专利名称：拟南芥AtJAZ7蛋白及其编码基因在调控植物叶片衰老中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种拟南芥AtJAZ7蛋白及其编码基因在调控植物叶片衰老中的应用。
背景技术：
衰老是植物生长发育、形态建成和对环境应答反应中ー个必要的、主动的过程，是受内外因子直接或间接影响的ー种器官或组织逐步走向功能衰退和死亡的变化过程，认识衰老原因，推迟衰老起始或延缓衰老进程，尤其防止早衰发生具有重要意义。叶片是植物进行光合作用的重要器官，在植物生长发育过程中起重要作用。植物的叶片衰老是ー种程序性的细胞死亡(Programmed Cell Death, P⑶)，是叶片发育的最终阶段。这ー过程对于植物营养物质从叶子到发育的种子中重新分配至关重要。在农业生产中，作物的衰老与产量 有着密切的关系，研究裳老相关的功能基因对于提闻作物广量具有重要的意义。
发明内容
本发明的ー个目的是提供拟南芥AtJAZ7蛋白的新用途，该蛋白质的氨基酸序列如序列表序列2所示，所述新用途为序列表序列2所示蛋白可用于调控目的植物叶片的衰老进程，或调节序列表序列2所示蛋白表达量的物质或方法可用于调控目的植物叶片的衰老进程。本发明的另ー个目的是提供一种延缓植物叶片衰老的方法，是将序列表序列2所示蛋白的编码基因导入目的植物中，得到叶片衰老程度低于所述目的植物的转基因植物。在上述方法中，所述叶片衰老程度低于所述目的植物表现为经黑暗诱导的所述转基因植物的叶片中叶绿素含量高于经所述黑暗诱导的所述目的植物，和/或经所述黑暗诱导的所述转基因植物的叶片中过氧化氢含量低于经所述黑暗诱导的所述目的植物；所述黑暗诱导具体可为进行连续黑暗培养，所述连续黑暗培养的时间根据目的植物及其发育时期以及处理方法的不同而不同，在本发明的实施例中，采用连续黑暗培养幼苗时期的拟南芥植株120小时(即5天)或在连续黑暗条件下用水浸泡苗期的拟南芥离体叶片168小时(即7天)。在上述方法中，所述序列表序列2所示蛋白的编码基因为如下I)或2)或3)的基因I)其核苷酸序列是序列表序列I所示的DNA分子；2)与I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且编码序列表序列2所示蛋白的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码序列表序列2所示蛋白的DNA分子。
所述严格条件可为如下50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M Na3PO4和ImMEDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0. 1%SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,O. 5MNa3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，I X SSC, O. 1%SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,O. 5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，O. 5XSSC,O. 1%SDS 中漂洗；还可为50°C，在 7% SDS,O. 5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，O. I X SSC,O. 1%SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,O. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65。。，O. 1XSSC,0. 1%SDS中漂洗；也可为:在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2X SSC, O. 1%SDS 和 1XSSC,0. 1%SDS 各洗膜一次。在上述方法中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。在上述方法中，所述双子叶植物为拟南芥。在本发明的实施例中，所述目的植物为拟南芥纯合T-DNA插入AtJAZ7基因的突变体 jaz7。
实验证明，黑暗培养5天后，拟南芥纯合T-DNA插入AtJAZ7基因的突变体jaz7的叶片颜色变黄程度较其它株系显著，而过表达株系叶片变黄程度较野生型拟南芥WT轻，将AtJAZ7基因导入突变体jaz7获得的表达AtJAZ7基因的补偿体与WT无显著差异；无论在正常光照还是在黑暗培养条件下，突变体jaz7叶片中的H2O2含量都明显高于野生型WT叶片中的H2O2含量。突变体jaz7的离体叶片经黑暗处理7天，叶绿素含量为WT的60%，补偿体和过表达株系与WT无显著差异。本发明为提高作物产量和培育抗早衰植物提供了ー种新的途径，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
图I为重组载体PCAMBIA 1300-AtJAZ7的T-DNA区结构示意图。其中，JAZ7代表序列表序列I的基因，LB和RB分别代表T-DNA的左臂和右臂，Nos Term代表胭脂碱合酶终止子,35s promoter代表花椰菜花叶病毒35s启动子，Hygromycin代表潮霉素磷酸转移酶基因。图2为拟南芥T-DNA插入突变体WiscDsLox7Hll的插入位置示意图。其中，灰色粗框为AtJAZ7基因的外显子片段。图3为T3代纯合转基因拟南芥植株中AtJAZ7基因相对表达量結果。图4为T3代纯合转基因拟南芥植株的黑暗诱导表型。左侧两排培养钵为正常光照条件下的对照处理表型，右侧两排的培养钵为黑暗诱导5天处理表型；从上到下四排培养钵依次为突变体jaz7、补偿体、WT和过表达株系植株。图5为突变体jaz7和WT拟南芥植株经黑暗诱导后叶片中的H2O2含量測定結果。图6为T3代纯合转基因拟南芥植株离体叶片经黑暗诱导后的叶片表型。其中，图A为各株系植株离体叶片在黑暗诱导60小时和168小时的表型，图B为各株系植株离体叶片在黑暗诱导60小时和168小时后的DAB染色表型。图7为T3代纯合转基因拟南芥植株离体叶片经黑暗诱导后的叶绿素含量测定结果O
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、利用拟南芥AtJAZ7蛋白及其编码基因延缓植物叶片的衰老I、拟南芥AtJAZ7基因的获得用50 μ mol/L茉莉酮酸甲酷(MeJA) 水溶液喷淋幼苗时期的野生哥伦比亚生态型拟南芥Col-O (https://abrc. osu. edu/)，6小时后，取植株茎叶利用TRIZOL试剂提取总RNA,并以总RNA为模板，使用M-MLV反转录酶进行反转录得到cDNA，再以此cDNA为模板，在弓丨物CDS-PF和引物CDS-PR的引导下，进行PCR扩增，将获得的扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化450bp左右的DNA片段，对该片段进行测序，结果表明，该DNA片段含有序列表序列I所示的核苷酸序列。序列表序列I所示的447bp核苷酸序列为拟南芥AtJAZ7蛋白的开放阅读框，编码序列表序列2所示的由148个氨基酸组成的拟南芥AtJAZ7蛋白，自氨基端(N端)第61-89位氨基酸残基为TIFY功能域，第120-144位氨基酸残基为JAS功能域，这两个保守的功能域对于JAZ行使其功能起决定性作用。序列表序列I所示的核苷酸序列所对应的拟南芥基因组DNA序列为拟南芥第二号染色体从14，580，159bp到14，580，935bp位核苷酸序列。上述引物⑶S-PF和引物⑶S-PR的序列如下引物CDS-PF 5，-GCTCTAGAATGATCATCATCATCAAAAACTGC-3，(带下划线碱基为限制性内切酶XbaI识别位点及保护碱基)；引物CDS-PR 5，-GGGGTACCCTATCGGTAACGGTGGTAAG-3，(带下划线碱基为限制性内切酶KpnI识别位点及保护碱基)。2、拟南芥AtJAZ7基因重组表达载体的构建取步骤I回收并纯化的450bp左右的DNA片段，用限制性内切酶XbaI和KpnI双酶切，与经XbaI和KpnI双酶切的载体pCAMBIA 1300的骨架片段连接，获得重组载体pCAMBIA1300-AtJAZ7,经测序证实，重组载体 pCAMBIA 1300_AtJAZ7 为载体 pCAMBIA1300 的 XbaI 和KpnI位点间插入了序列表序列I所示核苷酸序列，重组载体pCAMBIA1300-AtJAZ7的T-DNA区结构示意图如图I所示。3、重组农杆菌的获得取步骤2制备得到的重组载体pCAMBIA 1300_AtJAZ7转化农杆菌GV3101的感受态细胞(中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)，28°C于含100 μ g/ml卡那霉素和50 μ g/ml利福平的YEB固体培养中筛选培养；挑取阳性克隆提质粒，用步骤I不含下划线碱基的引物⑶S-PF和引物⑶S-PR进行PCR检测；PCR鉴定呈阳性的克隆即为含有重组载体PCAMBIA 1300-AtJAZ7 的重组农杆菌，命名为 GV3101/PCAMBIA 1300_AtJAZ7。4、转基因拟南芥的获得用步骤3的重组农杆菌GV3101/PCAMBIA 1300_AtJAZ7浸花法分别侵染野生哥伦比亚生态型拟南芥Col-O (https://abrc.osu.edu/)(简称为WT)和拟南芥纯合T-DNA插入AtJAZ7基因的突变体jaz7 (简称为jaz7)，获得T3代纯合转PCAMBIA 1300_AtJAZ7的WT株系(简称为过表达株系)和T3代纯合转PCAMBIA 1300_AtJAZ7的jaz7株系(简称为补偿体株系)，具体转化方法如下I)将WT和jaz7的种子培养至植株开花后，剪去主枝顶端，促进侧枝发展。
2)取步骤3的重组农杆菌GV3101/PCAMBIA 1300_AtJAZ7接种于5ml YEB液体培养基(含100 V- g/ml卡那霉素和50 μ g/ml利福平)中，摇菌过夜,第二天转瓶至500mlYEB液体培养基中，28°C培养至OD6tltl为I. 5-3. O ;离心收集菌体，用10%蔗糖溶液稀释至OD6tltl为O. 8-1.0，得到侵染液。3)将步骤I)剪枝后4 6天的拟南芥植株倒置于侵染液中浸泡；取出种植盘，用充满气的黑色塑料袋包住，平放，21°C下暗培养24小时后去掉塑料袋将种植钵直立。恢复光照和温度按正常方法培养植株至结实，收获成熟的T1代种子。4) \代种子消毒后，用无菌水清洗6— 7次，平铺于含50mg/L卡那霉素的MS固体培养基上在正常条件下培养，获得卡那霉素抗性植株(抗性表现为正常生长，敏感表现为死亡)，单株收获抗性植株上的种子继续按照同样的方法筛选，最后得到T3代不再产生卡那霉素抗性分离的纯合过表达株系8个和补偿体株系4个，用步骤I中不含下划线碱基的引物⑶S-PF和引物⑶S-PR进行PCR检测，结果均呈阳性。 T1代表示转化当代植株自交产生的种子及由它所长成的植株；T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株；τ3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。上述拟南芥纯合T-DNA插入At JAZ7基因的突变体jaz7的获得方法如下I)在 TIAR 网站(http://www. arabidopsis. org/)查找 AT2G34600 的突变体，选择T-DNA插入突变体WiscDsLox7Hll (图2)，种子编号CS849196，从拟南芥资源库ABRC购买该突变体种子。2)突变体种植种子经10%次氯酸钠消毒15min，再用无菌水洗涤5次，种在MS培养基上，4度春化3天后，在温室中培养10天左右(温室条件温度18-22度，光照120umol/(m2 · s)，相対湿度65%)，将幼苗转移到营养土 蛭石=1 1中生长。3)待幼苗生长3周左右，单株剪叶片，提取基因组DNA。采用SALK网站(http://signal, salk. edu/)提供的引物鉴定突变体T-DNA是否在两条染色体上都有插入，即是否为纯合插入突变体。引物RP (5，-ACCCATTTTAGGAGACCGTTG-3’ )总是被设定位于T-DNA插入片段的3’端在该基因上的一段核苷酸序列，引物LP (5’ -GGTACACCGCGGATTAAAATC-3’)位于基因另一端,LP+RP用以扩增该基因片段；引物LB(5’-AACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC-3’)位于T-DNA左端的一段核苷酸序列，LB+RP用以检测是否有T-DNA插入基因组。因此，若该株突变体用两对引物扩增，只有LB+RP扩增到目的DNA片段，说明该株幼苗为纯合体；若只有LP+RP能扩增到目的DNA，说明该株幼苗为野生型；若二者都能扩增得到DNA片段，则该株幼苗为杂合体。保留纯合体继续生长繁种，得到拟南芥纯合T-DNA插入AtJAZ7基因的突变体jaz7。5、转基因拟南芥株系植株的实时荧光定量PCR鉴定取同一正常培养环境中生长四周的、步骤4获得的T3代纯合转基因株系过表达和补偿体植株以及jaz7和WT植株的叶片，用TRIZOL试剂分别提取总RNA，LiCl沉淀纯化后测定浓度及0D260/280和0D260/230值，严格定量后进行反转录，稀释得到浓度为2ng/μ I的cDNA，再以此cDNA为模板，以AtJAZ7基因特异引物MJZ5-F和MJZ5-R为引物进行实时荧光定量PCR扩增，分析各株系植株内AtJAZ7基因的表达情況，以18sRNA为内參基因，引物为18s-F和18s-R。实时荧光定量PCR在ABI PRISM* 7000实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和SchmittgenTD (2001)报道的方法，即2_Δ Δετ计算相对表达量。Δ Δ Ct- (CT.Target — Ct Actin) Timex — (CT.Target — CT.Actin) Time0Time x表示任意时间点，Time ^表示经actin校正后I倍量的目标基因表达。AtJAZ7基因的特异引物序列如下(靶序列为序列表序列I的第325-426位)MJZ5-F :5’ -ATCCCAAACAATTC GACTCG-3’(序列表序列 3 所示)；MJZ5-R :5’ -GGAAGTTGCTTGAATCCGAA-3’(序列表序列 4 所示)；18sRNA基因的特异引物序列如下18s-F :5，-GCTTTGGTGACTCTAGATAAC-3，；18s-R :5’-GTCGGGAGTGGGTAATTTGC-3’。结果如图3所示，AtJAZ7基因的突变体jaz7不表达AtJAZ7基因，补偿体与WT的AtJAZ7基因相对表达量接近，过表达株系的AtJAZ7基因相对表达量明显高于其他株系。6、转基因拟南芥株系植株的叶片衰老表型鉴定I)黑暗诱导下的叶片衰老实验将jaz7和WT以及步骤4获得的T3代纯合转基因株系过表达和补偿体的植株在同一正常条件下(光照16小时，黑暗8小时，温度为21°C)培养，苗期放置于完全避光的黑暗条件下培养5天，以正常光照培养的处理为对照，观察表型(如图4所示)，同时用Amplex Red过氧化氢/过氧化氢酶检测试剂盒(Invitrogen,商品目录编号A22188)检测各处理不同株系植株莲座叶片中H2O2含量(结果如表I和图5所示)，每个处理3-4次重复，每个重复内每个株系测4-5株。表I. T3代纯合转基因植株经黑暗诱导5天叶片中H2O2含量測定结果(単位μ M/mg)
权利要求
1.序列表序列2所示蛋白在调控目的植物叶片衰老进程中的应用。
2.一种延缓植物叶片衰老的方法，是将序列表序列2所示蛋白的编码基因导入目的植物中，得到叶片衰老程度低于所述目的植物的转基因植物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述叶片衰老程度低于所述目的植物表现为经黑暗诱导的所述转基因植物的叶片中叶绿素含量高于经所述黑暗诱导的所述目的植物，和/或经所述黑暗诱导的所述转基因植物的叶片中过氧化氢含量低于经所述黑暗诱导的所述目的植物。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述序 列表序列2所示蛋白的编码基因为如下I)或2)或3)的基因 1)其核苷酸序列是序列表序列I所示的DNA分子； 2)与I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且编码序列表序列2所示蛋白的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码序列表序列2所示蛋白的DNA分子。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述双子叶植物为拟南芥。
全文摘要
本发明公开了一种拟南芥AtJAZ7蛋白及其编码基因在调控植物叶片衰老中的应用。实验证明，黑暗培养5天后，拟南芥纯合T-DNA插入AtJAZ7基因的突变体jaz7的叶片颜色变黄程度较其它株系显著，而过表达株系叶片变黄程度较野生型拟南芥WT轻，将AtJAZ7基因导入突变体jaz7获得的表达AtJAZ7基因的补偿体与WT无显著差异；无论在正常光照还是在黑暗培养条件下，突变体jaz7叶片中的H2O2含量都明显高于野生型WT叶片中的H2O2含量。突变体jaz7的离体叶片经黑暗处理7天，叶绿素含量为WT的60%，补偿体和过表达株系与WT无显著差异。本发明为提高作物产量和培育抗早衰植物提供了一种新的途径，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
文档编号C12N15/84GK102732559SQ20121019337
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月12日 优先权日2012年6月12日
发明者于娟, 张群莲, 徐文英, 苏震, 邸超 申请人:中国农业大学