用于超快速冷冻精子的微流控芯片的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了用于超快速冷冻精子的微流控芯片，包括底片和盖片，所述盖片上有一字型的宽6~10um，高6~10um的通道，以及进样口和出样口，盖片和底片键合后固定。使用本实用新型的微流控芯片冷冻精子，首先可以避免异源性蛋白的干扰；其次，整个装置小而稳固，液体承载于芯片内，冷冻时外覆锡箔纸，不与液氮直接接触；再次，比cryoloop环具有更微量更精确的载液量。
【专利说明】用于超快速冷冻精子的微流控芯片
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种用于超快速冷冻精子的微流控芯片，属于医疗器械领域。
【背景技术】
[0002]随着现代社会快速进步带来的生活压力和环境污染的加重，男性生育力受到一定的影响，患有无精症和少精症的人群逐渐增加。据报道，因男方因素就诊的不孕不育夫妇中，约45%患有少精症，20%患有无精症。而对于诸如梗阻性无精子症的男性患者而言，由于ICSI技术的临床妊娠率尚未达到理想水平，所以难免需要反复多次取精。这意味着，男性患者需要忍受反复睾丸或附睾穿刺带来的痛苦，以及继而遗留的疤痕，血睾屏障的破坏等潜在风险。所以，实现微量精子的有效冷冻将解决无精或少精的患者的身心痛苦，为临床工作带来极大的便利。
[0003]细胞冷冻过程中有两个关键变化可导致损伤:过高的渗透压和胞内冰晶损伤。冷冻过程中，首先胞外溶液形成冰晶，造成活细胞外高渗透压环境，驱动水分从胞内转移至胞夕卜。若冷冻速率过慢，可使胞内绝大部分水分移出细胞，造成胞内极高电解质环境。若冷冻速率过快，胞内冰晶形成，成为解冻过程中较大冰晶重结晶位点，损伤细胞膜。目前精子常规使用慢速冷冻法进行冻存，其最理想的冷冻速率是既要保证胞内尽可能少的形成冰晶，也要保证细胞不为胞外高渗环境损伤。而这种微妙的平衡过于理想，常常因冰晶形成以及渗透压的不均衡导致冰冻损伤，细胞破裂和胞内内容物破坏。而在玻璃化冷冻中，细胞在高浓度的冷冻保护剂中超快速降温，直接从液态转变为无结构的玻璃态，而不形成冰晶，可避免冷冻过程中胞内冰晶形成对细胞的损伤，尽可能使细胞在降温过程中保持完整结构。一方面，从理论上，冷冻保护剂的浓度与冷冻速率之间负相关，即冷冻速率越快，所需要的冷冻保护剂浓度越低，可以设想，当冷冻速率接近极限快时，所需的冷冻保护剂浓度接近于零，这便是无保护剂却达到理想冷冻效果的理论基础。另一方面，精子的自身结构上具有体积小，胞浆少的特点，这保证不添加冷冻保护剂，但极快降温速率的情况下可瞬间形成玻璃样固体，却不形成冰晶。所以，只要寻找到一种体积足够小的冷冻载体，就极有希望在不添加冷冻保护剂情况下实现理想的精子冷冻。
[0004]微流控技术是一种利用几十到几百个微米尺寸的通道来处理和操纵微量流体的科学技术体系。微流控芯片以芯片为操作平台，以分析化学为基础，以微管道网络为结构特征，主要以生命科学为应用对象。聚二甲基娃氧烧(polydimethylsiloxane,PDMS)是制作微流控芯片的常用材料，具有良好的生物相容性，已有报道证实不会对生殖细胞产生不利影响。而且微流控芯片是在微米级别的微小尺寸平台上工作，可大大降低试样的消耗量。国内外学者曾采用各种不同的载体冷冻少量精子，包括鼠透明带，cryoloop环，铜环等。但这些方法均需要依赖专业显微操作，引进外源异种蛋白污染等不足。且这些方法均需要添加冷冻保护剂，而最常用的冷冻保护剂二甲基亚砜具有细胞毒性作用。
实用新型内容[0005]本实用新型所要解决的技术问题在于提供一种微流控芯片，可以实现精子无保护剂的超快速冷冻和复苏，是一种安全、简单、经济的精子冷冻新技术。
[0006]本实用新型的微流控芯片，包括底片和盖片，所述盖片的底面上有一字型的宽6?10um，高6?IOum的通道，以及进样口和出样口，所述进样口和出样口与通道连通，所述盖片和底片键合后固定。
[0007]所述通道的长度为5cm。
[0008]所述进样口和出样口的直径为1mm。
[0009]所述底片和盖片的材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
[0010]所述底片和盖片的厚度为2.5mm。
[0011 ] 所述底片和盖片的长度为4cm，宽度为3cm。
[0012]自从2002年Nawroth首次报道精子无保护剂冷冻获得成功以来，很多研究者在这方面先后作了大量研究，并一致认为，寻找到足够小体积的冷冻载体，有助于达到极高的冷冻速率，实现精子理想的无保护剂冷冻。迄今为止，国内外学者采用各种不同的载体冷冻少量精子，取得了一定的进展，包括鼠透明带，cryoloop环，铜环等等。但以上载体也存在各自的弊端。使用鼠空的透明带冻存少量精子，将无法避免外来异源性蛋白的污染，且依赖于显微操纵系统，增加了操作的复杂性。而使用cryoloop环时液量(约3μ L)承载于表面的薄膜上，薄而脆弱，且存在于液氮接触的机会。而使用本实用新型的微流控芯片冷冻精子，首先可以避免异源性蛋白的干扰；其次，整个装置小而稳固，液体承载于芯片内，冷冻时外覆锡箔纸，不与液氮直接接触；再次，比cryoloop环具有更微量更精确的载液量。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1，用于超快速冷冻精子的微流控芯片结构示意图，1-底片，2-盖片，3-通道，4-进样口，5-出样口。
[0014]图2，用于超快速冷冻精子的微流控芯片使用示意图。
【具体实施方式】
[0015]一种用于超快速冷冻精子的微流控芯片，包括底片I和盖片2，所述盖片2的底面上有一字型的宽6?10um，高6?IOum的通道3，以及进样口 4和出样口 5，所述进样口 4和出样口 5和通道3连通,所述盖片2和底片I键合后可固定。
[0016]I微流控芯片的制作及检测
[0017]1.1微流控芯片的制作
[0018]实验所用芯片自行设计(芯片构造见图1)。芯片由两层PDMS键合组成，第一层PDMS有一字形简单通道，由传统光刻制得。第二层PDMS表面平滑，无任何通道，仅起到承载的作用。为确定冷冻微量精子的通道的最佳尺寸，实验中设计10 μ m，50 μ m和IOOym尺寸高度的三种通道，其宽均为ΙΟμπι,长度为5cm。通道入口端和出口端均钻有直径为Imm的进样小孔。
[0019]1.2PDMS芯片作为精子冷冻装置的可行性检查
[0020]将一块PDMS芯片置于液氮中冻存72h后，取出于室温下复温，检查芯片表面平整度，芯片的弹性和韧度。向芯片中通入溶液，显微镜下观察芯片通道有无变形，键合面是否开裂。
[0021]2精子标本的准备
[0022]2.1精子标本收集
[0023]精液标本来自于武汉大学人民医院生殖医学中心就诊的25名男性患者，事先签署知情同意书。禁欲2-7天，手淫法取精于干燥消毒量杯中。室温液化后根据世界卫生组织精液实验室分析手册分析精液参数。其中12份标本用于精子活力，存活率和DNA完整性的指标检测，13份标本用于顶体完整检测。选用精子活动率>50%，精子计数>20X106 /ml,精液量>2ml的精液标本。
[0024]2.2梯度离心法优选精子
[0025]根据PureC印tionTM精液梯度离心法说明书进行相关离心操作。双层精子纯化液制备:离心管先加入2mL底层液(PureCeptionTM80%),上层轻缓加入2mL上层液(PureCeptionTM40%),再轻缓加入2.5mL液化的精液,350 Xg离心20min,弃上清,加入2mL精子洗涤液(PureC印tionTM，SAGE，USA，含5mg/ml HEPES-缓冲人输卵管液及人血清白蛋白)重悬，250g离心6min，加入0.5mL精子洗涤液以稀释。
[0026]3分组与冷冻
[0027]使用前,芯片使用前用无水乙醇浸泡30min，去离子水替换浸泡30min，烘干后紫外线照射半小时。将梯度离心法处理后的标本分为四组，即ΙΟμπι通道组(A组)，50μπι通道组(B组)，100 μ m通道组(C组)和常规冷冻组(D组)。A，B，C组精子进行PDMS芯片上冷冻:用连接有平口针的软管吸取含有精子的培养基，再将平口针插入进样孔，缓缓推动5 μ I微量注射器(飞鸽，上海)，将样品注入芯片通道内，可同时在显微镜下观察，直至液体充满整条通道。将芯片外部用锡箔纸平整包裹，置于液氮中进行冻存。D组精子进行常规慢速冷冻:以冻存管(Corning Costar, USA)为载体,逐滴加入等体积的商业化冷冻保护剂Quinn’s Advantagei spermatozoa Freezing Medium (SAGE,USA,成分为 lOmg/mL 人血清白蛋白，甘油，蔗糖和庆大霉素的HEPES缓冲盐溶液)，室温下平衡3min。将冻存管依次置于4°C 60min和液氮蒸气(_80°C,约液氮面上10cm) 30min,最后放入液氮中。
[0028]4精子的复苏
[0029]冻存72h后，对各组精子进行复苏。A，B, C组:从液氮中取出冻存的芯片，置于37°C温箱中孵育IOmin后，将芯片进样口和出口端连接平口针和软管，注射器内吸入培养液后连接入口端软管，出口端软管下方放置平皿，边缓缓推动注射器边于显微镜下观察，直至通道中精子完全随液流转移至平皿中(BD FALCON，USA)。以10 μ m高度通道为例，通道中
5X 10-3/ μ I液量储存1000个精子，最终ImL受精液中转移800-900个精子。D组:解冻时将冻存管从液氮中取出，37°C水浴lOmin。400 X g离心5min，弃上清，收集精子团沉淀并于ImL 受精液(Quinn，s Advantagei Fertilization HTF Universal Medium, SAGE, USA)中重悬。
[0030]5指标检测
[0031]5.1伊红Y染色法测定精子存活率
[0032]2μ L伊红Y染液与2μ L精子于载玻片上混匀，盖上盖玻片于400 X显微镜下观察。死精子染色为红色，活精子因细胞膜保持完整镜下不着色。
[0033]5.2精子活力评估[0034]采用markler板，在400 X的光学显微镜下随机取5个视野，计数所看到的精子总数和前向活动精子总数(WHO分类中的a和b级)，前向活动精子总数除以精子总数X 100%即定义为前向活动精子百分率。
[0035]5.3彗星实验测定精子DNA完整性
[0036]根据OxiSelect?彗星实验试剂盒说明书配制IX裂解液(3.65mol/L NaCl, 50mM/L EDTA)，碱性溶液(300mM/L NaOH, ImM/L EDTA)和电泳液(300mM NaOH, ImM EDTA, pH>13)。精子700 X g离心2min，弃上清，冷PBS (无Mg2+和Ca2+)洗涤，并调整精子密度为I X 105个/mL。10 μ L精子与100 μ L OxiSelect?琼脂糖混合，每孔铺板75 μ L，4°C水平放置15min，避光条件置于预冷的裂解液中30min，转移至预冷的碱性溶液30min。再将玻片置于充满电泳液的水平电泳槽中平衡20min后，以15V (lvolt/cm), 300mA室温下电泳30min。电泳结束后，玻片置于70%乙醇中5min，风干，每孔滴加I X Vista绿色DNA染液100 μ L，室温下作用15min。400X突光显微镜下观察,运用彗星实验分析软件(Comet Assay InternetGroup, http://www.casp.0f.pi)对结果进行分析处理。对于每孔，至少分析50个细胞的彗星率(CR，%)，尾长(TL，μ m)，尾部DNA比例(TD)及Oliver尾矩(0ΤΜ，尾部DNA%X尾长)。
[0037]5.4FITC-PNA染色法检测精子顶体完整性
[0038]采用FITC-PNA精子染色试剂盒(杰美基因)说明书步骤进行。精子标本600g离心5分钟，收集沉淀物，Bffff液中重悬，调整细胞浓度为lX105/mL。10 μ L精子涂片，风干，预冷的甲醛中固定2分钟。风干后，将200yL FITC-PNA染液(25 μ g/mL)均匀铺片，室温下避光孵育30分钟，轻轻加上200 μ LPBS液洗除多余染液。荧光显微镜(Olympus)lOOOX放大倍数下观察精子顶体状态，激发光480nm，发射光530nm，至少计数200个精子细胞。根据Reid分类[8]，顶体状态分为四级:1完整顶体，II和III分别为轻度和重度损伤的顶体，IV代表完全损伤的顶体。
[0039]6统计分析
[0040]计量资料以平均值土标准差表示，采用SPSS11.0统计软件进行独立t检验。P〈0.05表示比较具有统计学差异。
[0041]7 结果
[0042]7.1芯片作为精子冷冻装置的可行性检查
[0043]芯片液氮中冷冻72h并解冻后，于显微镜下观察，芯片各面平整，弹性和韧度良好，芯片上通道无变形无坍塌，双层PDMS键合面无开裂，解冻时向芯片通道通入培养液时顺畅，表明PDMS芯片可耐受液氮-196°C低温环境及37°C解冻时的温差变化，无明显形变，可作为冷冻载体的良好材料。
[0044]7.2各组精子冷冻前后活力，存活率比较
[0045]如表I所示，解冻后精子的活力和存活率均低于冷冻前。A组与D组精子解冻后活力和存活率相比无统计学差异，但随着通道高度的增加，B组和C组的存活率和活力均明显低于A组。
[0046]表I各组精子冷冻前后活力和存活率比较
[0047]
【权利要求】
1.一种用于超快速冷冻精子的微流控芯片，其特征在于，包括底片(I)和盖片(2)，所述盖片(2)的底面上有一字型的宽6?10um，高6?10um的通道(3)以及进样口(4)和出样口(5)，所述进样口(4)和出样口(5)与通道(3)连通，所述盖片(2)和底片(I)键合固定。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述通道(3)的长度为5cm。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述进样口(4)和出样口(5)的直径为1mm。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述底片(I)和盖片(2)的材质为聚二甲基硅氧烷。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述底片(I)和盖片(2)的厚度为2.5 mm η
6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述底片(I)和盖片(2)的长度为4cm,宽度为3 cm。
【文档编号】A01N1/02GK203446410SQ201320300596
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年5月28日 优先权日:2013年5月28日
【发明者】杨菁, 邹宇洁, 黄卫华, 尹太郎, 陈时靖 申请人:武汉大学