K15台式冷冻离心机；甘油，牛肉膏，酵母膏，氯化钠，氢氧化钠，葡萄糖，硫酸镁，硫酸锌，硫酸亚铁，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，琼脂，鹿糖，次氯酸钠，PCR预混液{TaKaRa Biotechnology),其余试剂均为分析纯。
[0019]本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
[0020]实施例一:甜菜内生微杆菌#/croAacteria?TNJK2011 CGMCC N0.8193的分离、筛选及鉴定
(1)菌种的分离和筛选
从甜菜组织中通过梯度稀释法分离出多株细菌，采用平板对峙法，根据有无抑菌圈判断其是否具有拮抗作用，初步筛选出对甜菜根腐病、褐斑病、立枯病、蛇眼病等病原具有一定拮抗能力的菌株。对具有拮抗作用的菌株进行进一步实验，筛选出拮抗能力较强的菌株以备后续实验。
[0021 ] 通过在甜菜组织中分离、筛选和培养，获得一批内生菌的微生物菌株,从中筛选出一株编号为TNJK2011的菌株,经微生物学分类与鉴定，属于微杆菌属的#/^/-0如<^6?/^'仰？mari typi cum。
[0022]具体的，本发明提供的一种甜菜内生微杆菌Mi crobac teri um mari typi cum,菌株编号为TNJK2011。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101。保藏日期是2013年9月16日，保藏号是CGMCC N0.8193。经微生物学鉴定为#/ crobac teri um mari typi cum。该菌株最适生长条件为:温度32° C，培养基采用胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基，培养条件:pH7.2，时间48h;该菌株菌落较大且平滑，呈透明、黄色、表面湿润、边缘整齐，生长较快；通过革兰氏染色，镜检观察，发现该菌株为革兰氏阳性菌，菌株TNSC2011为革兰氏阳性，菌体
0.3-0.5MmX0.8-1.7Mm，TSA平板上28°C培养48h菌落黄色，菌落2_4mm。经微生物学鉴定为Mi crobac teri um mari typi cum舊。依照第九版《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(JiBergey，sManual of Systematic和《常用细菌系统鉴定手册》对TNJK2011菌株进行形态学测定，生理生化检测确定TNJK2011菌株为微杆菌属(Microbacterium)中饱澈艮。通过BLAST同源比对，菌株TNJK2011的16S rDNA序列在NCBI数据库中进行BLAST分析后，构建系统进化树，该菌株TNJK2011与Microbacterium mari typicumDSM 12512处于最小分支，是其近似种；进而将该菌株TNJK2011觀定% Microbacterium mari typi cum。
[0023]本发明提供的内生促生菌TNJK2011培养时使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、甘露糖、甘油、麦芽糖；使用的无机组分包括包括但不限于氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、氢二钾、磷酸三钙、二水氯化钙、七水合硫酸镁、七水和硫酸亚铁。本发明的内生拮抗菌发酵可在20-37°C，pH5.5-9.1的环境下进行。并且该内生拮抗菌TNJK2011能有效抑制根腐病、褐斑病、立枯病、蛇眼病病原菌生长。
[0024]通过上述对TNJK2011菌株进行形态学测定，并对菌株TNJK2011的形状、大小、生理生化反应进行检测，本发明的TNJK2011菌株生物学特性如表1所示。
[0025]表1:菌株TNJK2011的生理生化特性
【权利要求】
1.一种甜菜内生微杆菌#/^(9如maritypicum TNJK2011，其特征在于，所述的甜菜内生微杆菌如cteri训？ maritypicum TNJK2011的菌种保藏号为CGMCC N0.8193。
2.—种如权利要求1所述的甜菜内生微杆菌#/^(9/?况teri?舰TNJK2011在用于甜菜病害生物防治中的应用。
3.如权利要求2所述的甜菜内生微杆菌#/^(9/?况teri?maritypicum TNJK2011在用于甜菜病害生物防治中的应用，其特征在于，所述的甜菜内生微杆菌maritypicum TNJK2011应用于甜菜抑制根腐病、褐斑病、立枯病、蛇眼病病原菌中的应用。
【文档编号】A01P3/00GK103642734SQ201310660484
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】史应武, 杨红梅, 高雁, 张涛, 林青, 常玮, 李玉国, 欧提库尔玛合木提, 娄恺 申请人:新疆农业科学院微生物应用研究所