PLDε基因在增加作物氮营养高效利用及种子产量中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物分子育种和生物【技术领域】，公开了PLDε基因在增加作物氮营养高效利用及种子产量中的应用，其中，所述PLDε基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，或者与SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列相似性大于或等于60%。本发明还公开了一种增加油菜氮营养高效利用及种子产量的方法，试验证明，无论在氮饥饿或氮充足条件下，超表达AtPLDε均可以促进油菜侧根的生长与发生，并增强了油菜叶片组织细胞的生长和生物产量的提高，还可促进油菜植株的吸收转运和同化代谢过程，具体表现在超表达植株N转运相关的基因NTR1.1和NTR2.1的表达量均明显高于野生型，对氮的吸收率也显著快于野生型。
【专利说明】PLD ε基因在增加作物氮营养高效利用及种子产量中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物分子育种和生物【技术领域】，具体涉及PLD ε基因在增加作物氮营养高效利用及种子产量中的应用。
【背景技术】
[0002]氮营养的代谢与多种生物化学途径紧密相关，也是所有生物体必需的元素之一。植物从土壤中吸收硝酸盐、亚硝盐及铵盐，经转运、同化供各种代谢途径所需。许多研究表明植物根生长与N营养供给水平紧密相关。据观察，当外源硝酸盐浓度充足时，拟南芥侧根数目与正常条件下相比不会发生改变，但侧根长却比正常条件下的要增加2倍，而且这种增长要归因于植物根尖分身组织中单个细胞的增长。然而，低浓度的硝酸盐则可以刺激植物侧根数目的增加。此外，N营养的缺乏也降低了作物的光合作用效率，因此，为了提高作物的产量，氮肥的使用量正在逐年增加。然而，过多的氮肥的施用使得地下水及地表水中的N元素浓度严重超标，江河、湖泊中的赤潮及藻类泛滥的现象也频繁地发生。因此，减少氮肥的使用和提高作物对N营养的利用效率已经成为了提高作物产量和减少N富营养化对环境污染的重要策略。
[0003]植物通过硝酸盐还原酶和亚硝酸还原酶将硝酸盐还原为铵离子，细胞再将铵离子利用并使N最终进入植物代谢过程中。拟南芥中，有4种转运蛋白与硝酸根的转运与吸收有关，它们分别是NRT1.1 (CHLl)，NRT1.2，NRT2.1,和NRT2.2 ;另有4种铵根转运蛋白(ΑΜΤ1.1, 1.2，1.3，1.5)也可促进植物直接从土壤中吸收铵盐。植物的N代谢受到硝酸盐及N代谢产物的调控，且硝态氮及其代谢产物可能参与N信号过程。拟南芥ANRl基因缺失导致植株对硝酸盐的敏感性发生了改变，并且在高N条件下，突变体植株的侧根伸长受到抑制。此外，高浓度的铵盐也可以抑制植物根的生长。拟南芥中有2种硝态氮吸收系统，分别是高亲和性和低亲和性系统。植物从外界吸收的硝态氮首先在胞质内由NR将其还原成亚硝态氮，然后亚硝态氮在质体中由NiR再一`次将其还原为植物可以直接利用的铵态氮，铵态氮的同化则主要是通过谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合成酶途径来完成。植物对N营养的吸收需要有N转运蛋白及N信号传感器的参与才能完成，因此细胞膜在N营养的转运中也起着重要的作用。然而，关于细胞膜如何介导N转运蛋白结合并转运N营养的途径，以及植物细胞膜如何传递并调节植物对N营养信号的响应机理尚不清楚。
[0004]磷脂双分子层是细胞膜的主要骨架，在细胞响应外界刺激的过程中起着重要的调节作用。磷脂酶D (PLD)是一类催化水解膜磷脂的重要的磷脂酶，它可以通过影响膜磷脂成分及结构来改变细胞膜对外界刺激的响应。研究表明，在磷缺乏时，PLD ζ s缺失的植株可以减少主根的生长和促进侧根的延伸，其根内的PC的含量降低、DGDG的含量升高(Li etal.，2006a)，且突变体 PLD ζ 2 根中 PA 的含量降低(Li et al.，2006a, Li et al.，2006b)，这些数据说明PLD ζ s可以通过水解细胞膜上的PC来完成细胞膜糖脂的合成并通过控制根的生长发育来调节植物对外界磷信号的响应。PLD ε和PLD ζ s 一样，它们都可以调控植物对外界环境中营养的应答并影响植物根的生长。然而，不同的是PLDe调控的是植物对外界N营养信号的应答，而PLD ζ s则是调控植物对外界P营养信号的应答。在N营养缺乏条件下，PLDe缺失突变体根的生长受阻，而超表达PLDe则促进根生长，而超表达PLD ε的植株则表现出在不同氮浓度条件下都可以促进侧根的伸长及侧根数目的增加，但是却只能在氮营养缺乏时促进主根的生长。
[0005]拟南芥基因组含有的12个PLDs，其序列特征、生化特性、生理功能各不相同(Wanget al., 2006, Qin and Wang, 2002)。通过分析不同PLD突变体表明，某一特定PLD基因的缺失突变，其生物学功能难于被其它PLD所补偿，说明植物的PLD家族的生物学复杂多样，且各具特色。最近的研究发现磷脂酶D的新成员PLDe参与了氮信号的感知和植物生长的调控。据分析，PLDe的序列最为独特，尽管其转录水平相对较低，但其活性范围比其它的PLD更广，在微摩尔至毫摩尔的Ca2+浓度(μ M-mM Ca2+)条件下都有活性，可水解多种磷脂底物包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)及磷脂酰丝氨酸(PS)而产生信号分子PA。通过基因剔除和超表达分析发现了这一独特的磷脂酶PLD ε参与了氮信号感知并调节植物的生长，在氮肥充足的条件下，超表达(overexpression,缩写0Ε)拟南芥植株的生物产量比对照野生型增加80%，而在氮素缺失的条件下，PLD ε剔除突变体(pld ε -1)的植株生长(包括根的生长)受到明显抑制，而超表达植株的生长却比野生型快，而用PA形成的抑制剂正丁醇则消除了超表达、突变体与野生型之间的表型差异。这些结果表明拟南芥PLD ε及其产生的PA在氮的感知和植物生长具有正调控作用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为了进一步探索PLD ε是否能够应用于作物改良，提高植物氮营养的高效利用。将花椰菜花 叶病毒启动子35S调控下的PLDe基因导入了春性油菜品种Westar中，分析超表达AtPLD ε (从模式植物拟南芥中克隆的PLD ε基因)的油菜材料在氮营养的吸收、利用和同化过程中的效应，及其对植株生长发育和油脂产量、品质的影响，为作物氮高效高产的分子育种奠定基础、创造新种质材料。
[0007]其中，所述PLDe基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者与SEQ ID Ν0:1所示的核苷酸序列相似性大于或等于60%。
[0008]一种增加油菜氮营养高效利用及种子产量的方法，包括以下步骤:
[0009]I)种子的灭菌及萌发:将油菜种子灭菌消毒后播种到M0培养基中，25°C下暗光培养5天得幼苗；
[0010]2)农杆菌的培养:挑取含有从模式植物拟南芥中克隆的PLD ε基因质粒的农杆菌单菌落放到含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中培养1_2天，离心，倒掉上清，用等体积的DM溶液重悬菌体并将菌液稀释10倍；
[0011]3)外植体的制备和侵染:切取步骤I)的幼苗的下胚轴，将其在步骤2)配制好的菌液中侵染30min，使切口充分和菌液接触；
[0012]4)愈伤组织的培养:将侵染后的外植体转到已灭菌的吸水纸上，待残留的菌液吸干后将外植体转到M1培养基中，25°C下暗光培养2天；然后转移到M2培养基中，在25°C下光照培养3周；再转移到M3培养基中，以后每2-3周继代一次，直至长出绿芽；将绿芽切下并转入到M4培养基中，生根2-4周，得转基因油菜幼苗并将其移栽到大田，[0013]其中，各培养基和DM溶液的配方及PH值如下:
[0014]M0 培养基:2.2g/L MS 粉末，10g/L 琼脂粉，pH 值为 5.8-6.0 ；
[0015]M1培养基:4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，lmg/L2，4-二氯苯氧乙酸，0.3mg/L激动素，100 μ M乙酰丁香酮，6g/L琼脂糖，pH值为5.8 ;
[0016]M2培养基:4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，lmg/L2，4-二氯苯氧乙酸，
0.3mg/L激动素，30 μ M硫代硫酸银，300mg/L羧苄青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L琼脂糖，pH值为5.8 ；
[0017]M3 培养基:4.4g/L MS 粉末，10g/L 葡萄糖，0.25g/L 木糖，0.6g/L2_(N_ 吗啉代)乙磺酸，2mg/L玉米素,0.lmg/L吲哚乙酸,300mg/L羧节青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L琼脂糖，pH值为5.8 ；
[0018]M4培养基:4.4g/L MS粉末，10g/L蔗糖，300mg/L羧苄青霉素，9g/L琼脂粉，pH值为 5.8 ;
[0019]DM 溶液:4.4g/L MS 粉末，30g/L 蔗糖，100 μ M 乙酰丁香酮，pH 值为 5.8。
[0020]本发明的积极效果:
[0021]1.无论在氮饥饿或氮充足条件下，超表达AtPLDe (从模式植物拟南芥中克隆的PLD ε基因)均可以促进油菜侧 根的生长与发生，并增强了油菜叶片组织细胞的生长和生物
广量的提闻。
[0022]2.在田间生长条件下，超表达AtPLDe可促进油菜营养生长、花期延迟，并导致OE单株种子产量高于野生型，多不饱和脂肪酸含量提高。
[0023]3.AtPLD ε可促进油菜植株的吸收转运和同化代谢过程，具体表现在OE植株N转运相关的基因NTR1.1和NTR2.1的表达量均明显高于WT，对氮的吸收率也显著快于野生型，OE植株体内调控氮同化代谢的硝酸还原酶(NR)和亚硝酸还原酶(NiR)活性也相应地高于野生型植株。
[0024]4.在氮饥饿条件下，超表达AtPLDe可促进油菜衰老叶片中的有机物质向新叶转运，提闻植株体内营养物质的闻效再利用。
[0025]5.在氮饥饿条件下，超表达AtPLD ε植株的叶片MGDG含量降低，并伴随着PC及PI含量的升高，表明PLD ε参与氮饥饿下的膜脂代谢过程。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1，PLD ε超表达载体构建模式图。
[0027]图2，将0.3mM N条件下生长14天的植株转移到3mM N条件下时，PLD ε -OECPLD ε超表达植株)和WT植株对N营养的吸收效率曲线图。其中，N营养液每周更换一次。
[0028]图3，PLD ε -OE和WT材料分别在0.3、3及15mM N营养液中生长11天后，检测植株叶片蛋白消耗N03_和N02_的速度来检测植株中NR及NiR酶的活性。期间，培养液每周更换一次。**表示与WT比较时，学生t值显示具有极显著性(P <0.01)。
[0029]图4，PLD ε -OE及WT植株在0(Η20)、3和7.5mM N中生长7天后的根及下胚轴长、侧根数及长度。*和**分别表示与WT比较时，学生t值显示具有显著性(P < 0.05)和极显著性(P < 0.01)。
[0030]图5，PLD ε -OE及WT植株在田间生长到143天时的表型。[0031]图6，PLD ε -OE及WT单株植物的种子产量。英文字母表示用Duncan’ s多因素方差分析时(p〈0.05)的显著性差异。
【具体实施方式】
[0032]实施例1:油菜遗传转化(暗光培养法)
[0033]种子的灭菌及萌发:用75%酒精浸泡种子Imin后，用无菌水将种子冲洗一遍。然后用0.15%的HgCl2 (含0.1% (v/v) Tween20)消毒15min,再用无菌水冲洗3-5次；然后将种子播种到Mtl培养基中，每皿(直径为3cm)均匀播种18粒种子。将培养皿放到无菌的塑料培养盒中，暗光条件下25°C培养5天。
[0034]农杆菌的培养:挑取农杆菌(GV3101，含有AtPLDa I基因质粒的菌株，通过商业途径购买)单菌落放到LB液体培(含50mg/L Km)养基中培养1_2天，最佳的侵染OD值为0.6-0.8。通过分光光度计检测菌液在600nm吸收光条件下的浓度，当OD值为0.6-0.8时将培养好的菌株在离心机中6000rpm离心IOmin,倒掉上清；用等体积的DM (DilutionMedium)液体重悬，再在同样的条件下离心一次；弃上清,再用等体积的DM溶液悬浮。取2ml菌液，用20ml的DM溶液稀释(1:10)(在灭菌的培养皿中进行)。
[0035]外植体的制备和侵染:用无菌的镊子和解剖刀切取暗光培养的幼苗的下胚轴，每个外植体的长度均匀为0.8cm左右，保持外植体的切口整齐。将切好的外植体浸泡在已经配制好的菌液中，侵染30min，期间用移液器吸打4-5次，使切口充分和菌液接触。
[0036]愈伤组织的培养:将侵染后的外植体转到已灭菌的吸水纸上，待残留的菌液被吸干后将外植体转到M1培养基中，每皿40-50个外植体，在同样的暗光条件下共培养2天；将共培养后的外植体转移到M2培养基中，在25°C、光照条件下进行培养。以后的培养均在光照条件下进行(25°C) ;3周后的外植体的愈伤组织基本上脱分化，将其转到M3培养基中，以后每2-3周继代一次，直至长出绿芽；将生长有明显基节的绿芽切下并转入到生根培养基中，生根2-4周；从根生长良好的幼苗上取少量叶片,用shorty buffer法提取叶片DNA,并用PCR检测植株中是否有PLD ε的插入；选择少量未转化成功的幼苗作为野生型(WT)，和PLDal超表达的苗一起移栽到大田并自交留种，以便为后续试验提供材料来源。
[0037]其中，各培养基和DM溶液的配方及PH值如下:
[0038]M0 培养基:2.2g/L MS 粉末，10g/L 琼脂粉，pH 值为 5.8-6.0 ；
[0039]M1培养基:4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，lmg/L2, 4_ 二氯苯氧乙酸，
0.3mg/L激动素，100 μ M乙酰丁香酮，6g/L琼脂糖，pH值为5.8 ;
[0040]M2培养基:4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，lmg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸，
0.3mg/L激动素，30 μ M硫代硫酸银，300mg/L羧苄青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L琼脂糖，pH值为5.8 ；
[0041]M3 培养基:4.4g/L MS 粉末，10g/L 葡萄糖，0.25g/L 木糖，0.6g/L2_(N_ 吗啉代)乙磺酸，2mg/L玉米素,0.lmg/L吲哚乙酸,300mg/L羧节青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L琼脂糖，pH值为5.8 ；
[0042]M4培养基:4.4g/L MS粉末，10g/L蔗糖，300mg/L羧苄青霉素，9g/L琼脂粉，pH值为 5.8 ;
[0043]DM 溶液:4.4g/L MS 粉末，30g/L 蔗糖，100 μ M 乙酰丁香酮，pH 值为 5.8。[0044]实施例2:PLD ε转基因植株的鉴定及表达
[0045](I)PLD ε转基因植株的鉴定
[0046]经过农杆菌侵染转化的植株在仏培养基中诱导生根后，取适量的叶片提取DNA，用引物35S-p/PLD ε -A对叶片DNA进行PCR检测，同时以质粒作为正对照，以WT的DNA为负对照，以判断植株中是否成功转入AtPLD ε基因。部分转化植株PCR产物的电泳结果显示出大部分植株都可以扩增出与质粒为模板的PCR产物大小一致片段，而仅有2个转化植株及WT的DNAPCR后没有目标片段出现，说明了农杆菌GV3101介导的PLD ε质粒已经成功地转化到油菜中。
[0047]在上述方法中，所用引物对的核苷酸序列如下所示:
[0048]弓丨物对35S-p/PLD ε -A:
[0049]正向引物35S-p5' -GAAGACGTTCCAACCACGT-3'，
[0050]反向引物PLDe-A5' -CTCGTCGTTCCACAACATTA-3'。
[0051](2)转PLD ε基因植株RNA的表达
[0052]为了观察AtPLDe在转基因植株中的RNA的表达量，提取了转化植株叶片的总RNA,并用2%的琼脂糖胶检测了 RNA的完整性。观察到mRNA中的18s及28s均可清晰显现。用分光光度计对RNA进行浓度检测后，按浓度倍数将其稀释一致且用DNaseI降解其中的DNA，然后用cDNA逆转录试剂盒合成第一链cDNA，并用BnActin基因调节cDNA的浓度至一致，通过半定量PCR分析PLD ε的转录水平。分别用BnActin及AtPLD ε的特异性引物BnRT-actin-F/R、At RT- ε -F/R对反转录出的cDNA进行PCR检测，PCR产物在琼脂糖胶上电泳后紫外成像仪下成像。结果表明WT反转录出的cDNA中检测不到AtPLD ε目标片段，多数再生植株(卡那霉素抗性)均表达了外源的AtPLD ε mRNA片段。为进一步确认转化植株的表达量，通过Real time PCR对其RNA`进行了相对定量分析，发现在这些株系中AtPLD ε RNA的表达量比野生型上升了 150-700倍。这些数据表明了 AtPLDe基因在多数转化油菜株系中得到超表达。
[0053]在上述方法中，所用分子标记引物对的核苷酸序列如下所示:
[0054]引物对BnRT-actin-F/R:
[0055]正向引物BnRT-actin-FS' -TGTTCCCTGGAATTGCTGACCGTA-3'，
[0056]反向引物BnRT-actin-RS' -TGCGACCACCTTGATCTTCATGCT-3'。
[0057]引物对At RT-ε-F/R:
[0058]正向引物At RT-ε-F5' -GGGACACCGAGATTGCAATAGGTT-3'，
[0059]反向引物At RT-ε-R5' -AGCGATAACCGGTAAGCTTGGA-3'。
[0060](3)转基因植株蛋白质的表达
[0061]PLD ε与HA及eYFP标签连接表达融合蛋白。为了验证AtPLD ε-OE株系中有AtPLD ε蛋白的表达，从油菜叶片中提取了蛋白质，由于油菜中PLDe表达量较低，在用粗蛋白进行抗体杂交时PVDF膜上没有产物被显色出来。因此，Iml的粗蛋白被纯化和浓缩后，再与抗体进行杂交，结果发现多个株系都有符合大小的蛋白产物出现，且产物的亮度与Real-time的结果比较吻合，即RNA表达量越高的株系其对应蛋白产生的底物就越多。这些结果表明AtPLDe在转基因油菜中表达成功。
[0062]利用AtPLD ε -OE及WT植株发芽4天的幼苗的侧根被置于荧光显微镜下，当将显微镜的荧光曝光时间调制300ms时，OE植株的根的细胞壁四周可以看到明显的黄色荧光信号，而WT植株的根部则基本上没有信号产生。此结果进一步证明了 AtPLDe蛋白在油菜中得到表达。
[0063]实施例3 =PLD ε -OE植株增加N营养的吸收利用及种子产量
[0064](I)氮转运蛋白基因NRT1.1及NRT2.1的表达量分析
[0065]为了检测PLD ε对N营养的吸收利用，用Real-time对植物中与N营养转运有关的基因NTR1.1及NTR2.1的表达量进行了分析，数据表明:在氮严重缺乏(0.3mM N)条件时，0E24-2和0E37-2植株叶片中的NTR1.1表达量显著高于野生型，分别是对应WT植株的
4.5及1.5倍，而根中的则分别为1.5和1.3倍。当植株生长于氮供给的正常水平(3mM N)条件下，OE中的NTR1.1的表达量是野生型40和26倍，根中的表达量则为0.7和1.9倍。在氮缺乏(0.3mM)条件下，0E24-2和0E37-2植株叶片中NTR2.1的表达量分别是WT的6.5和4.9倍，根中为5和2.3倍；而当植株生长在3mM条件下时，0E24-2和0E37-2植株叶片中的NTR2.1表达量分别是WT中的35和10倍，根中的为4.7和2倍。此结果表明了不管在低浓度还是高浓度N营养条件下，OE植株叶及根中的N营养转运相关蛋白的基因表达量均高于其对应的WT植株，此数据暗示了在油菜中超表达PLD ε可显著促进氮的转运。
[0066](2) N营养的吸收效率
[0067]上述结果表明OE植株中与氮转运相关基因的表达量显著高于其对应WT，为分析其是否对N营养的吸收产生影响，因此通过测试培养液中Ν03_减少的速度，以测定OE植株是否具有较高的N营养吸收 能力。结果表明:与对应的WT植株相比，PLDe-OE植株明显具有高效吸收N营养的能力，特别是在24h后，OE植株显示出比对应的WT多吸收32.7%的NO3-(图 2)。
[0068](3) PLD ε -OE植株中NR及NiR酶活性增强
[0069]由于OE植株中的NO3-吸收和转运增强，因此分别测定了植物叶片中的NO3-还原酶(NR)及NOf还原酶(NiR)的活性。发现在0.3、3及15mM N营养条件下，PLD ε -OE植株中NR的活性始终极显著地高于其对应的WT植株。然而，PLD ε -OE植株中NiR的活性仅于低N(0.3mMN)条件下才极显著地高于其对应的WT，在正常或高N (3、15mM N)条件下，PLD ε-OE植株中NiR的活性与其对应的WT植株中的NiR活性无显著性差别或者是不同OE株系之间表现较大差异，如在3mM N条件下，NiR活性在0E2-2中比对应WT高，在0E37-2中却比对应WT低，而在0E24-2中则与对应WT无差别(图3)。此结果暗示着:在低N条件下，PLD ε的超表达可以提高OE植株中NR和NiR的活性；而在正常或高N条件下，PLD ε的超表达仍然可以提高OE植株中NR的活性，但是却不能改变NiR的活性。综上结果，在氮缺乏条件下油菜表达AtPLD ε显著促进了氮的吸收、转化和同化，增强了植株对氮的利用。
[0070](4) PLD ε -OE植株老叶中花青素含量增加和绿素含量降低
[0071]植物N营养吸收速率中的植株在低N (0.3mM N)条件下生长14天后，OE材料老叶(第3、4片叶)颜色与对应的WT植株相同部位的叶片颜色明显不同。因此，用0.1M的HCl提取了 OE及WT的第3片叶的花青素，并用分光光度计测量了花青素含量。结果表明从OE材料中提取的花青素含量明显高于WT，0E2-2和0E24-2植株的花青素含量分别是WT的4.3和8.4倍。
[0072]同时，分析植株老叶和新叶(第I片叶)中的叶绿素的含量表明OE植株的新叶叶绿素a、b及c含量显著或极显著地高于WT植株，特别是叶绿素b的含量。然而，在衰老叶片中，OE植株的叶绿素a、b及c的含量却比对应的WT植株要低。这些结果表明PLD ε -OE材料在N缺乏条件下，植株老组织的衰老加快。此现象可能暗示着PLD ε -OE植株在低N条件胁迫时，通过加速植物老组织的衰老来提供新组织生长所需的营养，从而尽可能地维持植株的正常生存。
[0073](5)植株生物产量的变化
[0074]由于PLD ε -OE植株氮吸收高于WT植株，因此将PLD ε -OE及WT植株种植到含0.3、1.5、3及7.5禮N的MS培养液中生长，观察其生物产量的变化。30天后，分别统计植株的叶及根的鲜重和干重发现:生长在0.3mM N条件下的0E24-2叶片的鲜重及干重均比对应的WT分别提高51.8%和65.4%，而0E37-2则分别增加38.7%和34.4%。而根的鲜重及干重在0E24-2中要比其WT的分别增加37.8%和27.2%，但是在0E37-2中则与WT无显著差别。当植株在1.5mM N条件下生长时，0E24-2叶片的鲜重及干重要比对应WT的分别高46%和69.5%，0E37-2植株则分别提高17.9%和14.7% ;此时，根的鲜重及干重在0E24-2中要比其WT的分别增加79.5%和79.7%,而0E37-2植株则比WT提高48.7%和42.2%。
[0075]将植株生长在3mM N条件下时，0E24-2叶片的鲜重及干重要比对应WT的分别增加33.4%和31.4%，0E37-2植株则分别提高33.9%和26.9%。而此时，根的鲜重及干重在0E24-2中要比其WT的分别增长了 13.2%和28.5%,而0E37-2植株则比WT增加27.8%和28.7%。随着在N浓度增加到7.5mM时，0E24-2叶片的鲜重及干重要比对应WT的分别增加38.5%和64.7%，0E37-2植株则分别提高13.3%和17.6% ;而此时，根的鲜重及干重在0E24-2中要比其WT的分别增加57.2%和26.1%，而0E37-2植株则比与WT的无显著差别。
[0076]以上数据说明在氮缺乏或N正常条件下，OE植株均表现出比WT植株积累的更多生物产量更多或者持平，而且生物产量的积累并非随着N营养浓度的增加而增加，而是当植物生长在3mM N条件下时生物产量积累出现峰值，暗示着对于油菜栽培而言，最适宜的N浓度条件可能在3mM左右。 而且，OE与WT植株的生物产量积累在氮浓度为1.5mM的条件下差异最大。
[0077](6) PLD ε -OE植株叶面积、侧根数及长度增加
[0078]为分析导致OE与WT植株生物产量出现差异的原因，对植物的叶片及根的形态进行了分析。对生长在0.3、0.5、1.5、3及7.5禮N条件下15天后的植株进行观察，发现不同N浓度条件下，OE植株生长始终快于其对应的WT植株。30天后，测量植株相似部位、相同叶龄的完全伸展叶片的宽度及长度，并计算叶面积。结果表明在不同N浓度条件下，OE材料叶片宽度及面积几乎都极显著高于其对应的WTJS OE材料的叶片数量与WT植株之间没有显著差别。显微镜下观察叶片表皮细胞及叶肉细胞的大小，结果显示OE叶片表皮细胞及叶肉细胞的大小分别为对照WT的2倍，但超表达PLD ε对叶片组织中的粗蛋白含量的影响甚小，OE与WT之间无显著差别。实验数据表明超表达AtPLDe可显著促进植物细胞的生长，进而增强植株生长，提高生物产量。
[0079]前期观察发现超表达PLD ε可促进根的生长，本研究还分析了生长于不同氮浓度(0、3、7.5mM N)营养液中PLD ε -OE及WT植株的根形态。结果发现OE植株的侧根数均显著多于对应的WT，且侧根长度也明显增长，PLD ε-OE植株的侧根长在O (Η20)、3和7.5mMN的营养液中分别是其对应的WT植株侧根长的2-2.8,2.4-3.5及2.6-4.1倍。PLD ε -OE植株的侧根数在O (H20)、3和7.5mM N的营养液中则分别是其对应的WT植株的侧根数的
1.6-7、1.7-4及2.4-8.4倍，而主根长度则没有明显差异。此外，OE植株幼苗下胚轴在整体上却比其对应的WT显著性地变短(图4)。由此可见，超表达PLDe可以促进侧根数及侧根长度，从而提高植株对N营养的吸收利用，促进植株生长。
[0080](7) PLD ε影响植物花期及生长
[0081]为了观察PLD ε -OE植株在大田中的生长状况，按照随机区组的方法将PLD ε -OE纯合体植株0Ε2-2、0Ε37-2及0Ε38-2与共分离的WT植株一起种植于田间。植株在田间生长到第55和105天时，OE植株明显地比对应的WT植株高大，同时观察到第55天的OE植株的第3叶片宽度及叶面积均显著大于WT。0Ε2-2、0Ε37-2及0Ε38-2叶片宽度分别比其对应的WT增加38%、34%和25%，而除0Ε2-2外，其它OE材料的叶片数与WT相比基本相同。当植株在田间生长到143天时，WT进入开花期，而OE株型仍大于WT植株(图5)。同时还观察到OE材料的花期较WT推迟，当WT开花率为80%时，OE材料0Ε2-2、0Ε37-2及0Ε38-2的开花率分别仅为0、20%和60%。PLD ε -OE材料的盛花期较WT推迟了 17-18天。由此表明超表达PLD ε可能延长花期，保证植株有更充足的营养生长。
[0082]收获PLD ε -OE及WT成熟的植株并考察其相关农艺性状，数据表明:0Ε2-2、0Ε37_2及0Ε38-2材料的株高分别比其对应WT增长7%、10%和17%，但是0Ε2-2及0Ε37-2植株的主花序长度却显著短于其对应的WT，而0Ε38-2植株的主花序长度则比WT长。此外，0Ε2-2及0Ε38-2的有效分枝数分别比其对应的WT增加30%和21% ;且0Ε2_2、0Ε37_2及0Ε38-2植株的主花序上的角果数分别比其对应WT增加29%、20%和43%，整个植株的角果总数则分别比对应WT植株提高73%、34%和98%。此数据暗示着PLD ε的超表达可促进油菜的有效分枝和角果总数，从而提高单株种子产量。
[0083](8) PLD ε影响植物种子产量及油分
[0084]由于PLD ε -OE植株的角果数多于WT，因此调查了植株的角果长度、角果种子粒数、种子千粒重及植株单产。结果表明0Ε37-2及0Ε38-2的角果长度分别比其对应WT植株增长53%和16%，而0Ε2-2则与WT的无差别；而0Ε2-2和0Ε38-2植株的角果种子粒数分别比其对应的WT植株增加27%和49%，0Ε37-2则与WT无差别。种子的千粒重的数据则显示除了 0Ε37-2比WT的高外，另外两个OE材料的千粒重都显著地低于WT。基于上述各个性状的调查结果，0Ε2-2、0Ε37-2及0Ε38-2植株的种子单株产量分别比其对应WT增产了 61%、105%和194%(图6)。综上所述，超表达PLDe导致的单株产量的增加源于多种产量性状的累加，包括有效分枝数、角果长度和角果数。
[0085]超表达PLD ε显著提高了油菜的种子产量，其是否对油脂含量和品质产生影响值得关注。通过GC分析不同OE株系收获的种子含油量及其组分，结果发现除了 0Ε25植株的种子含油量表现出高于WT外，其余5个PLD ε -OE株系的种子含油量与WT没有显著差异。但OE种子油脂组分与WT存在明显差异，OE材料种子油脂组分中多不饱和油酸(C18:2和C18:3)含量高于WT，而其饱和或单不饱和脂肪酸的积累(Λ ( I)却低于WT。同时，OE材料的油脂二十碳烯酸(C20:l)和芥酸(C22:l)的含量也显著低于WT，且有些OE株系的软脂酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)及油酸(C18:l)的含量也低于WT。由此初步了解到超表达PLD ε对种子总油脂含量没有明显影响，却改变了种子油脂组分，即OE材料种子的亚油酸(C18:2)及亚麻酸(C18:3)的含量增加，而饱和或单不饱和脂肪酸(Λ ( I)的含量降低。[0086](9) PLD ε -OE植物叶片脂成分发生变化
[0087]为了调查PLD ε对植物脂代谢的影响，提取了生长在0.3mM N条件下植物叶片的脂质，用LC/MS进行量化分析，结果表明OE植株中的单半乳糖甘油二酯(MGDG)含量显著低于其对应的WT植株，而OE植株叶片中的PC及PI的含量却高于WT。进一步分析发现引起MGDG含量减少主要是其酰基种类C34:5、C36:4及C36:5的降低所致。而PC含量的增加是由C34:3、C36:2、C36:5和C36:6这些成分的增加而引起的，PI中的C34:2、C34:3和C36:3的含量则在不同的OE叶片中略高于WT。`
【权利要求】
1.PLD ε基因在增加作物氮营养高效利用及种子产量中的应用，其中，所述PLD ε基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,或者与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相似性大于或等于60%。
2.一种增加作物氮营养高效利用及种子产量的方法，其特征在于:将在花椰菜花叶病毒启动子35S调控下的PLD ε基因，通过转基因手段将其整合到作物基因组中。
3.一种增加油菜氮营养高效利用及种子产量的方法，其特征在于包括以下步骤: .1)种子的灭菌及萌发:将油菜种子灭菌消毒后播种到M0培养基中，25°C下暗光培养5天得幼苗； .2)农杆菌的培养:挑取含有从模式植物拟南芥中克隆的PLDε基因质粒的农杆菌单菌落放到含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中培养1_2天，离心，倒掉上清，用等体积的DM溶液重悬菌体并将菌液稀释10倍； . 3)外植体的制备和侵染:切取步骤I)的幼苗的下胚轴，将其在步骤2)配制好的菌液中侵染30min，使切口充分和菌液接触； .4)愈伤组织的培养:将侵染后的外植体转到已灭菌的吸水纸上，待残留的菌液吸干后将外植体转到M1培养基中，25°C下暗光培养2天；然后转移到M2培养基中，在25°C下光照培养3周；再转移到M3培养基中，以后每2-3周继代一次，直至长出绿芽；将绿芽切下并转入到M4培养基中， 生根2-4周，得转基因油菜幼苗并将其移栽到大田， 其中，各培养基和DM溶液的配方及PH值如下: M0培养基:2.2g/L MS粉末，10g/L琼脂粉，pH值为5.8-6.0 ； M1培养基:4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，lmg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸，.0.3mg/L激动素，100 μ M乙酰丁香酮，6g/L琼脂糖，pH值为5.8 ; M2培养基:4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，lmg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸，.0.3mg/L激动素，30 μ M硫代硫酸银，300mg/L羧苄青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L琼脂糖，pH值为5.8 ； M3培养基:4.4g/L MS粉末，10g/L葡萄糖，0.25g/L木糖，0.6g/L2_ (N-吗啉代)乙磺酸，2mg/L玉米素,0.lmg/L吲哚乙酸,300mg/L羧节青霉素，25mg/L卡那霉素，6g/L琼脂糖，pH值为5.8 ； M4培养基:4.4g/L MS粉末，10g/L蔗糖，300mg/L羧苄青霉素，9g/L琼脂粉，pH值为5.8 ;DM溶液:4.4g/L MS粉末，30g/L蔗糖，100 μ M乙酰丁香酮，pH值为5.8。
【文档编号】A01H5/00GK103773798SQ201410007520
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月8日 优先权日:2014年1月8日
【发明者】鲁少平, 王学敏, 洪月云 申请人:华中农业大学