一种微生物复合肥料的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种微生物复合肥料，涉及农业技术中的肥料；所述微生物复合肥料，由黑曲霉培养物、枯草芽孢杆菌菌剂组成，微生物复合肥料的重量份数组成为黑曲霉培养物20-50份、枯草芽孢杆菌菌剂20-35份；实验表明使用本品可提高粮食产量8-30%，提高蔬菜产量10-40%，还可改善蔬菜、粮食的品质和风味。每亩土地使用本发明的肥料的量为50-100克，是目前国内外使用量较少的微生物复合肥料之一。
【专利说明】一种微生物复合肥料
【技术领域】:
[0001]发明涉及农业技术中的肥料，涉及一种新型的微生物复合肥料。
【背景技术】:
[0002]现有的生物肥料大多是单一性的生物肥料。如:固氮菌肥，主要由具有固氮作用的细菌和真菌组成；又如:磷细菌，其功能是分解土壤中的有机磷，使之变为易于被植物吸收的磷素；再如:细菌，其功能是分解土壤中的钾化合物，使之成为能被植物吸收利用的速效钾。这些肥料在单独使用时均能发挥各自作用，部分满足植物对氮，磷，钾三要素的需要。它们不会产生长期使用化肥所造成的土壤板结现象。但其不足在于:单独使用上述三类生物肥料只能解决植物所需营养的一个方面，且成本较高，用量大，同时，将三者配合使用，又因难于做到比例适当而造成施肥量的不足或浪费。长期使用单一的或复合的生物肥料的实践证明，它们只能替代化肥的30%以下。
【发明内容】
:
[0003]本发明的发明目的是提供一种能针对我国土壤肥力的基本情况，开发一种微生物复合肥料。
[0004]本发明的技术解决方案是:
[0005]一种微生物复合肥料，由黑曲霉培养物、枯草芽孢杆菌菌剂组成，微生物复合肥料的重量份数组成为黑曲霉培养物20-50份、枯草芽孢杆菌菌剂20-35份；
[0006]一种生产微生物复合肥料的方法，将特选的黑曲霉培养物、枯草芽孢杆菌分别进行培养、发酵，然后将发酵产物按比例组合为微生物复合肥料。
[0007]黑曲霉培养物制备:菌种培养，采用常见固体发酵培养方法:孢子液接种到固态发酵培养料中，26-33 °C培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物。
[0008]有益效果:
[0009]实验表明，使用本品可提闻粮食广量8-30%,提闻蔬采广量10-40%,还可改善蔬菜、粮食的品质和风味。每亩土地使用本发明的肥料的量为60-100克，是目前国内外使用量较少的微生物复合肥料之一。
[0010]每亩使用量为80-200克。在本发明微生物复合肥料中加入120倍的自来水和6倍的尿素，在22°C以上45°C以下的水温中活化28小时，然后连同化肥(按照上年使用量的50%)洒入土壤中。最好作基肥,每年使用1-3次。
【具体实施方式】:
[0011 ] 下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。1、囷剂培养制备:
[0012]枯草芽孢杆菌剂培养制备:枯草芽孢杆菌菌剂制备:从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕离心分离获得湿菌体和发酵液；发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的40-50%，得到菌浓缩液。添加载体:向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5-0.7:1，载体组成为:CaC0320-40份，糊精10-20份。流化床干燥，干燥温度50°C。
[0013]黑曲霉培养物制备:菌种培养，固体发酵培养:孢子液接种到固态发酵培养料中，26-35 °C培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物；
[0014]本发明提供的产耐高温α-淀粉酶的菌株具体为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) L1-2013-02。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110:，地址为:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为 CGMCCN0.7926。
[0015]所述菌株特点如下:
[0016]所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥不透明，边缘整齐，为具有运动性的好氧菌。镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性。该菌可利用柠檬酸盐，硝酸还原、V-P实验成阳性。
[0017]所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L1-2013-02由一株保藏于本实验室的产耐高温α -淀粉酶的枯草芽孢杆菌L1-2013经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，具体筛选步骤如下:
[0018](I)菌悬液的制备
[0019]将在平板划线分离后长出的L1-2013单菌落接入种子培养基中，100r/min，40°C培养12h后,取ImL培养液离心后用生理盐水洗漆两次,并重悬与9mL生理盐水中。
[0020](2)紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变
[0021]将菌悬液置于无菌平板中，`在距离为30cm，功率15w的紫外灯下搅拌照射100s。将经过照射的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板，并以未经紫外照射的菌液稀释涂平板做对照。将上述涂布均匀的平板，用黑色的布或报纸包好，置40°C培养48h，在长出菌落的平板上筛选出水解圈与菌落直径比值最大者挑至斜面保存，纯化后配制成菌悬液，经梯度稀释后与硫酸二乙酯原液充分混合，并于40°C震荡处理40min，将处理过的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板。
[0022](3)高产菌种的初筛
[0023]将上述涂布均匀的平板，置40°C培养48h，在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后获得三株菌L1-2013-01，L1-2013-02，L1-2013-03
[0024](4)摇瓶发酵复筛
[0025]将获得的三株菌L1-2013-01，L1-2013-02, L1-2013-03在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10% (V/V)，40°C、100r/min培养72h，离心取发酵上清液制得粗酶液。
[0026](5)酶活测定
[0027]酶活单位的定义:ImL粗酶液,于105°C、pH4.2条件下，Imin液化Img可溶性淀粉，即为I个酶活力单位，以U/mL表示。
[0028]经测定，菌株L1-2013-02，为稳定的最高产菌株，且酶活达到30000U/mL，比原始菌株酶活提高1.6倍。
[0029]所述氯化锂平板:淀粉1%，蛋白胨 1%，(NH)2SO40.4%, K2HPO40.8%, CaCl20.2%，氯化锂0.9%，琼脂2%。
[0030]所述的种子培养基:酵母粉0.5 %，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCl I %。
[0031]所述的发酵培养基:玉米粉5%~15%，豆饼粉4%~10%，(NH) 2S040.4 %,K2HP040.8%, CaC120.2%?
[0032]所述的摇瓶培养条件:该菌在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，接种量10%(V/V)，100r/min、40°C 发酵培养 72h。
[0033]由菌株L1-2013-02发酵获得了一种耐高温的α -淀粉酶，其酶学性质如下:
[0034](I)该酶温度适应范围较宽，最适作用温度在105_115°C之间，且在110°C以下保存的温度稳定性较好，而115°C以上保存长时间温度稳定性较差。
[0035](2)该酶最适反应pH值为4.2。在pH值3.0_7.0之间均有较高酶活力，在pH值为3.0时酶活完全稳定。
[0036](3)酶活性:由本发明所提供的突变株L1-2013-02，制备的耐高温α -淀粉酶酶活力为 30000-35000U/ml。
[0037]1、本发明使用紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变的方法获得了一株高产耐高温α -淀粉酶的枯草芽孢杆 菌L1-2013-02，该菌株具有强耐酸、耐热性，产酶活力高的特点。
[0038]2、有该菌株生产所得的耐高温α-淀粉酶酶活力高达30000-35000u/ml，；适用温度范围为25-115°C，最适反应温度110°C，在110°C酶活完全稳定；适用反应pH值范围为
3.0-7.0，在pH值为3.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为4.2，比现有的耐高温α -淀粉酶酶活力高，酶作用最适PH值范围宽泛，耐温度高，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。
[0039]本发明提供的黑曲霉菌株Aspergillus niger L1-2013-03是由实验室保藏的一株产纤维素酶产的黑曲霉Aspergillus niger L1-2010经多轮亚硝基胍诱变，然后对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产高活力纤维素酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger L1-2013-03o
[0040]本发明提供的产高活力纤维素酶的菌株具体为黑曲霉Aspergillus nigerL1-2013-03。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编100101)，保藏号为 CGMCC N0.7927。
[0041]产高活力纤维素酶菌株的筛选方法，包括以下步骤:
[0042]I)斜面培养:将原始黑曲霉菌株Aspergillus niger Li_2010划线接种斜面培养基，30°C培养2~3d，直至菌丝体成熟、产大量黑色孢子。所述斜面培养基组成如下:12°Brix 麦芽汁 1000mL, pH 值自然，121°C灭菌 20min ；
[0043]2)孢子悬液制备(以下步骤均在无菌条件下操作):向试管斜面加入15mL无菌水，把孢子刮下，用滤纸过滤，将滤过液倒入已灭菌、并加有5-10粒无菌玻璃珠的150mL三角瓶中，将三角瓶放入摇床振荡10-15min，使孢子分散。
[0044]3)亚硝基胍(NTG )诱变
[0045]A.用无菌水将孢子悬浮液调节为稀释成IO6-1O7个/mL。
[0046]B.取IOmL菌悬液转移至IOOmL三角瓶中，加入IOmg的NTG,配制成终浓度为IOmg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0047]C.在30°C下200rpm振荡反应30min, 5000rpm离心IOmin收集菌体,用无菌生理
盐水洗涤数次，中止反应。
[0048]D.适当稀释将孢子浓度调节为IO3个/mL，取最后稀释度的菌液0.2mL，稀释涂布于纤维素-刚果红平板筛选培养基上。在30°C培养2~3天后挑取透明圈/菌落直径较大的菌株200支。(所述纤维素-刚果红平板筛选培养基组成如下:纤维素粉10g、刚果红
0.2g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾lg、氯化钠0.lg、明胶2g、琼脂20g、自来水定容1000mL, pH 值 5-6，121°C灭菌 20min)。
[0049]E.复筛:将获得的200株菌分别用无菌牙签接种于斜面培养基，30°C培养至孢子铺满斜面。分别将孢子以无菌水洗下接种于装有50mL复筛培养基的250mL三角瓶中进行发酵，接种量10%( v/v)，30°C、100r/min培养96h，分别测定各菌株的纤维素酶活性。(所述复筛培养基组成如下:纤维素粉50g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾lg、氯化钠0.lg、自来水定容1000mL，pH值5-6，121°C灭菌20min)。选取纤维素酶酶活力最高的菌株进行放大实验。
[0050]4)遗传稳定性试验
[0051]将L1-2013-03菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。
[0052]5)放大试验
[0053]①种子培养:将纤维素酶酶活力最高的菌株Aspergillus niger L1-2013-03接入500mL三角瓶中，种子培养基装量100毫升，30°C、150rpm摇床培养72_96h。
[0054]③种子罐培养:将种子液以10% (v/v)接种量接入装有7.5L发酵液的IOL发酵罐中，控制pH值恒定为6.0±0.2，培养温度30±0.1°C，搅拌速度300rpm，通风量(v/v)1:0.8-1.2，培养时间96h，溶解氧20-30%。所述发酵培养基组成为:纤维素粉100g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾lg、氯化钠0.lg、自来水定容lOOOmL，pH值5-6，121°C灭菌20mino
[0055]发酵结束后，取发酵上清液(粗酶液)进行酶活力检测经测定，菌株Aspergillusniger L1-2013-03的外切β-葡聚糖酶、内切β _葡聚糖酶、β _葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到 620U/mL、1289U/mL、456U/mL 和 732U/mL,分别比出发菌株 Aspergillus nigerL1-2010 提高了 9.21 倍、7.43 倍、8.15 倍和 10.31 倍。
[0056]实施例1
[0057]—种微生物复合肥料，由黑曲霉培养物和枯草芽孢杆菌菌剂组成，微生物复合肥料的重量份数组成为黑曲霉培养物40份、枯草芽孢杆菌菌剂20份；
[0058]本发明产品的具体生产方法步骤如下:
[0059]菌剂培养制备:
[0060]枯草芽孢杆菌剂培养制备:枯草芽孢杆菌菌剂制备:从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕离心分离获得湿菌体和发酵液；发酵完毕发酵液经低温负压 真空浓缩到原体积的50%，得到菌浓缩液。添加载体:向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.6:1，载体组成为:CaC0330份，糊精15份。流化床干燥，干燥温度50°C。
[0061]黑曲霉培养物制备:菌种培养，固体发酵培养:孢子液接种到固态发酵培养料中，30°C培养至菌丝长满培养料，低温流化床45°C干燥，粉碎干燥物；
[0062]采用的菌种如下:
[0063]枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis subsp) CGMCC7926
[0064]上述菌种的保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心。地址:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号；邮编:100101。
[0065]黑曲霉培养物的制备方法:
[0066]技术方案如下:
[0067]斜面菌种活化培养:将黑曲霉斜面菌种转接到斜面培养基上，27°C培养3天。
[0068]固体一级种子培养:挑取黑曲霉斜面菌种接入装有100克培养基的500毫升三角瓶中进行种子培养，30°C培养3天即可。
[0069]固体二级种子培养:将上述培养好的固体一级种子搅拌为碎块后加入装有1000克培养基的5000毫升三角瓶中进行种子培养，培养条件:30°C培养3天即可。
[0070]固体发酵培养:将二级摇瓶种子粉碎，加入装有灭菌培养基的发酵池或托盘中混合均匀后培养，曲料培养温度控制在26-35°C，湿度80-90%，每隔10小时翻料一次，培养时间5-7天；固体曲料的培养采用常用曲料培养技术；待培养料长满菌丝即可结束培养，培养基预先经高温蒸煮灭菌处理，灭菌条件控制温度121°C，时间I小时。
[0071]干燥粉碎:发酵结束培养料`在流化床或其他干燥设备上进行干燥，干燥温度控制在60°C，干燥到水分含量在10%`以下，然后将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在60目以上。
[0072]培养基组成:固体原料:麸皮70%，粉碎的作物秸杆15%，豆饼粉5%，玉米淀粉10%，添加等量自来水；初始pH自然。
[0073]枯草芽孢杆菌的制备方法:
[0074]1.发酵液的获得:采用斜面菌种逐级扩培获得枯草芽孢杆菌发酵液；
[0075](I) 一级种子培养:将枯草芽孢杆菌斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度30°C，培养时间24小时；
[0076](2)二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0077](3)三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30°C，培养时间24小时；
[0078](4) 一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度28°C，搅拌速度100转/分，通风量(V/V) 1:0.5,罐压
0.05Mpa,培养时间24小时；
[0079](5)发酵培养:将一级种子罐菌种以10%接种量接入总容积为1.5吨二级种子罐，发酵培养基装量I吨，培养条件培养温度28°C，搅拌速度100转/分，通风量(V/V) 1:0.5，罐压0.05Mpa,培养时间24小时。
[0080]培养基组成:葡萄糖6%，酵母提取物1%,蛋白胨0.2%，CaC031%, pH6.8。
[0081]试验地的选择与试验设计:试验于2012年3月27日一9月30日在宁夏盐池县花马池镇八堡村进行。
[0082]试验田达到田种植玉米10亩，分别在种植时使用本发明产品每亩0.1公斤，出苗I个月左右通过锄地松土方式使用发明产品0.7公斤，对照组使用常规肥料。
[0083]发明产品使用玉 米地玉米产量达到650公斤，对照组达到520公斤；该地块在第2年种植春小麦，春小麦产量达到了 410公斤，比对照组单产提高了 20%。且试验田土壤结构良好，无大块和板结。
【权利要求】
1.一种微生物复合肥料，由黑曲霉培养物和枯草芽孢杆菌菌剂组成，微生物复合肥料的重量份数组成为黑曲霉培养物20-50份、枯草芽孢杆菌菌剂20-35份。
2.根据权利要求1所述的微生物复合肥料，其特征在于，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) L1-2013-02 保藏号为 CGMCC N0.7926。
3.根据权利要求1所述的微生物复合肥料，其特征在于，黑曲霉(Aspergillusniger)保藏号为 CGMCC N0.7927。
4.根据权利要求1所述的微生物复合肥料，其特征在于，微生物复合肥料由黑曲霉培养物和枯草芽孢杆菌菌剂组成， 微生物复合肥料的重量份数组成为黑曲霉培养物40份、枯草芽孢杆菌菌剂20份。
【文档编号】C05F11/08GK103739316SQ201310743070
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】邵素英, 孔日祥 申请人:邵素英