石斛胚状体悬浮培养工艺的制作方法
【专利摘要】石斛胚状体悬浮培养工艺。采用野生石斛成株茎段休眠诱导胚状体，在1/4MS矿物盐2.5％蔗糖和0.5％麦芽糖、5％苹果汁、4.5克/升琼脂粉、PH5.8的固体培养基上，25℃±1，生理活性在光照强度为2000lx，光照时间12h/天。通过90～120天连续筛选，最终达到每7天收获一次，多糖含量达到16％以上，比生物生长速率达8～9.5毫克/克·天，可扩增到产量每年10吨以上，并保持周年稳定的扩增体系。
【专利说明】石斛胚状体悬淳培养工艺
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物组织工程【技术领域】。本发明涉及一种植物生物技术克隆工程，特 别是针对像铁皮石斛这种药用价值很高却生长缓慢、产量极低、对环境条件要求十分苛刻 的濒危物种。
【背景技术】
[0002] 随着城市化进程的迅速发展和人口的不断增长，生态环境的不断退化，使许多名 贵中药材资源枯竭和濒灭。特别是针对像铁皮石斛这种药用价值很高却生长缓慢、产量极 低、对环境条件要求十分苛刻的濒危物种，其社会效益很大。
[0003] 石斛一药，顾名思义，是专指生于岩石上的石斛。至于附生于树木上的石斛属植 物，古代本草亦有记载，称之为木斛。《本草经集注》曰："生栎树上者名木斛，其茎形长大而 色浅。……今始安亦出木斛，至虚长，不入丸散"。《本草图经》曰："惟生石上者胜。亦有生 栎木上者，名木斛，不堪用。"目前广泛培养于木屑之上的木斛，药性甚微，而且大面积占用 土地。虽然从上个世纪80年代开始，人们试图用种子繁殖，人工栽培等手段或通过组织培 养，诱导种子原茎球来扩增植株，再进行人工引种栽培等方法，扩大铁皮石斛的生产。但是 迄今成效甚微。而且利用种子发芽扩增的方法很容易造成变种，对石斛物种的纯度造成很 大的威胁。
[0004] 本发明根据高等植物细胞的两个全能性：植物细胞具有分化成完整植株的全能性 和植物细胞能合成原生植株药用有效成份的全能性。根据这样的理论基础，针对铁皮石斛 这一具体物种，发明了一整套从铁皮石斛原生植株成株茎段休眠芽上直接诱导出胚状体， 从源头上保证了药材的"原汁原味"。
[0005] 利用本发明的铁皮石斛胚状体悬浮培养技术工艺，其生长速率达到8-9. 5毫克/ 克?天；相当于自然生长速度的1300倍以上。每7天收获一次得干率10%以上。由于无 性繁殖，不存在物种变异的危险，其遗传稳定性可靠。通过实施本发明的技术工艺，使铁皮 石斛的生物培养规模从实验水平向工厂化生产规模转化提供了物质保证。
【发明内容】
[0006] 本发明公开了直接从石斛带休眠芽茎段，无菌条件下切取带节的切段，插入到 1 / 4MS矿物盐2. 5%蔗糖和0.5%麦芽糖、5%苹果汁、4.5克/升琼脂粉、PH5. 8的固体 培养基上。25° C± 1，生理活性在光照强度为68?75mol/平方米?秒，经45?50天后， 待起始胚状体长到6_大小时，及时地将胚状体球剥离出外植体，置于相同的上述培养基 上扩增。扩增后转入到上述培养基去掉琼脂粉的液体培养基中，进行悬浮培养，每瓶按5% (W / W)接种率接种，90?120转/分回转摇床生长，每8天继代一次；经3-4次继代后；进 入筛选程序，从培养物中不断挑选出浅绿色呈圆球状，生长致密、扩增速度快的胚状体，通 过90?120天连续筛选，最终达到每7天收获一次，多糖含量达到16%以上，比生物生长速 率达8?9. 5毫克/克?天，并保持周年稳定的扩增体系。
[0007] 由于采用克隆技术，其遗传稳定性，经DNA检测完全与原植株相同。按本发明的技 术工艺可以生产出可扩增的、符合石斛原生植株药用有效成本的干粉，扩大市场供应量，满 足人们的需要。
[0008] 实施案例
[0009] 结合实施案例，对本发明作以阐述，但不是限制本发明的局限性。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 附图1，悬浮培养铁皮石斛胚状体生产工艺流程图 [0011] 实施例1.铁皮石斛胚状体的悬浮培养（见附图1)
[0012] 1.铁皮石斛外植体采集、灭菌：以幼嫩茎段为外植体,经过外植体消毒处理，接种 到原球茎诱导培养基上，经过一段时间的诱导，外植体膨大并产生原球茎，将诱导形成的原 球茎转移到增殖培养基中培养。基本培养基：1 / 4MS矿物盐2. 5%蔗糖和0.5%麦芽糖、 5%苹果汁、4. 5克/升琼脂粉、PH5. 8的固体培养基上。培养条件：温度（25±1) °C，光强为 20001x，光照时间12h /天。
[0013] 2.起始胚状体的诱导培养基：上述固体培养基接种好外植体三角瓶放在 25°C ±1，光照强度为20001x，光照时间12h /天，经45?50天培养后，起始胚状体在茎段 休眠芽上长出。等到5?6mm大小时，小心地将胚状体剥离的外植体，并转入到上述相同的 新配的固体培养基上，每个三角瓶中放置3-4个胚状体球，以利于形成"条件培养基"，进一 步促进胚状体球的增殖。
[0014] 3.胚状体悬浮培养基及筛选程序：
[0015] A.悬浮培养基：上述固体培养基中去除琼脂粉即成液体培养基，同上述一样条件 灭菌；
[0016] B.胚状体悬浮培养：等在上述固体培养基中长成足够量的胚状体后，将胚状体按 5% (W / W)接种率，接种到200毫升三角瓶，装液量75毫升；三角瓶用铝钼纸封口，放到 90?120转/分回转式摇床上，25°C ±1，光强为20001X，光照时间12h /天，每8天继代一 次；3?4次继代后进入筛选培养程序。注意每次继代时，倒掉一半老的培养基，补充一半 新鲜培养基，以利于形成"条件培养基"，促进悬浮培养基胚状体快速增长。
[0017] C.符合悬浮培养胚状体的筛选：经过3?4次继代后，进入筛选程序；仔细挑选结 构紧密，呈球状的、浅绿色、增殖快的胚状体，淘汰生长疏松、形态不规则的球茎。通过90? 120天的不断挑选，使每个500毫升三角瓶、200毫升液量中的培养物，在形态上一致，色泽 上相似，结构上紧密，培养液清澈的培养体系。
[0018] D.比生物生长速率
[0019] 计算公式：（收获量一接种量）+培养重量+收获时培养天数=生长速率
[0020] 本发明在实施过程经检测，其生长速率达到8-9. 5毫克/克?天。
[0021] 实施例2.胚状体无菌干粉生产（见附图1)
[0022] 为使铁皮石斛多糖含量达到16%以上，胚状体成品收获周期为7天。收获的胚状 体成品，经超净水冲洗掉外表的培养基后，室温25?27 °C晾干至鲜重含水的5 %左右，放入 55°C烘箱中，烘至绝对干重，低温超级粉碎后，辐照灭菌，即成胚状体无菌干粉。
[0023] 实施例3.铁皮石斛胚状体的多糖测定
[0024] 一、实验方法
[0025] 1、试剂配制
[0026] (1)乙醇溶液（8026)，20ml水中加入无水乙醇80ml。
[0027] (2)苯酚溶液：称取精制苯酚5.0克，加入水中溶解并稀释至100ml，混匀，备用 (溶液置4°C冰箱可保存一个月）。
[0028] (3)浓硫酸备用。
[0029] (4)葡萄糖标准储备液：精密称取在105°C干燥至恒重的葡萄糖标准品1. 00809， 加水溶解并定容至l〇〇ml，混匀，置4°C冰箱保存。此溶液每ml含10. 080mg葡萄糖。
[0030] (5)葡萄糖标准使用溶液：吸取葡萄糖标准储备液2. 00ml，置于100ml容量瓶中， 加水至刻度，混匀，置于4°C冰箱中保存。
[0031] 2、实验方法
[0032] (1)葡萄糖标准曲线制备
[0033] 精密吸取葡萄糖标准使用液0,0.2,0.4,0.6,0.8，1.0，（相当于葡萄糖0， 0. 04032,0. 08064,0. 12096,0. 16128,0. 2016mg)分别置于 25ml 比色管中准确补充水至 2. 0ml，加入苯酚溶液2. 0ml，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10ml，于旋转混匀器上 小心混匀，置沸水浴中煮沸15min，冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为 参比，lcm比色皿测定吸光度值。
[0034] 以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘标准曲线。由标准曲线回归曲线方 程图得相关系数。
[0035] 样品测定
[0036] a.样品提取
[0037] 铁皮石斛胚状体在60°C烘箱中烘干，粉碎，称取约0. lg备用。石斛粉经95%乙醇 提取后，按20倍体积水加温90°C，1小时。趁热过滤，收取滤液，减压浓缩，加4倍体积无水 乙醇混匀，4000rpm，15min离心，沉淀用80%乙醇洗2遍，最终沉淀物溶于50ml水即为石斛 粗多糖溶液。
[0038] b.多糖测定
[0039] 精密取多糖溶液2. 0ml置于25ml比色管中，加入苯酚溶液2. 0ml，在旋转混匀器上 混勻后，小心加入浓硫酸10. 〇ml后混勻，置于水浴中煮沸lOmin，冷却至室温用分光光度计 在490nm波长处，以试剂空白为参比，lcm比色皿测定葡萄糖标准溶液和样品（按倍比稀释 至合适浓度）吸光度值，做葡萄糖标准曲线图，计算样品中粗多糖含量。
[0040] C.计算方法
[0041] 根据样品的0D值从标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，乘以稀释倍数，换算成总 多糖含量，再除以烘干样品的干重，即为每克干重样品中含粗多糖的含量，单位为mg / g。
[0042] 多糖含量=0D值X稀释倍数X样品总体积/样品干重
[0043] 二、铁皮石斛多糖测定结果
[0044] 实验对不同培养天数的铁皮石斛胚状体和细胞团及其培养上清中的多糖含量进 行了定量测定.结果表明：所测材料中的多糖含量稳定，其中10至18天的胚状体多糖含量 为160-173mg / g干重：占总量的16-17. 3%。
【权利要求】
1. 一种经体外悬浮培养扩增石斛胚状体，其培养过程是：石斛带休眠芽茎段，无菌条 件下切取带节的切段，插入到1/4MS矿物盐2. 5 %蔗糖和0. 5 %麦芽糖、5 %苹果汁、4. 5克 /升琼脂粉、PH5. 8的固体培养基上。25°C ±1，生理活性在光照强度为20001x，光照时间 12h/天，经45?50天后，待起始胚状体长到6mm大小时，及时地将胚状体球剥离出外植体， 置于相同的上述培养基上扩增。扩增后转入到上述培养基去掉琼脂粉的液体培养基中，进 行悬浮培养，每瓶按5% (W/W)接种率接种，90?120转/分回转摇床生长，每8天继代一 次；经3-4次继代后；进入筛选程序，从培养物中不断挑选出浅绿色呈圆球状，生长致密、扩 增速度快的胚状体，通过90?120天连续筛选，最终达到每7天收获一次，多糖含量达到 16%以上，比生物生长速率达8-9. 5毫克/克?天，并保持周年稳定的扩增体系。
2. 权利要求1中所述石斛胚状体，其多糖含量达为16 %以上。
3. 权利要求1中所述石斛胚状体，其特征是生理活性在光照强度为20001x，光照时间 12h/ 天。
4. 权利要求1中所述石斛胚状体的培养体系，其比生物生长速率达到8?9. 5毫克/ 克?天。
5. 权利要求1中所述石斛胚状体的培养体系，其特征是可做模块化复制扩增，实现工 业化产量，达每年产量10吨以上。
6. 用权利要求1中所述石斛胚状体制备的干品以及粉末，用于中草药配方。
7. 用权利要求1中所述石斛胚状体制备的粉末，用于食品添加剂。用权利要求1中所 述石斛胚状体制备的粉末，用于功能饮料的制备。
【文档编号】A01H4/00GK104082134SQ201310743158
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】石明莉 申请人:石明莉