一种诱导橡胶树叶片衰老的方法
【专利摘要】本发明公开了一种诱导橡胶树叶片衰老的方法。本发明方法包括如下步骤：1）将橡胶树叶片置于液体A中浸泡30-180s；所述液体A为添加有表面活性剂的乙烯利溶液，所述乙烯利在所述液体A中的终浓度为5μM-0.5M；2）将步骤1）浸泡过的所述橡胶树叶片用透明塑料袋密封，18-36h后去袋；3）直至所述橡胶树叶片中叶绿素含量低于未经所述液体A浸泡处理的对照橡胶树叶片中叶绿素含量时，即获得橡胶树衰老叶片。实验证明，本发明达到诱导叶片衰老的效果，且该方法不仅避免了橡胶树自然衰老叶片的获取受季节限制的缺陷，同时具成本低、操作简单、周期短、单次处理可获得大量均一性材料等优点，可满足相关分子生物学研究需要，具良好的现实意义和应用价值。
【专利说明】一种诱导橡胶树叶片衰老的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及一种诱导橡胶树叶片衰老的方法，具体是一种应用乙烯利溶液处理橡胶树叶片进而诱导叶片衰老的方法。
【背景技术】
[0002]植物衰老(senescence)是指植物细胞、组织、器官或整个植株生理功能的逐渐衰退，是长期进化和自然选择的结果，是一个高度调控的细胞程序性死亡(Progra_ed celldeath，P⑶)过程。目前关于植物衰老的研究主要集中在叶片上，且大多集中于拟南芥、水稻、烟草等模式植物。在叶片的衰老过程中，细胞结构、生理生化代谢以及基因表达调控等都发生很多变化。在形态上，叶片因叶绿素的降解而呈现为黄色(Ougham H, HortensteinerS，Armstead I, et al.The control of chlorophyll catabolism and the status ofyellowing as a biomarker of leaf senescence.Plant Biol (Stuttg),Suppl 第 I期,4-14 页,2008; Hortensteiner S, Krautler B.Chlorophyll breakdown in higherplants.Biochim Biophys Acta,第 1807卷，第8期，977-988页，2011),这一典型特征为相关研究提供了极大的便利；在分子水平，叶绿素的降解常伴随着一些标记分子如AtSAG12等半胱氨酸蛋白酶表达水平的显著上升、AtCABl等叶绿素a/b结合蛋白表达水平的显著下调。由于叶片衰老是一种受内源信号和多种环境因素共同调控的、极其复杂的生物学过程，至今我们对叶片衰老的分子网络仍知之甚少。
[0003]橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.Arg.),又叫巴西橡胶树或三叶橡胶树，是一种隶属于大戟科(Euphorbiaceae)的高大乔木。橡胶树原产于亚马逊河流域，目前作为一种特种经济作物在东南亚、中国和非洲等部分国家和地区广泛移植。生产上，橡胶(顺-1，4-聚异戊二烯)通过用胶刀周期性地切割树皮(内含乳管——一类橡胶生物合成与存贮的特异细胞)收集胶乳而获得。死皮(其主要类型为割面干涸，Tapping Panel Dryness,TPD)是指橡胶树割胶过程中出现的割线局部或整体不排胶现象，它会造成严重减产甚至完全绝收，是目前生产上影响橡胶产量的关键因素(邹智，杨礼富，王真辉，等.橡胶树“死皮”及其防控策略探讨.生物技术通报，第9期，8-15页，2012)。据统计，目前全球因死皮而停割的橡胶树约占开割树的12-15%;我国橡胶树的死皮发生率约为25%，部分胶园甚至超过50%，其中，仅死皮停割率就接近15%，并且每年以1-3%的速度递增，每年给我国造成的经济损失已超过30亿人民币。最近的细胞和分子生物学证据表明，死皮与植物的细胞程序性死亡现象非常相似(Li DJ, Deng Z, Chen SC, et al.1dentification andcharacterization of genes associated with tapping panel dryness from Haveabrasiliensis latex using suppression subtractive hybridization.BMC Plant Biol,第10卷，第I期，140页，2010)，虽然如此，由于种种原因，深入开展死皮发生的分子机制研究面临着严峻的挑战:(1)橡胶树为多年生高大乔木，传统育种周期在30年以上；(2)橡胶树的遗传转化周期在I年以上，且转化技术至今仍不是非常成熟(邹智，杨礼富，王真辉，等.巴西橡胶树转基因研究现状与展望.中国生物工程杂志，第30卷，第I期，85-92页，2010) ；(3)死皮与橡胶生产紧密相关，只有割胶后才能鉴定其症状，而橡胶树的非生产期一般在8年左右(邹智，杨礼富，王真辉，等.橡胶树“死皮”及其防控策略探讨.生物技术通报，第9期，8-15页，2012)； (4)死皮症状的鉴定需要多年的割胶和数月的跟踪观测，不利于大批量地获得实验材料；(5)与产排胶相关的乳管组织位于树干的次生韧皮部，诱导获取实验材料属于破坏性实验，这对生产周期在25年以上的橡胶树来说是莫大的损失；(6)乳管组织无法分离进行离体培养和诱导；(7)遗传转化体系成熟的模式植物如拟南芥、烟草等无乳管组织，对死皮相关基因的鉴定主要依赖叶片等组织(Peng SQ1Wu KX, HuangGX, et al.HbMybl, a Myb transcription factor from Hevea brasiliensis, suppressesstress induced cell death in transgenic tobacc0.Plant Physiol Biochem,第49卷，第12期，1429-1435页，2011)，而这无法避免物种不同所带来的差异；(8)橡胶树属于多年生的热带雨林植物，衰老叶片主要见于冬季的落叶，采样时间受限太大；(9)除利用自然衰老叶片的报道(邹智，杨礼富，安锋，等.橡胶树AtCABl同源基因的克隆及其在稳定与衰老期叶片中的差异分析.热带农业科学，第33卷，第4期，30-35页，2013)外，橡胶树上至今还未见其它有关叶片衰老诱导体系的报道。
[0004]因此，在橡胶树上建立一套高效、可重复的叶片衰老诱导体系成为开展死皮相关基因功能鉴定的重要保障。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种诱导橡胶树叶片衰老的方法。
[0006]本发明所提供的诱导橡胶树叶片衰老的方法，具体可包括如下步骤:
[0007](I)将橡胶树叶片置于液体A中浸泡30-180S (如30_120s，再如30_60s，具体如30s、60s、120s 或 180s)；
[0008]所述液体A为添加有表面活性剂的乙烯利溶液，所述乙烯利在所述液体A中的终浓度为 5 μ M-ο.5Μ (如 50 μ M-5mM 或 5mM_0.5M,具体如 5 μ Μ、50 μ Μ、500 μ M、5mM、50mM、500mM)；
[0009](2)将步骤(1)浸泡过的所述橡胶树叶片用透明塑料袋密封，18-36h (具体如24h)后去袋；
[0010](3)直至所述橡胶树叶片中叶绿素含量显著地低于未经所述液体A浸泡处理的对照橡胶树叶片中叶绿素含量时，即获得橡胶树衰老叶片。
[0011]在所述方法中，所述表面活性剂在所述液体A中的终体积百分含量可为
0.02-0.05% (具体如 0.02%)ο
[0012]在所述方法中，所述表面活性剂是指具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列，并能使表面张力显著下降的物质。在本发明中，所述表面活性剂具体为吐温-20。
[0013]在所述液体A中，所述乙烯利溶液的溶剂为能够溶解乙烯利并促进乙烯释放的液体。
[0014]在本发明中，所述乙烯利溶液的溶剂具体为去离子水。
[0015]在所述方法中，所述橡胶树叶片为处于成熟期(又叫稳定期或墨绿期)的活体橡胶树叶片。以长势一致的橡胶树组培幼苗的成熟期叶片为佳，且同批次叶片最好具有相同的叶绿素含量。[0016]在本发明中，步骤(1)中，将所述橡胶树叶片置于所述液体A中浸泡的时间具体为30-60s (如60s或30s);所述乙烯利在所述液体A中的终浓度具体为5mM。
[0017]相应的，步骤(3)中，所述橡胶树叶片中叶绿素含量显著地低于所述对照橡胶树叶片的时为:所述橡胶树叶片中叶绿素含量降低为所述对照橡胶树叶片中叶绿素含量的40-60% (如50%)时(由于此时的叶片在形态上比较典型，将处于此时的叶片定义为衰老中期，而〈40%的定义为衰老早期，>60%的定义为衰老晚期)；具体为:自步骤(1)中将所述橡胶树叶片用所述液体A浸泡处理后的第72h后。
[0018]在本发明中，步骤(3)中，所述叶绿素含量具体是通过采用便携式叶绿素测定仪SPAD-502PLUS (日本柯尼卡美能达)进行测定的。
[0019]在本发明中，所述橡胶树具体为橡胶树品种热研7-33-97 (又叫CATAS7-33-97或RY7-33-97)。
[0020]本发明的另一个目的是提供一种诱导橡胶树叶片衰老的液体。
[0021]本发明所提供的诱导橡胶树叶片衰老的液体，具体为添加有表面活性剂的乙烯利溶液；
[0022]所述乙烯利在所述液体中的终浓度为5 μ Μ-0.5Μ (如50 μ M_5mM或5mM_0.5M，具体如5 μ Μ、50 μ Μ、500 μ M、5mM、50mM、500mM);所述表面活性剂在所述液体中的终体积百分含量可为0.02-0.05% (具体如0.02%)ο
[0023]所述表面活性剂是指具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列，并能使表面张力显著下降的物质。在本发明中，所述表面活性剂具体为吐温-20。
[0024]所述乙烯利溶液的溶剂为能够溶解乙烯利并促进乙烯释放的液体。在本发明中，所述乙烯利溶液的溶剂具体为去离子水。
[0025]所述橡胶树叶片为处于成熟期(又叫稳定期或墨绿期)的活体橡胶树叶片。以长势一致的橡胶树组培幼苗的成熟期叶片为佳，且同批次叶片最好具有相同的叶绿素含量。
[0026]在本发明中，所述橡胶树具体为橡胶树品种热研7-33-97。
[0027]以上所有的所述乙烯利均可以是固体，也可以是不同浓度的原液，具体如浙江省绍兴市东湖生化有限公司生产的40% (m/v)的乙烯利原液(农药登记号为Η)84125-12)。
[0028]以上所有的所述乙烯利溶液配制后的放置时间不超过12h，以现配现用为佳。
[0029]在本发明中，以上所有的所述橡胶树叶片衰老，均具体体现在如下中的至少一种:
[0030](a)叶绿素含量降低，如所述述橡胶树叶片中叶绿素含量降低40-60% ；
[0031](b)叶片出现黄化，如所述橡胶树叶片中黄化部位比例为40-60% ；
[0032](c)衰老标记基因(如HbCABl基因)表达水平的下调。
[0033]本发明采用适量的含有表面活性剂的乙烯利溶液浸泡处理橡胶树的叶片，达到了诱导叶片衰老的效果。该方法不仅避免了橡胶树自然衰老叶片的获取受季节限制的缺陷，同时具有成本低、操作简单、周期短、单次处理可以获得大量均一性材料等优点，可以满足相关分子生物学研究的需要，具有良好的现实意义和应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1为顶层叶片已成熟的橡胶树组培幼苗。[0035]图2为处理3d后的成熟期橡胶树叶片。A:为用O μ M乙烯利溶液浸泡过的对照；B:为用5mM乙烯利溶液浸泡过的处理。[0036]图3为橡胶树衰老相关标记基因HbCABl的半定量RT-PCR分析。A:为HbCABl基因扩增25个循环的产物；B:为18S rRNA扩增18个循环的产物；1:为对照样品；2:为乙烯利诱导的衰老叶片样品。
【具体实施方式】
[0037]以下实施例用于对本发明做进一步地说明，但不用来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所做的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
[0038]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040]橡胶树品种热研7-33-97:记载于“黄华孙，梁茂寰，吴云通，等.中规模推广级橡胶树优良品种热研7-33-97的选育.热带作物学报，第15卷，第2期，1-6页，1994”一文，公众可从中国热带农业科学院橡胶研究所获得。
[0041]实施例1、本发明乙烯利浸泡法诱导橡胶树叶片衰老
[0042]一、本发明乙烯利浸泡法诱导橡胶树叶片衰老的条件优化
[0043](一)诱导液中乙烯利浓度的确定
[0044]1、诱导液的配制
[0045]取一定量40% (m/v)的乙烯利原液(浙江省绍兴市东湖生化有限公司生产，农药登记号为PD84125-12)用去离子水溶解后，分别配制成O μ Μ、5 μ Μ、50 μ M、500 μ M、5mM、50mM、500mM的溶液各300mL，然后分别往每份溶液中加入吐温_20(CAS号为9005-64-5)，至其终浓度均为0.02% (v/v)，混均后备用。这样，得到7份不同浓度乙烯利的诱导液。
[0046]2、乙烯利浸泡法诱导橡胶树叶片衰老
[0047]选取长势与图1中幼苗一致、顶层叶片完全绿化(即顶层叶片处于成熟期，初始叶绿素含量基本一致，如64.1±1.1SPAD)的橡胶树组培苗(品系来源为热研7-33-97)，分7组，每组10株。分别用步骤I配制的7份不同浓度乙烯利的诱导液浸泡幼苗的顶层叶片60s，然后迅速用透明塑料袋密封，24h后去袋，定期观察叶片的黄化情况，并用便携式叶绿素测定仪SPAD-502PLUS (日本柯尼卡美能达生产)定期测定叶片的叶绿素含量，以叶片变黄且叶片中叶绿素含量较对照(O μ M乙烯利处理样本)显著降低(Ρ〈0.05)作为初步判断衰老诱导成功的标准。
[0048]结果显示:
[0049](I)叶片形态
[0050]橡胶树叶片经含有500mM乙烯利的诱导液浸泡处理后Ih就出现少量的坏死褐斑。浸泡处理24h后，500mM的处理样本出现大量的坏死褐斑,50mM的处理样本出现少量的坏死褐斑，而其它处理无明显变化。浸泡处理48h后，500mM的处理样本虽然存在大量的坏死褐斑，但褐斑外的其它部位呈现比对照叶片更暗的绿色，而50mM、5mM、500 μ Μ、50 μ M的处理样本已微微发黄，5 μ M的处理样本和对照(O μ Μ)相比无明显变化。浸泡处理72h后，500mM和50mM的处理样本已多数落叶，其中前者呈墨绿色，后者呈浅黄色；5πιΜ、500μΜ、50μΜ的处理样本已明显发黄。浸泡处理96h后，5mM的处理样本已多数落叶，500 μ M、50 μ M的处理样本也部分落叶，5 μ M的处理样本和对照仍无明显变化。其中，浸泡处理72h后，5mM乙烯利处理样本和对照(O μ M)的叶片形态如图2所示，5mM乙烯利处理样本的叶片黄化比例大约为50%。
[0051](2)叶绿素含量
[0052]SPAD-502PLUS便携式叶绿素测定仪的测定结果表明(表1)，浸泡处理72h后，5mM处理样本的叶绿素含量(34.7±0.3SPAD)约降为对照(64.1±1.1SPAD )的1/2，500μΜ和50 μ M的处理样本则在3/4到1/2之间，5 μ M的处理样本和对照无明显变化。
[0053]表1浸泡处理72h后不同诱导液处理样本的叶绿素含量测定结果
[0054]
【权利要求】
1.一种诱导橡胶树叶片衰老的方法，包括如下步骤: (1)将橡胶树叶片置于液体A中浸泡30-180S； 所述液体A为添加有表面活性剂的乙烯利溶液，所述乙烯利在所述液体A中的终浓度为 5 μ M-ο.5Μ ； (2)将步骤(1)浸泡过的所述橡胶树叶片用透明塑料袋密封，18-36h后去袋； (3)直至所述橡胶树叶片中叶绿素含量低于未经所述液体A浸泡处理的对照橡胶树叶片中叶绿素含量时，即获得橡胶树衰老叶片。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述表面活性剂在所述液体A中的终体积百分含量为0.02-0.05%。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述为表面活性剂为吐温-20。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述液体A中，所述乙烯利溶液的溶剂为能够溶解乙烯利并促进乙烯释放的液体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述乙烯利溶液的溶剂为水。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述橡胶树叶片为处于成熟期的活体橡胶树叶片。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:步骤(1)，将所述橡胶树叶片置于所述液体A中浸泡的时间为30-60s ;和/或 所述乙烯利在所述液体A中的终浓度为5mM。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:步骤(3)中，所述橡胶树叶片中叶绿素含量低于未经所述液体A浸泡处理的对照橡胶树叶片中叶绿素含量时，为:所述橡胶树叶片中叶绿素含量降低为所述对照橡胶树叶片中叶绿素含量的40-60%时。
9.一种诱导橡胶树叶片衰老的液体，为添加有表面活性剂的乙烯利溶液； 所述乙烯利在所述液体中的终浓度为5 μ M-ο.5Μ ;所述表面活性剂在所述液体中的终体积百分含量为0.02-0.05%。
10.根据权利要求9所述的液体，其特征在于:所述表面活性剂为吐温20。
【文档编号】A01N57/20GK103907638SQ201410106701
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月21日 优先权日:2014年3月21日
【发明者】邹智, 龚俊, 杨礼富 申请人:中国热带农业科学院橡胶研究所