专利名称：杂交稻抗螟Bt不育系与Bt恢复系的选育方法
技术领域：
本发明涉及改良杂交稻基因型过程，尤其涉及一种杂交稻抗螟Bt不育系与Bt恢复系的选育方法。
三系杂交稻的质核互作型雄性不育系(以下简称不育系)和恢复系，以及二系杂交稻的光温诱导核不育系(以下简称为核不育系)和恢复系，都不具备抗御二化螟、三化螟、纵卷叶螟等鳞翅目害虫的能力，由它们所配制的F1杂交稻也都不抗螟害，特别是其中的籼型杂交稻，由于茎杆粗壮，茎部薄壁细胞多，维管束间距大，硅化细胞少，螟害更为严重。
我国是杂交稻生产大国，年种植面积达1600万公顷，约占全国水稻总面积的一半。据农业部有关统计资料显示，80年代以来，全国稻田遭受二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟为害的面积约为1000万公顷，防治面积为3000万公顷。近年来，随着耕作改制和害虫抗药性的提高，螟害呈现增强的趋势。
由于世界范围内抗螟虫和抗纵卷叶螟的种质资源十分贫乏，迄今未能选育出兼抗各种螟害的水稻品种和杂交稻组合。农民只能主要施用农药进行防治。估计我国每年用于防治稻田螟害的农药为1.5万吨。大量施用农药不仅导致水稻生产投入的提高，影响稻米品质，促使螟虫抗药性增强，且造成生态环境污染，严重影响人民健康。为此选育出新的抗螟虫杂交稻组合，使杂交稻本身具备很强的抗虫能力，是当前和今后一个长时期解决螟害，保证高产稳产的一个重要途径。
选育抗螟杂交稻，首先要有抗螟不育系或恢复系。利用我们通过转基因育种方法育成的抗螟Bt水稻(克螟稻)作亲本，采用杂交与回交的方法选育抗螟的Bt不育系或Bt核不育系以及Bt恢复系，是当前解决杂交稻螟害最有效的方法之一。
我们用农杆菌介导法选育成功的Bt转基因粳稻——克螟稻，已于1998年通过由浙江省科委主持的技术鉴定。克螟稻携有cryⅠAb基因，该基因全长186bp。在T-DNA区段与cryⅠAb基因串联排列的还有NPTⅡ、HPH及GUS基因，cryⅠAb基因的Bt结晶毒蛋白表达量平均为1％。克螟稻对二化螟、三化螟、纵卷叶螟，稻切叶螟、大螟、稻螟蛉、稻眼蝶、稻苞虫等8种鳞翅目害虫都具有100％抗性。1997年经农业部生物基因工程安全委员会审查，确定其生物安全等级为Ⅰ级。1998、1999年批准开展中间试验，2000年批准环境释放(农业部农基安审字99B-01-19号)。克螟稻是国内第1个育成的自交繁殖代数最高、抗虫性遗传最稳定、Bt毒蛋白表达量最大，最具育种利用价值的人工创制的抗螟水稻种质资源。
克螟稻的cryⅠAb基因为单拷贝插入，其杂种后代在抗螟性状上呈单基因显性遗传，故特别适宜作抗螟转育亲本。
本发明的目的是提供一种节省杂交稻生产成本，制止杀螟农药对环境污染，保证高产与稳产的杂交稻抗螟Bt不育系与Bt恢复系的选育方法。
为了达到上述目的本发明采取下列措施杂交稻抗螟Bt不育系与Bt恢复系的选育方法是以转基因育种方法育成的具高抗鳞翅目害虫的克螟稻为亲本，以三系杂交稻中保持系和恢复系以及二系法杂交稻的光温敏核不育系和恢复系为轮回亲本，通过连续回交，结合对杂种后代的种子与幼苗抗生素抗性筛选，β-核苷酸酶基因(GUS)活性检测，杂种植株DNA的聚合酶链式反应(PCR)和瑟慎(Southem)杂交鉴定，Bt毒蛋含量的蛋白质印迹法(Western blotting)测定，以及室内外的饲虫试验与抗性观察，选出综合性状与原亲本基本一致，但携有cryⅠAb基因的抗螟Bt保持系及其不育系、Bt核不育系及Bt恢复系。
本发明的优点与效果免除或减少了生产Bt杂交稻种子的繁种田和制种田，以及免除了Bt杂交稻种植大田防治二化螟、三化螟和纵卷叶螟等害虫的药剂施用，节省了杂交稻生产成本与人力投入，制止了杀螟农药对土壤、水体与大气所造成的污染，保证了Bt杂交稻种子的优质高产以及Bt杂交稻的高产与稳产。目前全国杂交稻繁种田与制种田约为15万公顷左右，防治螟害的杂交稻生产田按1000万公顷计，以每公顷可节省农药施用量1.5公斤计，全国可免去1.5万吨的农药施用。按每年每公顷可节支工本90元左右计，全国约可节省杂交稻生产成本9亿元，挽回稻谷损失10亿公斤，同时大大减轻了农药造成的农田生态污染和稻谷的米质污染，并可适当压缩全国农药生产量。
下面结合实施例对本发明作详细说明。
本发明首先是以转基因育种方法育成的抗螟稻种质资源-克螟稻作亲本。克螟稻属栽培粳稻，它与具某些抗螟性的野生稻或农家品种的农艺性状很差、杂交转育困难的情况有不同。克螟稻易与其它栽培稻杂交与回交，杂种后代有较好的综合性状。此外，克螟稻携有单拷贝cryⅠAb基因，其杂种后代表现为抗虫性单基因显性遗传，因而通过杂交很易将该基因传递至其它水稻材料，选育出新的不育系和恢复系，如再用轮回亲本经4～5代回交后，即可保持该水稻材料的综合性状基本不变。其次是在选育方法上也不同于一般对杂交与回交后代的常规选择，而是结合转基因育种材料的特点，同步开展抗生素抗性筛选，GUS活性检测，PCR分析及Southern杂交，Western blotting等生物技术鉴别与测定方法，实施常规育种与转基因育种相结合的选育方法。第三是通过回交育成的Bt不育系、Bt核不育系及Bt恢复系，由于在综合农艺性状上与原亲本基本相同，故由它们配组成的三系Bt杂交稻组合Bt不育系/恢复系，Bt不育系/Bt恢复系，不育系/Bt恢复系；二系Bt杂交稻组合Bt核不育系/恢复系，Bt核不育系/Bt恢复系，核不育系/Bt恢复系，在杂种优势表现、主要农艺性状、稻米品质与产量水平方面都与原来的组合无显著差异，但对螟虫和纵卷叶螟等害虫具有高度抗性。
实施例一用粳型保持系宁67B与克螟稻杂交，再以宁67B为轮回亲本，连续回交4代，即宁67B/克螟稻/4/宁67B，从杂交与回交后代中结合采用分子生物学检测技术，选出cryⅠAb纯合的抗螟的Bt宁67B。再以Bt宁67B作轮回亲本与不育系宁67A连续回交4代，即可得到抗螟粳型不育系Bt宁67A。
实施例二用光温敏核不育系培矮64S与克螟稻杂交，以培矮64S为轮回亲本经过5代连续回交，即培矮64S/克螟稻/5/培矮64S，从杂交与回交的后代中结合采用分子生物学检测技术，选出cryⅠb纯合的抗螟Bt核不育系，即Bt培矮64S。
实施例三用籼型恢复系密阳46与克螟稻杂交，以密阳46为轮回亲本，连续回交5代，即密阳46/阳螟稻/5/密阳46，从杂交与回交后代中结合采用分子生物学检测技术，选出cryⅠb纯合的抗螟籼型Bt恢复系，即Bt密阳46。
权利要求
1．一种杂交稻抗螟Bt不育系与Bt恢复系的选育方法，其特征在于以转基因育种方法育成的具高抗鳞翅目害虫的克螟稻为亲本，以三系杂交稻中的保持系和恢复系以及二系法杂交稻的光温敏核不育系和恢复系为轮回亲本，通过连续回交，结合对杂种后代的种子与幼苗抗生素抗性筛选，β-核苷酸酶基因活性检测，杂种植株DNA的聚合酶链式反应和瑟慎杂交鉴定，Bt毒蛋含量的蛋白质印迹法测定，以及室内外的饲虫试验与抗性观察，选出综合性状与原亲本基本一致，但携有cryⅠAb基因的抗螟Bt保持系、Bt核不育系及Bt恢复系。
全文摘要
本发明公开了一种杂交稻抗螟Bt不育系与Bt恢复系的选育方法。它是以转基因育成的克螟稻为亲本,以三系杂交稻的保持系和恢复系以及二系杂交稻的光温敏核不育系和恢复系为轮回亲本,通过连续回交,结合对杂种后代的抗生素抗性筛选和分子生物技术检测,选出性状与原亲本基本一致,但携有cryIAb基因的Bt保持系及其Bt核不育系、Bt核不育系及Bt恢复系。本发明节省了杂交稻生产成本,制止了杀螟农药对环境污染,保证高产与稳产。
文档编号A01H1/02GK1318286SQ0010506
公开日2001年10月24日 申请日期2000年4月14日 优先权日2000年4月14日
发明者舒庆尧, 高明尉, 崔海瑞, 叶恭银, 吴殿星, 项友斌, 夏英武 申请人:浙江大学