一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法。本方法中，3个紧密连锁的基因表达盒转入雌性不育水稻。这3个表达盒是：1）水稻雌性可育基因表达盒；2）花粉致死基因表达盒；3）荧光筛选标记基因表达盒。杂合转基因水稻在自交结实过程中，携带转基因的花粉粒败育而不能参与受精；而没有携带转基因的花粉粒能与雌配子正常受精而结实。通过光电分选，获得纯合的雌性不育水稻用于杂交稻机械化制种；而携带转基因的杂合种子，继续用于雌性不育水稻的繁殖。这一技术解决了雌性不育水稻繁殖难题，实现了杂交稻机械化制种，特别是混播混收方式的机械化制种。
【专利说明】一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农业生物【技术领域】，公开了一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法。
【背景技术】
[0002]我国杂交水稻的年种植面积约1600万hm2，种子生产面积约需15万hm2，每年需商品杂交种2.4亿kg左右。我国现行杂交水稻制种技术，自播种至收获主要依靠人工操作。父母本分期播种，多为先播父本，后播母本；父母本箱式分开栽插，母本多行，父本双行；收获时父母本分开收割，或者授粉后成熟前割掉父本。整个制种过程工序繁杂，难以实现机械化，需要足够的劳动力做保证，只适宜在劳动密集型的农村推广应用，大型农场因缺少足够的劳动力而不能制种。而且，由于父本的因素，减少了制种产量。随着城镇化、工业化、农业产业化和农村土地流转政策的逐步实施，农村人口将进一步减少，现行劳动密集型、精耕细作型的制种技术已阻碍了杂交水稻种子生产的发展。因此，杂交水稻机械化制种技术研究迫在眉睫。
[0003]已有不少研究者作了各种尝试开展杂交稻机械化制种。有研究者提出用谷壳颜色区别水稻不育系和恢复系种子，具体做法是将正常谷壳色的水稻不育系种子与非正常谷壳色的水稻恢复系种子机械混播，成熟后经机械混收，再用色选机分选，获得杂交种；有研究者提出用飞机将花粉喷施在母本田块里进行制种；也有研究者提出利用父、母本粒型的较大悬殊，用粒选机分选；还有研究者提出用半机械化操作的方法，即直播母本，人工栽插和收割父本，最后机械收割母本等方法；还有研究者利用水稻对除草剂苯达松的敏感特性进行杂交水稻机械化制种。然而上述多种方法均存在诸多缺陷而不能从根本上实现杂交水稻机械化制种，目前在生产上也未见大规模商业化应用。
【发明内容】
[0004]本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法。
[0005]为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为:
[0006]所述利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法，包括如下步骤:
[0007](I)将水稻雌性可育基因、水稻花粉致死基因和荧光筛选标记基因插入水稻表达载体；
[0008](2)将步骤(1)所制备的水稻表达载体导入雌性不育水稻，得到杂合的转基因水稻;
[0009](3)将步骤(2)所获得的杂合的转基因水稻或者利用步骤(2)所获得的转基因水稻进行转育而成的杂合转基因，进行自交，通过光电分选法对自交后得到的种子进行分选，筛选出不具有红色荧光的种子，即为纯合的雌性不育水稻种子，将该纯合的雌性不育水稻种子用于杂交稻机械化制种；筛选出的具红色荧光的种子即为转基因种子，将该转基因种子继续用于雌性不育水稻的繁殖，即，继续进行杂合不育系自交，然后按前述步骤进行光电分选，选出纯合的雌性不育水稻种子，如此循环。
[0010]其中，步骤(1)所述水稻雌性可育基因为野生型PTBl基因或雌性不育水稻SfSl的野生型雌性可育基因；所述雌性不育水稻sfsl的野生型雌性可育基因序列如SEQ IDN0.1 ;所示野生型PTBl基因序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]步骤(2)所述雌性不育水稻包括雌性不育水稻SfSl (该不育系已被申请号为201210096970.7的发明专利公开)，携带雌性不育基因PTBl (野生型PTBl基因已被申请号为201010194553.7的发明专利公开，所述雌性不育基因PTBl即为野生型PTBl基因发生任何缺失、插入、替换等修饰后产生的不育基因)的雌性不育水稻；所述雌性不育水稻sfsl的野生型雌性可育基因序列如SEQ ID N0.1所示，所述野生型PTBl基因序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]所述花粉致死基因为ZM-AAl，其序列如SEQ ID N0.5所示；所述花粉致死基因由花粉发育后期特异性启动子PG47驱动，其序列如SEQ ID N0.3所示；所述荧光筛选标记基因为RP，其序列如SEQ ID N0.8所示；所述突光筛选标记基由愈伤组织/种皮特异性启动子END2驱动，其序列如SEQ ID N0.7所示。所述水稻表达载体为pCAMBIA1300。
[0013]雌性不育水稻的繁殖和杂交稻机械化制种中利用了包含3个表达盒的转基因水稻进行转育所获得的水稻材料。 [0014]下面结合原理，对本发明作进一步说明:
[0015]本发明首先构建了携带水稻雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因3个紧密连锁的基因表达盒的水稻表达载体。利用水稻转基因技术，将上述表达载体转入雌性不育水稻。
[0016]本发明实质上提供了一种雌性不育水稻繁殖技术，以及利用这一技术机械化生产非转基因杂交稻种子的方法。将水稻雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因3个紧密连锁的基因表达盒转入雌性不育水稻。携带转基因的杂合单株在自交结实过程中，携带转基因的花粉粒败育而不能参与受精；而没有携带转基因的花粉粒能与雌配子正常受精而结实。通过光电分选，获得纯合的雌性不育水稻用于杂交稻机械化制种，因为父本(恢复系)为雌性不育系，因此制种时可以混播混收。父母本按照一定的比例均匀混合，一次播种，能够像常规水稻那样进行育秧和大田栽培管理，可以直播、抛秧、机插等，大大简化栽插工序。成熟后进行机械化收割；而携带转基因的杂合种子，继续用于雌性不育水稻的繁殖。
[0017]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0018]本发明方法解决了雌性不育水稻繁殖技术难题，实现了杂交稻种子生产的混播混收；这一方法利用了转基因技术，但生产的是非转基因杂交稻种子。繁殖时，雌性不育水稻虽为转基因水稻，但面积不大，易于隔离。制种时，可以箱式播插，也可以混播，父母本都不含有转基因成分，不会造成转基因的扩散漂移，有利于生物安全；收获时，可以混收，杂交种子也不含有转基因成分。这一混播混收的杂交水稻种子生产技术，可以减少制种操作程序，便于进行机械化操作，减轻劳动强度，降低种子生产成本，整体提高水稻种业的效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是实施例1中携带水稻雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因3个基因表达盒的水稻表达载体图谱；
[0020]图2是实施例2中经农杆菌转化后表达红色荧光蛋白的水稻愈伤图；
[0021]图3是实施例2中经农杆菌转化后获得水稻转基因植株图；
[0022]图4是实施例3中部分转基因植株的PCR检测图(M:DNA分子量标准；+:正/阳性对照；一:负/阴性对照);
[0023]图5是实施例3中部分转基因植株的Southern blot检测图(一:阴性对照；+:以质粒作为阳性对照);
[0024]图6是实施例4中I2-KI转基因植株花粉粒图；
[0025]图7是实施例4中转基因植株穗部性状图；
[0026]图8是实施例5中小规模制种现场图。
【具体实施方式】
[0027]下面通过具体实施例对本发明作进一步描述，但不因此限制本发明的范围。
[0028]实施例1:携带水稻雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因3个基因表达盒的水稻表达载体构建
[0029]在表达载体pCAMBIA1300上，插入3个表达盒:野生型PTBl表达盒、花粉致死的淀粉酶基因ZM-AAl表达盒、荧光筛选标记基因RP表达盒。野生型PTBl携带有自身的启动子和终止子(其核苷酸序列见SEQ ID N0.2);淀粉酶基因ZM-AAl表达盒元件包括:玉米的花粉发育后期特异性启动子PG47 (其核苷酸序列见SEQ ID N0.3)、玉米的转运肽ZM-BTl (其核苷酸序列见SEQ ID N0.4)、玉米的淀粉酶基因编码序列ZM-AAl (其核苷酸序列见SEQ IDN0.5)、玉米的终止子IN2-1 (其核苷酸序列见SEQ ID N0.6);红色荧光蛋白基因RP表达盒元件包括:玉米的种子特异性启动子END2 (其核苷酸序列见SEQ ID N0.7)、载体pLJ02上的RP编码序列(其核苷酸序列见SEQ ID N0.8)、马铃薯的终止子PIN II (其核苷酸序列见SEQ ID N0.9)。完整的构建载体图谱见附图1。
[0030]所构建载体质导入农杆菌菌株EHA105用于水稻遗传转化。导入方法米用电击转化方法，主要参考bio-rad公司的电击仪使用说明书进行，具体步骤如下:
[0031](I)将储存于_80°C的DHlOB感受态细胞取出放在冰上冻融，Imm电激杯放在冰上预冷，把冻存的SOC放置在37°C解冻。
[0032](2)将干净的EP离心管插在冰上预冷，一般EP离心管的数目比要转化的样品多两个，一个用来做阴性对照(没有加入DNA)、另一个做阳性对照(加入1μ I的IOng/μlpUC19)。
[0033](3)分别吸取1-2 μ I要转化的DNA样品放入预冷的EP离心管中，然后将融化的DHlOB感受态细胞20 μ I轻轻取出放入预冷的EP离心管底部，轻轻的将两者混匀，尽量不要产生气泡，离心管底部不要用手接触，避免温度变化对感受态转化效率造成影响，操作过程尽量的快。
[0034](4)设置转化参数，1800ν, 25 μ F，200 Ω，lmm, BioRad电激仪一般有推荐的使用参数。
[0035](5 )轻轻吸取感受态和DNA混合物，放入电激杯中，轻敲使混合物均匀的分布于杯底，改上盖子放入电激槽中，关上安全盖，按下电激红色按钮，待电激完成后(一般会仪器会发出完成提示音)，将在37°C预热好的SOC放入电激杯中，将混合物旋起，用吸头将混合物转入摇菌管中，于37°C恒温摇床,225rpm, Ihr0
[0036]实施例2:转基因水稻获得
[0037]2.1植物材料选择
[0038]用于遗传转化的水稻(Oryza sativa L.)品种选择为对应的携带PTBl基因(SEQID N0.1)的水稻雌性不育系。
[0039]2.2水稻胚性愈伤组织的诱导[0040]取授粉后10-15d的未成熟水稻种子剥去种皮，于70%酒精浸泡3min，再于0.1%升汞中浸泡15min (或再转入20%的次氯酸钠溶液中于摇床振荡灭菌25min)，超净工作台中无菌水清洗3-5次，将消毒后种子的幼胚用镊子挤出，接种于诱导培养基上，每个皿约放35粒，28°C暗培养4 一 5d，切除胚根，继续培养12-15d，待愈伤长大后进行继代培养，每两周继代一次，共继代2-3次。
[0041]成熟胚去壳，经上述方法消毒后，置于诱导培养基上。28°C暗培养至长出愈伤组织。选用培养或预培养4天的愈伤组织作为转化材料。(第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用于农杆菌转化。
[0042]2.3愈伤组织的预培养
[0043]取生长旺盛的胚性愈伤组织(从继代培养上挑选分散状，颜色鲜黄的2 - 3mm的胚性愈伤颗粒)转接到预培养培养基，27°C暗培养3~4天。生长旺盛的愈伤用于转化。
[0044]2.4农杆菌介导的水稻转化
[0045]农杆菌的培养。挑农杆菌单菌落接种于含50mg/L YM培养基上,260C暗培养2~3天后，用一金属匙收集农杆菌菌体，将其悬浮于AAM液体悬浮培养基中。调整菌落浓度至0.D.600为0.8~1.0，即可用于转化。
[0046]愈伤组织与农杆菌的共培养。用于转化的愈伤组织在被农杆菌污染前均应先在新鲜的继代培养基頂上预培养3~4天。转化时将经过预培养的愈伤组织转移到一无菌的三角瓶中，然后倒入适量的农杆菌悬浮液(至少保证有足够的菌液与材料接触)，室温下放置10~20分钟，并不时晃动。取出愈伤组织，在无菌纸上吸去多余的菌液，随即将愈伤组织转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基CM上于260C暗培养2~3天。
[0047]2.5抗性愈伤的筛选
[0048]将愈伤转移到选择培养基上筛选抗性愈伤，每两周转接I次。培养4 一 8周，多数愈伤褐化死亡,有少数瘤状抗性愈伤从干瘪褐化的愈伤表面长出。挑选这些抗性愈伤继续在选择培养基上暗培养2次，挑选长大后愈伤的一部分转移到分化培养基上。
[0049]2.6抗性愈伤的分化培养
[0050]经抗生素筛选长出的抗性愈伤，转入分化培养基中继续培养，26°C~28°C，12h光照，12h黑暗条件下培养。
[0051]2.7转基因植株的再生及幼苗移栽
[0052]转移到分化培养基上的愈伤组织，培养2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随之根也长出。将幼苗转移到含生根培养基的小三角瓶内，每瓶一株，继续光照培养，待苗高7~IOcm时，打开瓶盖于温室中炼苗5~7天，待小苗生长健壮后，移出培养瓶，洗净跟上的培养基，移至温室盆栽(铁盘中)。注意保湿，以提高移栽成活率。[0053]实施例3:转基因植株的分子检测
[0054]3.1DNA大规模抽提
[0055]T0代转基因水稻DNA抽提采用CTAB法(Murry and Thompson, 1980)。称取新鲜叶片2 — 4克，剪碎后放入一 20°C预冷的研钵中，用液氮磨成粉末，转入预冷的磨样瓶中于一20°C保存备用。提取时加入预热至100°C的10mll.5X CTAB，迅速搅匀，于56°C水浴保温摇床振荡20分钟，然后用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提。离心后，上清液再用1/10体积预热至56°C的10% CTAB缓冲液及等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次，然后上清加入1% CTAB沉淀DNA，离心后加入添加有RNase A的lmol/L NaCl溶解DNA，于56°C过夜完全溶解酒精沉淀后，溶于适量TE中，用DNA微量测定仪(DNA Fluorometer)测定DNA浓度，平衡DNA浓度至250ng/ul，存于4°C备用。
[0056]3.2PCR 分析
[0057]对TO代转基因水稻DNA进行PCR检测。以ZM-AAl基因作为模板设计引物。正向引物为:5’ -AAAAACGGAGACTTTGTGAGCCATT-3’ (SEQ ID N0.11)，反向引物为:5’-TCAACAAGTTTGGAATGAAGGATGC-3’ (SEQ ID N0.12)。扩增产物片段为 1043bp。PCR 反应体系:DNA30 — 90ng, IOx Buffer2.0ul, ImM dNTPl.8ul, 25mM MgCl2L 5ul, IOuM primer 两种各0.5ul, Tag酶1.5U，然后加dd h20至20ul反应体积。PCR循环条件-MV，变性3分钟；94°C，I分钟，550C，1.5分钟，72°C，1.5分钟，40个循环；72°C，延伸5分钟。电泳检测:用1.4%琼脂糖凝胶电泳，照相记录电泳结果。
[0058]附图4为部分转基因植株PCR扩增结果，表明目的基因已整合进入水稻基因组中。
[0059]3.3Southern 印迹分析
[0060]取水稻总DNA2.5ug，用限制性内切酶XbaI37°C酶解20hr左右，经电泳检测酶切完全后，用0.6~0.8%琼脂糖(Sigma公司生产)凝胶电泳，经12 — 16hr电泳后，凝胶用0.2NHCl变性10分钟，用0.4N NaOH溶液将凝胶上的DNA片段转移至尼龙膜Hybond-N+上。转移20小时，将尼龙膜用2X SSC漂洗2次，各5分钟，膜晾干后于80 — 100°C真空烘烤3hr，取出冷却后置于4°C冰箱中保存备用。
[0061]预杂交:先将尼龙膜用2X SSC漂洗，凉干后装入杂交袋中，加入10 - 18ml (依膜的张数I 一 6张)预热至65°C的杂交缓冲液。赶气泡后，于65°C空气摇床中预杂交6hr左右。
[0062]探针标记:用随机引物法按下列步骤进行标记。探针DNAlOOng，加入dd H2O至IOul, 100。。变性10分钟，冰浴5分钟冷却后，加入dNTP(A+G+T)3ul，随机引物缓冲液
5.0ul, Klenow Fragment 酶 2U，最后加入 a — 32P — dCTP10_40uCi (按杂交膜数量)，混匀后于25 C保温3小时以上。
[0063]杂交:加600ul杂交液到标记好的探针溶液中，打开管盖，100°C变性10分钟后，倒入杂交袋中，65 °C杂交6hr。
[0064]洗膜、压片:杂交完毕后，将膜从杂交袋中取出，用洗膜液IX SSC、0.2%SDS室温漂洗I次，然后再用预热至65°c的洗膜液于65°C保温摇床中热洗I 一 2次，每次15分钟。凉干后用保鲜膜包膜，压片后于一 20°C放射自显影约4 一 7天。
[0065]探针DNA制备。探针DNA选自3.2中的PCR扩增产物，扩增产物的序列见SEQ IDN0.10。[0066]附图5为部分转基因植株的Southern印迹分析。结果表明，目的基因已整合进入水稻基因组中。
[0067]实施例4:转基因水稻植株的育性考察
[0068]对经过分子鉴定的转基因植株考察了花粉育性和结实情况。取开花时的花药，经常规的I2-KI染色后，观察到部分花粉粒为黑染的可育花粉粒(见附图6);与雌性不育对照比较，转基因植株能正常结实(见附图7)。
[0069]实施例5:水稻雌性不育系用于繁殖制种试验
[0070]水稻雌性不育系的繁殖。将携带杂合转基因的水稻雌性不育系自交。自交种子通过对红色荧光的光电分选，可以筛选出具有红色荧光的种子，获得纯合的雌性不育水稻用于混播混收的杂交稻机械化制种；而携带转基因的杂合种子，继续用于雌性不育水稻的繁殖。
[0071]水稻雌性不育系应用于杂交稻制种。因为父本(恢复系)为雌性不育系，因此制种时可以箱式栽插，也可以混播混收。父母本按照一定的比例均匀混合，一次播种，能够像常规水稻那样进行育秧和大田栽培管理，可以直播、抛秧、机插等。待成熟后进行机械化收割，收获的均为 杂交水稻种子。附图7展示了小规模的制种现场。
【权利要求】
1.一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)将水稻雌性可育基因、水稻花粉致死基因和荧光筛选标记基因插入水稻表达载体； (2)将步骤(1)所制备的水稻表达载体导入雌性不育水稻，得到杂合的转基因水稻； (3)将杂合的转基因水稻自交，通过光电分选法对自交后得到的种子进行分选，筛选出不具有红色荧光的种子，即为纯合的雌性不育水稻种子，将该纯合的雌性不育水稻种子用于箱式播插或者混播混收的杂交稻机械化制种；筛选出的具红色荧光的种子即为转基因种子，将该转基因种子继续用于雌性不育水稻的繁殖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻雌性可育基因为野生型PTBl基因或雌性不育水稻sfsl的野生型雌性可育基因；所述雌性不育水稻sfsl的野生型雌性可育基因序列如SEQ ID N0.1 ;所示野生型PTBl基因序列如SEQ ID N0.2所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述花粉致死基因为ZM-AA1，其序列如SEQID N0.5 所示。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述花粉致死基因由花粉发育后期特异性启动子PG47驱动，PG47序列如SEQ ID N0.3所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光筛选标记基因包括红色荧光蛋白基因RP，其序列如SEQ ID N0.8所示。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光筛选标记基由愈伤组织/种皮特异性启动子END2驱动，END2序列如SEQ ID N0.7所示。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻表达载体为pCAMBIA1300。
【文档编号】A01H1/02GK103834684SQ201410116096
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月26日 优先权日:2013年3月29日
【发明者】曹孟良, 夏玉梅, 沈春修, 方真, 蔡立湘 申请人:湖南杂交水稻研究中心