利用玉米秸秆酶解液制备促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的方法
【专利摘要】本发明公开了利用玉米秸秆酶解液制备促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的方法。该方法，包括：(1)将玉米秸秆在180-200℃和1.0-2.0Mpa条件下进行水热处理，得到经过预处理的玉米秸秆；(2)将所述经过预处理的玉米秸秆粉碎后，用纤维素酶进行酶解，分别收集酶解液和酶解残渣；（3）用所述酶解液、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水配制发酵培养基，每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为20-50g；(4)向所述发酵培养基中接入牡丹抗病促生菌进行发酵，发酵结束后收集发酵液，将所述发酵液和所述酶解残渣混合，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂。
【专利说明】利用玉米秸秆酶解液制备促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及利用玉米秸杆酶解液制备促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的方法。
【背景技术】
[0002]牡丹归芍药科(Paeoniaceae)、芍药属(Paeonia)，一直以来都是中国最重要的观赏植物和药用植物之一，已有1600多年的历史。目前，牡丹在国内的主要栽培地点为荷泽、洛阳、北京、临夏、天彭、铜陵等。近年来，牡丹的油用价值日渐凸显，油用牡丹的发展呈现出快速扩张的态势。对于观赏牡丹来讲，一个突出的问题是，由于不同地区气候环境和土壤性质的差异造成的土壤微生态活性降低，是引种地区栽培牡丹生长状况不良、观赏性状下降的重要原因之一。而对于油用牡丹，如何科学施肥并显著提高牡丹籽的产量则是非常迫切的问题。在牡丹的栽培过程中，还面临着一些真菌病害的威胁，主要有灰霉病(Botrytispaeoniae)、红斑病(Cladosporium aeoniae)和褐斑病(Cercospora paeoniae)等。因此，研制促进牡丹生长并拮抗病原菌的微生物菌剂具有显著和迫切的现实意义。其中，筛选对牡丹兼具促生和拮抗病原菌功能的植物促生细菌菌种资源是限制微生物菌剂发展的重要瓶颈因素。
[0003]目前大多数菌剂的发酵都采用淀粉质原料，但我国耕地资源紧张，粮食生产压力巨大，难以支撑庞大发酵工业的可持续发展。因此，需要寻找更丰富的可再生资源作为生产原料以用于菌剂的生产。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的一个技术问题是提供一种缩短生产周期并且菌体含量达到淀粉质原料生产水平的制备促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的方法。
[0005]本发明所提供的制备促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的方法，包括:
[0006](I)将玉米秸杆在 180-2000C (如 180°C或 200°C )和 1.0-2.0Mpa (如 1.0Mpa 或
2.0Mpa)条件下进行水热处理，得到经过预处理的玉米秸杆；
[0007](2)将所述经过预处理的玉米秸杆粉碎后，用纤维素酶进行酶解，分别收集酶解液和酶解残渣；
[0008](3)用所述酶解液、(NH4)2S04、MgSO4, CaCO3、玉米浆和水配制发酵培养基，每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为20-50g (如20g)；
[0009](4)向所述发酵培养基中接入促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌进行发酵，发酵结束后收集发酵液，将所述发酵液和所述酶解残渣混合，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂。
[0010]上述方法中，所述(I)中，所述水热处理时间可为10-20min (如1min或20min)。
[0011]上述方法中，所述(2)可为将所述经过预处理的玉米秸杆粉碎后，按以干重计每克秸杆加入10-15FPU (纤维素酶活单位)(如15FPU)的比例加入纤维素酶，在55-80°C (如55°C )、pH为4.8-5.0的条件下在水中酶解24_48h (如48h)，得到玉米秸杆酶解物，将所述玉米秸杆酶解物进行离心，分别收集上清液和沉淀，所述上清液即为所述酶解液，所述沉淀即为所述酶解残渣。
[0012]上述方法中，所述(3)中，每升所述发酵培养基中，(NH4)2SO4的含量为10g，MgSO4的含量为0.4g、CaCO3的含量为6g、玉米浆的含量为2g。
[0013]上述方法中，所述(4)中，所述发酵液和所述酶解残渣可按照1:1的质量比进行混合。
[0014]上述方法中，所述(2)中，所述粉碎是将所述经过预处理的玉米秸杆粉碎至50-100 目。
[0015]上述方法中，所述促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymy xa) CSM1101,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.8527。
[0016]上述方法中，所述(4)在30°C培养18-30小时(如24_30小时)进行发酵。在本发明的一个实施方式中，在所述发酵培养基中培养14小时时补加所述酶解液，使发酵培养基中的葡萄糖含量为20g/L，继续培养16小时结束发酵；在本发明的另一个实施方式中，在所述发酵培养基中培养24小时结束发酵。
[0017]由上述方法制备的促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂及该菌剂的用途也属于本发明的保护范围。
[0018]本发明所提供的促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的用途，所述用途为下述CD-C3)中任一种:
[0019]Cl)促进牡丹生长和拮抗病原菌；
[0020]C2)促进牡丹生长；
[0021]C3)拮抗病原菌。
[0022]上述用途中，所述促进牡丹生长可体现为下述BI) -B7)中的任一种:
[0023]BI)缩短牡丹种子生根时间；
[0024]B2)提高牡丹种子生根率；
[0025]B3)缩短牡丹种子的发芽时间；
[0026]B4)提高牡丹种子的发芽率；
[0027]B5)提高牡丹的主根长度；
[0028]B6)提闻牡丹苗闻；
[0029]B7)提高牡丹幼苗生物量；
[0030]所述拮抗病原菌可为拮抗牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉(Cladosporium paeoniae)和苟药杂色尾抱霉菌(Cercospora varricolor Winter)中的三种、任两种或任一种。所述提高牡丹幼苗生物量体现为提高牡丹幼苗的鲜重或干重。
[0031]本发明还提供了一种利用促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂促进牡丹生长的方法。
[0032]本发明所提供的促进牡丹生长的方法，包括在生根前将浸种后的牡丹种子用所述促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂处理1-3小时(如I小时)再进行生根培养的步骤。
[0033]上述方法中，将浸种后的牡丹种子用所述菌剂处理的方式因所述菌剂的物理状态而异，如果所述菌剂为液态，直接用所述菌剂浸泡所述浸种后的牡丹种子即可，所述菌剂中的所述多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa) CSMl 101的含量可为18Cfu/ml-109cfu/ml (如109cfu/ml);如果所述菌剂为固态,需要向所述菌剂中加水制成液体菌剂，再用该液体菌剂浸泡所述浸种后的牡丹种子，所述液体菌剂中的所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) CSMl 101 的含量可为 108cfu/ml-109cfu/ml (如 109cfu/ml)。
[0034]上文中，所述牡丹可为凤丹(Paeonia ostii)。
[0035]本发明以玉米秸杆作为发酵生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的原料，针对淀粉质原料发酵蒸煮、液化等预处理高能耗的缺点，采用水热处理技术、纤维素酶酶解技术对玉米秸杆进行预处理，具有如下特点:1、采用水热处理技术对玉米秸杆进行预处理，省去了淀粉质原料长时间的蒸煮过程，降低了发酵生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的能耗，缩短了生产周期。2、采用玉米秸杆酶解液替代淀粉质原料发酵生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂，其活菌数可达2.58X101(lCfu/mL，芽孢生成率为80%以上，达到了淀粉质原料的生产水平；玉米秸杆酶解残渣直接作为促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的载体，提高了玉米秸杆的综合利用率。实验证明，本发明菌剂处理的牡丹种子(菌剂组层积处理)的生根时间比对照组层积处理提前了 10天；菌剂组层积处理的生根率达到95.0%，比对照组层积处理(未用菌剂处理)的生根率提高了 33.8%;菌剂组层积处理的主根长度为69.0mm，是对照组层积处理的1.68倍；菌剂组层积处理的主根长度> 40mm的种子百分率达到90±0.5%，是对照组层积处理的1.3倍；菌剂组层积处理的发芽时间比对照组层积处理缩短了 10天；菌剂组层积处理的发芽率达到99.0%，是对照组层积处理的1.2倍；菌剂组层积处理的苗高是对照组层积处理的1.77倍，菌剂组层积处理的干重是对照组层积处理的2.27 倍。说明以多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM1101CGMCC N0.8527 为活性成分的促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂不但拮抗牡丹病原菌还显著地促进了牡丹种子的生根(胚根萌发)和发芽(胚芽萌发)和牡丹幼苗的生长。
保藏说明
[0036]菌种名称:多粘类芽孢杆菌
[0037]拉丁名:Paenibacilluspolymyxa
[0038]菌株编号:CSM1101
[0039]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0040]保藏机构简称:CGMCC
[0041]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号
[0042]保藏日期:2013年12月09日
[0043]保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.8527
【专利附图】
【附图说明】
[0044]图1为菌剂组层积处理和对照组层积处理部分种子生根培养60天的照片。
[0045]a为对照组层积处理，b为菌剂组层积处理。
【具体实施方式】
[0046]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047]下述实施例中所用的牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae) ACCC36053和牡丹枝孢霉(Cladosporium paeoniae) ACCC36063于本申请的申请日前均收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(简称八00:，地址:北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081 )，这两个菌株的收藏日均为2006年8月31日，自收藏之日起，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
[0048]下述实施例中所用的牡丹褐斑病病原菌为芍药杂色尾孢霉菌(Cercosporavarricolor Winter)(张建国，2001.牡丹的主要病害及防治.中国花丼园艺，23:32-34)公众可从上海辰山植物园获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0049]下述实施例中的牡丹为凤丹(Paeoni a ostii) (Jigang Han, YaoSong, ZhigangLiu,etc.2011.Culturable bacterial community analysis in theroot domainsof two varieties of tree peony (Paeonia ostii).FEMS Microb1lLett, 322:15 - 24)公众可从上海辰山植物园获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0050]下述实施例中所用的培养基如下:
[0051]半固体D δ bereiner 无氮培养基:鹿糖，1g ;苹果酸，5g ；KH2PO4.H2O, 0.4g ；K2HPO4.H2O, 0.1g ；MgS04.7Η20，0.2g ;NaCl，0.1g ；CaCl2.2Η20，0.02g ；FeCl3,0.01g ；Na2MoO4.2Η20，0.02g ;琼脂，3g ;用蒸馏水定容至 1000ml、pH7.0-7.2。121°C蒸气灭菌 20min。
[0052]D o bereiner 无氮培养基:鹿糖，1g ;苹果酸，5g ；KH2PO4.H2O, 0.4g ；K2HPO4.H2O,
0.1g ；MgSO4.7Η20，0.2g ;NaCl，0.1g ；CaCl2.2Η20，0.02g ；FeCl3,0.01g ；Na2MoO4.2H20,
0.02g ;琼脂18g ;用蒸馏水定容至1000ml、ρΗ7.0-7.2。121°C蒸气灭菌20min。
[0053]NB培养基:葡萄糖5.0g,蛋白胨5.0g,牛肉膏3.0g,用蒸懼水定容至1000ml,ρΗ7.0-7.2，121°C 灭菌 20min。
[0054]NA培养基:葡萄糖5.0g,蛋白胨5.0g,牛肉膏3.0g,琼脂18g,用蒸懼水定容至1000ml, ρΗ7.0-7.2，121。。灭菌 20min。
[0055]PDA培养基:葡萄糖20g，琼脂18g，马铃薯200g，加水100mL煮沸30min滤取汁液，加水补足 1000ml, ρΗ6.0-7.0,121°C灭菌 20min。
[0056]下述实施例中的纤维素酶购于生工生物工程(上海)股份有限公司。下述实施例中的纤维素酶酶活力单位(FPU)定义为Ig纤维素酶粉在55°C下60min内水解滤纸所得葡萄糖μ mo I数。纤维素酶酶活力的具体测定方法如下:取纤维素酶10.0OgJP 100mlpH4.85的0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液充分溶解，得到纤维素酶液，将纤维素酶液稀释后，吸取
0.5ml,加入0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液1.5ml, I X6cm新华一号滤纸条一张,55°C下水解60min。水解完毕后采用如下的DNS法测定体系中的葡萄糖含量，并计算纤维素酶的酶活力。
[0057]下述实施中，发酵培养基中葡萄糖含量的测定方法采用DNS法，具体如下:
[0058](I)DNS试剂的配制:200X酒石酸钾钠，溶于一定量的水中，加热溶解，添加
10.0g3, 5-二硝基水杨酸，1g NaOH溶解后加入2g苯酹,0.5g无水亚硫酸钠,全部加热溶解后，冷却至室温，定容至1000ml。
[0059](2)葡萄糖标准曲线的绘制:准确称取100.0mg分析纯的无水葡萄糖(预先在105°C干燥至恒重)，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到10ml容量瓶中，再定容到刻度、摇匀，浓度为lmg/mL。取10支试管,分别加入葡萄糖标准溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、
1.0mLU.2mL、l.6mL后，用蒸馏水稀释至2mL，再加入2.5mL DNS试剂混合均匀，在沸水中加热5min。取出后即用水冷却至室温，定容到25ml，摇匀。30min后于520nm下测OD值。以OD520值为纵坐标,葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线,形式为Y=aX+b。
[0060](3)发酵液中葡萄糖浓度的测定:取稀释到一定浓度的发酵上清液(4000r/min，离心20min)，加入2.5mL DNS试剂混合均匀，在沸水中加热5min。取出用水冷却到室温，定容至25mL，摇匀，静置30min后于520nm出测OD52tl值。根据样品的OD52tl值与标准曲线计算发酵液中的葡萄糖含量。
[0061]实施例1、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) CSM1101的分离与鉴定
[0062]一、多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa) CSMl 101 的分离
[0063]从安徽省铜陵市顺安镇金山村丹皮种植地的牡丹(Paeonia ostii,凤丹)(株龄6年)植株的根际采集土样，将土样放入装有无菌水和灭菌玻璃珠的小三角瓶中，200rpm/min振荡20min ;取振荡后的悬液做系列梯度稀释，13UO4稀释度悬液各吸取200 μ I均匀涂布D δ bereiner无氮培养基,置30°C培养4d后,挑取单菌落,在
[0064]D 6 bereiner无氮培养基固体培养基平板上用平板划线法进行菌种纯化。将分离纯化所得的其中一个菌株命名为牡丹根际固氮菌CSM1101。
[0065]二、牡丹根际固氮菌CSM1101的鉴定
[0066]1.形态特征观察和生理生化特性测定
[0067]形态学和生理生化特性鉴定参考“伯杰氏系统细菌学手册”(Garrity，2001)和“一般细菌学常用鉴定方法”(东秀珠等，2001)，按照常规方法进行。
[0068]牡丹根际固氮菌CSM1101的形态学特征如下:革兰氏阳性，运动，菌体呈杆状，直径为0.6-0.8 μ m，长为2.0-7.6 μ m。芽孢柱状，1.6-3.5X1.2-1.5 μ m，中生到次端生。孢子囊明显膨大成纺锤型或棒状。其菌落边缘不整齐裂片状，半透明到不透明。后其菌落粗糙，浅白色，中间略突起。菌落粘着在培养基表面。
[0069]牡丹根际固氮菌CSMl 101的生理生化特征测定结果如下:
[0070]水解淀粉:阴性；
[0071]水解酪蛋白:阴性；
[0072]水解明胶:阴性；
[0073]利用柠檬酸盐:阴性；
[0074]酪氨酸分解:阴性；
[0075]苯丙氨酸脱氨酶实验:阴性；
[0076]卵黄卵磷脂酶实验:阴性；
[0077]吲哚产生:阴性；
[0078]马尿酸盐实验:阴性；
[0079]接触酶实验:阳性；
[0080]硝酸盐还原实验:阳性；
[0081]二羟丙酮产生:阳性；
[0082]抗溶菌酶实验:阳性；
[0083]分解葡萄糖产酸产气:阳性；
[0084]分解阿拉伯糖产酸产气:阳性；
[0085]分解木糖产酸产气:阳性；
[0086]分解甘露醇产酸产气:阳性；
[0087]耐盐性试验:7%NaCl生长；
[0088]在pH6.8的营养肉汤培养基(NB)和pH5.7的沙氏葡萄糖肉汤培养基中均可生长。在MR-VP肉汤上产生乙酰甲基甲醇，pH6.0。
[0089]2.16S rDNA的序列扩增和分析
[0090]采用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司)提取基因组DNA作为PCR反应的模板。PCR 引物(Pf5’ -CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和 Pr5’ -CGGGATCCAAGGAGGTGATCCAGCC-3’)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用Perkin-ElmerGeneAmp PCRSystem9700PCR 扩增细菌的 16S rDNA。反应体系为 10XPCR buffer, 2.5uL ；dNTP (2.5mM)(TaKaRa), 2uL, Pf (10pmol/uL)0.1uL, Pr (10pmol/uL)0.1uL, Taq 聚合酶(5U/uL) (TaKaRa),0.125uL，基因组DNA0.5uL，加ddH20至25uL。PCR反应条件为，94°C预变性5min，94°C变性lmin，52°C复性lmin，72°C延伸lmin，72°C最后延伸10min，30个循环。PCR扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司纯化并测序。将菌株的16S rDNA序列在GenBank核酸序列数据库进行序列比较分析。
[0091]结果表明测得的牡丹根际固氮菌CSM110116S rDNA序列全长1496bp，如SEQIDN0.1。在GENBANK进行blastn分析的结果表明，其序列与Paenibacillus polymyxa strainM-1 (EF656457)的相似性达到99%。
[0092]根据牡丹根际固氮菌CSM1101的形态特征、生理生化特征和16s rDNA序列同源性分析结果，将牡丹根际固氮菌CSM1101鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)。多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa) CSMl 101已于2013年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号为CGMCC N0.8527。
[0093]实施例2、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) CSMl 101的生物活性
[0094]一、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) CSM1101的固氮活性测定
[0095]固氮活性测定采用乙炔还原法。在15mmX 15mm螺口试管中加入2.5mL半固体D δ bereiner 无氮培养基，接种多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa) CSMl 10ICGMCCN0.8527后，塞好棉塞，30°C培养24h ;再换无菌胶塞密封，抽出10%气体，注入相同体积的乙炔，30°C培养24h。抽取气样在Varian VISTA6000型气相色谱仪上测定ARA (acetyienereduct1n activity,乙炔还原活性)。实验设三个重复，取其平均值并计算方差不大于5%。
[0096]测定结果表明,CSM1101在D6 bereiner无氮培养基中表现出了较高的固氮活性。其乙炔还原活性为12.6C2Hxnmol mL-h-1.,
[0097]二、多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa) CSM1101 的抑菌活性
[0098]以牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae) ACCC36053、牡丹枝孢霉(Cladosporiumpaeoniae) ACCC36063> 苟药杂色尾抱霉菌(Cercospora varricolorWinter)中的任一菌株单独为病原菌，均采用平板对峙法测定抑菌率，具体方法如下:病原菌菌株在PDA斜面上活化后，加入无菌水制成病原菌悬浮液，将病原菌悬浮液加到融化后冷却到45-50°C的PDA培养基中混匀倒平板，在30°C培养4天，得到病原菌平板，用直径为6mm的打孔器打取病原菌菌饼。
[0099]按照如下方法测定多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) CSMl 101对每种病原菌的抑菌率:实验重复三次，每次重复病原菌设两个处理，即CSM1101组和对照组。将20个无菌PDA平板均分为两组，即CSM l 101组和对照组，每组10个平板，进行以下接种处理:在CSM1101组的无菌PDA平板中心接种直径为6mm的病原菌菌饼，将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM1101CGMCC N0.8527斜面活化菌种接种于距病原菌菌饼3cm处。同时，在对照组的无菌PDA平板中心只接种直径为6_的病原菌菌饼。将经过上述接种处理的CSM1101组平板和对照组平板在30°C培养5-7天，待对照组平板(仅接种病原菌)长满整个培养皿时，测量对照组的病原菌菌落直径和CSM1101组的病原菌菌落直径，计算抑菌率。
[0100]抑菌率(％)=(对照组的病原菌菌落直径-CSM1101组的病原菌菌落直径)/对照组的病原菌菌落直径X100。
[0101]结果如表1所示，表明多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSMllOlCGMCCN0.8527 对牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae) ACCC36053、牡丹枝孢霉(Cladosporiumpaeoniae ) ACCC36063 和苟药杂色尾抱霉菌(Cercospora varricolorWinter)均具有较强的平板抑菌活性，其抑菌率分别达到了 57.2%,65.7%和88.3%。
[0102]表1 多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa) CSMl 101CGMCC N0.8527 对病原
[0103]菌的抑菌率
[0104]
【权利要求】
1.制备促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的方法，包括: (1)将玉米秸杆在180-200°c和1.0-2.0Mpa条件下进行水热处理，得到经过预处理的玉米稻杆； (2)将所述经过预处理的玉米秸杆粉碎后，用纤维素酶进行酶解，分别收集酶解液和酶解残渣； (3)用所述酶解液、(NH4)2S04、MgS04、CaC03、玉米浆和水配制发酵培养基，每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为20-50g ； (4)向所述发酵培养基中接入促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌进行发酵，发酵结束后收集发酵液，将所述发酵液和所述酶解残渣混合，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述水热处理时间为10-20min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述(2)为将所述经过预处理的玉米秸杆粉碎后，按以干重计每克秸杆加入10-15FPU的比例加入纤维素酶，在55-80°C、pH为4.8-5.0的条件下在水中酶解24-48h，得到玉米秸杆酶解物，将所述玉米秸杆酶解物进行离心，分别收集上清液和沉淀，所述上清液即为所述酶解液，所述沉淀即为所述酶解残渣。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于:每升所述发酵培养基中，(NH4)2SO4的含量为10g，MgS04的含量为0.4g、CaC03的含量为6g、玉米浆的含量为2g ;和/或，所述发酵液和 所述酶解残渣按照1:1的质量比进行混合。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) CSM1101，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC N0.8527。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述(4)在30°C培养18-30小时进行发酵。
7.由权利要求1-6中任一所述的方法制备的促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂。
8.权利要求7所述的促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的用途，所述用途为下述CD-C3)中任一种: Cl)促进牡丹生长和拮抗病原菌； C2)所述促进牡丹生长； C3)所述拮抗病原菌。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于:所述促进牡丹生长体现为下述BI)-B7)中的任一种: BI)缩短牡丹种子生根时间； B2)提高牡丹种子生根率； B3)缩短牡丹种子的发芽时间； B4)提高牡丹种子的发芽率； B5)提高牡丹的主根长度； B6)提高牡丹苗高； B7)提高牡丹幼苗生物量； 所述拮抗病原菌为拮抗牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉(Cladosporium paeoniae)和巧药杂色尾抱霉菌(Cercospora varricolor Winter)中的三种、任两种或任一种。
10.促进牡丹生长的方法，包括在生根前将浸种后的牡丹种子用权利要求7所述的促进牡丹生长并拮抗 病原菌的菌剂处理1-3小时再进行生根培养的步骤。
【文档编号】A01P21/00GK104068063SQ201410116401
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年3月26日 优先权日:2014年3月26日
【发明者】韩继刚, 王云山, 蒋克谦, 王永强 申请人:上海禾颐农业技术有限公司