快速获得罗汉果三倍体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速获得罗汉果三倍体的方法，该法采用诱导效率高、毒性小的新型染色体加倍剂Oryzalin，依据雌花大孢子母细胞减数分裂的花部特征，浸泡处理减数分裂时期的雌花，抑制减数分裂中染色体正常分离，诱导未减数雌配子产生，待处理雌花开花，用二倍体雄株花粉进行授粉，获得三倍体后代。本发明有效解决了罗汉果常规三倍体培育方法培育时间长，以及人工诱导未减数雄配子途径培育罗汉果三倍体中需筛选分离未减数配子等技术问题，成功实现在1个生长周期内操作简便地培育获得三倍体，为创制丰富的罗汉果三倍体新种质及培育三倍体无籽新品种提供了技术支持。
【专利说明】快速获得罗汉果三倍体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物遗传育种领域，具体是培育植物三倍体的技术，尤其涉及一种快速获得罗汉果三倍体的方法。
【背景技术】
[0002]三倍体(triploid)是指体细胞具有3个染色体组的植物，是多倍体中的一种类型。三倍体不仅具有多倍体的巨大特性，还具有不孕性，可用于优良无籽植物的培育。目前，采用四倍体人工诱导，四倍体与二倍体杂交的途径，已培育出三倍体无籽西瓜(Citrulluslanatus)(李建吾，马长生，孙中伟，张洁.无籽西瓜新品种’豫艺菠萝蜜’.园艺学报，2005, 32，(2):374)、无籽枸杞(Lycium barbarum)(李健，王锦秀，王立英，黄占明.无籽枸杞新品种选育研究.西北植物学报，2001，21 (3):446-450)等植物新品种。
[0003]通过诱导二倍体植株未减数配子产生(具孢子体染色体数目的配子)，并与二倍体植株(染色体数目减半的正常配子)杂交可快速获得三倍体，该方法和上述方法(首先获得四倍体，然后与二倍体植株杂交获得三倍体)相比，可在I个植物生长周期获得三倍体，显著缩短三倍体培育时间。未减数配子(unreduced gamete),是指具有孢子体染色体数目的配子，包括未减数雄配子(unreduced male gamete)和未减数雌配子(unreduedfemale gamete)。通过未减数雄配子途径，已在杨树(Populus spp.)(李风兰，张志毅，张民侠.白杨染色体加倍技术研究及三倍体育种(III)-加倍体某些形态特征的观察.北京林业大学学报，1994，16(2): 15-18)、桑树(Morus alba)(杨今后，杨新华.桑树雄性配子人工二倍化培育优良三倍体的研究.蚕业科学，2001, 27(3): 177-180)、文旦柚(Citrusgrandis)(杨晓玲，程舟，李珊，北岛宣，长谷川耕二郎.秋水仙素诱导文旦柚2n配子获得自交三倍体.园艺学报，2006，33(5):1045-1047)等植物中获得三倍体。通过未减数雌配子途径，已获得百合(Lilium Oriental) (WU H Z，ZHENG S X，HE Y Q1YAN G J, BI Y F，ZHUY Y.Diploid female gametes induced by colchicine in Oriental lilies.ScientiaHorticulturae, 2007, 114:50-53),杨树(Populus spp.)(李云，朱之悌，田砚亭，张志毅，康向阳.2001.秋水仙碱处理白杨雌花芽培育三倍体植株的研究.林业科学，37 (5):68-74)等植物三倍体。未减数雌配子与未减数雄配子相比较，受精过程中未减数雌配子与正常配子不存在竞争受精问题，未减数雌配子可100%形成三倍体，具有三倍体创制效率高、遗传变异丰富等特点，是未减数配子利用的新趋势。
[0004]罗汉果(Siraitia grosvenorii)三倍体选育中，蒋水元等采用秋水仙素处理离体组培苗， 诱导获得四倍体，所获四倍体雌株大田栽培至花期，与二倍体雄株杂交，获取三倍体种子；通过变温或秋水仙素处理，诱导未减数雄配子(二倍体大花粉)产生，筛选分离获得大花粉，再采用大花粉授粉二倍体雌株，获得三倍体(蒋水元，蒋向军，覃吉胜，黄夕洋，刘凤英.无籽罗汉果选育的初步研究.广西植物，2009, 29 (4): 506-509)。上述两种罗汉果三倍体的培育方法中，采用的染色体加倍剂秋水仙素，毒性大，对植物损伤较大，易产生染色体结构变异；在离体条件诱导染色体加倍，再经过四倍体大田栽培，与二倍体杂交获得三倍体，培育时间较长；组培苗染色体加倍处理后，普遍存在嵌合体，需要多代鉴定和倍性纯化，才能获得倍性纯合的四倍体，工作量较大；需具备组织培养设施条件。未减数雄配子诱导，需要筛选分离获得未减数雄配子(二倍体大花粉)，再进行授粉杂交，排除正常配子(正常花粉)与未减数雄配子的竞争受精，操作程序较繁琐。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种操作程序简便、高效、安全的快速获得罗汉果三倍体的方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用一些技术方案:快速获得罗汉果三倍体的方法，采用Oryzalin浸泡处理减数分裂时期的罗汉果雌花，诱导未减数雌配子产生，然后用清水清洗解除，开花后采用二倍体雄株新鲜花粉进行授粉，从后代中获得三倍体植株。
[0007]Oryzalin浸泡处理使用30~90 μ M的Oryzalin水溶液。
[0008]Oryzalin浸泡处理时间为3~9h。
[0009]罗汉果雌花处于大孢子母细胞减数分裂时期。
[0010]罗汉果雌花子房的长度为7.0mm ( L<9.0mm。
[0011]开花后是经处理的雌花开放的第I天。
[0012]授粉后收获成熟果实，剥取果实中的种子，进行播种育苗，出苗后鉴定植株染色体倍性，从而获得三倍体植株。
[0013]针对现有培育罗汉果三倍体存在工作量大、周期长、毒性大、收效差等问题，发明人建立了一种快速获得罗汉果三倍体的方法。该法采用诱导效率高、毒性小的新型染色体加倍剂Oryzalin (氨磺灵)，依据雌花大孢子母细胞减数分裂的花部特征(董志渊，马小军，周光雄.罗汉果大孢子发生及雌配子体发育与花部形态、胚珠变化的关系.热带亚热带植物学报，2013, 21 (3):234-239)，采用Oryzalin浸泡处理减数分裂时期的雌花，抑制减数分裂中染色体正常分离，诱导未减数雌配子产生，待处理雌花开花，用二倍体雄株花粉进行授粉，获得三倍体后代。本发明有效解决了罗汉果常规三倍体培育方法(首先获得四倍体，然后与二倍体植株杂交获得三倍体)培育时间长(至少需要2个植物生长周期)，以及人工诱导未减数雄配子途径培育罗汉果三倍体中需筛选分离未减数配子等技术问题，成功实现在I个生长周期内操作简便地培育获得三倍体，为创制丰富的罗汉果三倍体新种质及培育三倍体无籽新品种提供了技术支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是染色体计数显微镜图，图中:左为二倍体(对照)(2n = 2x = 28)，右为三倍体(2n = 3X = 42)。
[0015]图2是DNA流式细胞分析图，图中:左为二倍体(对照)，右为三倍体(DNA含量增加0.5倍)。
【具体实施方式】
[0016]以下实施例中Oryzalin水溶液按照如下方法事先配制:首先采用少量DMSO(二甲基亚砜)溶解所需摩尔浓度的Oryzalin药剂，然后将DMSO溶液滴加入蒸馏水中，滴加过程中不断摇匀蒸馏水，保证无药剂析出，DMSO用量为最终配制水溶液的I %。
[0017]实施例1
[0018]<1>田间选择罗汉果品种类型“青皮果”的无病虫害发生、生长健壮的雌株。
[0019]〈2>进入现蕾期，选择标记雌株大孢子母细胞减数分裂的雌花(子房的长度为7.0mm < L<9.0mm)。
[0020]〈3>将标记雌花放入0.5mL的离心管中，加入30 μ M Oryzalin水溶液0.5mL,进行浸泡处理3h。
[0021]<4>处理结束后,取出雌花,用清水清洗,去除Oryzalin。
[0022]<5>0ryzalin处理雌花开放的第I天，采用二倍体雄株新鲜花粉进行人工授粉。
[0023]<6>待雌花膨大形成果实，且果实颜色由绿色转变为黄绿色时，采摘果实。
[0024]〈7>剥取果实中的种子，人工去除种壳，播种育苗，植株具2-4片真叶时，取根尖进行染色体鉴定，具体方法如下:于晴天上午10-12点，取生长旺盛的根尖，放入0.002M的8-羟基喹啉溶液中预处理6h,转入卡诺氏固定液(无水酒精:冰醋酸=3:1)固定16h,蒸馏水清洗根尖3次后，加入lmol/L HC1，60°C水浴条件下水解8_10min，蒸馏水清洗根尖3次，卡宝品红染液染色2min，压片，显微镜下进行染色体计数(图1)。染色体鉴定为三倍体的植株取幼嫩叶片放入培养皿里，加入1000 μ I WPS提取缓冲液；用刀片切碎叶片，30 μ m微孔滤膜过滤，加入PI染色液，染色lmin，PARTEC倍性分析仪上样检测(图2)。
[0025]结果:30μΜ Oryzalin处理3h获得的后代植株中，三倍体比率为2.57%，无嵌合体发生。
[0026]实施例2
[0027]<1>田间选择罗汉果品种类型“青皮果”的无病虫害发生、生长健壮的雌株。
[0028]〈2>进入现蕾期，选择标记雌株大孢子母细胞减数分裂的雌花(子房的长度为
7.0mm < L<9.0mm)。
[0029]〈3>将标记雌花放入0.5mL的离心管中，加入60 μ M Oryzalin水溶液0.5mL,进行浸泡处理9h。
[0030]<4>处理结束后,取出雌花,用清水清洗,去除Oryzalin。
[0031]<5>0ryzalin处理雌花开放的第I天，采用二倍体雄株新鲜花粉进行人工授粉。
[0032]<6>待雌花膨大形成果实，且果实颜色由绿色转变为黄绿色时，采摘果实。
[0033]〈7>剥取果实中的种子，人工去除种壳，播种育苗，植株具2-4片真叶时，取根尖进行染色体鉴定，具体方法如下:于晴天上午10-12点，取生长旺盛的根尖，放入0.002M的8-羟基喹啉溶液中预处理6h,转入卡诺氏固定液(无水酒精:冰醋酸=3:1)固定16h,蒸馏水清洗根尖3次后，加入lmol/L HC1，60°C水浴条件下水解8_10min，蒸馏水清洗根尖3次，卡宝品红染液染色2min，压片，显微镜下进行染色体计数。染色体鉴定为三倍体的植株取幼嫩叶片放入培养皿里，加入1000 μ I WPS提取缓冲液；用刀片切碎叶片，30 μ m微孔滤膜过滤，加入PI染色液，染色lmin，PARTEC倍性分析仪上样检测。
[0034]结果:60μΜ Oryzalin处理9h获得的后代植株中，三倍体比率为8.23%，无嵌合体发生。
[0035] 实施例3
[0036]<1>田间选择罗汉果品种类型“青皮果”的无病虫害发生、生长健壮的雌株。[0037]〈2>进入现蕾期，选择标记雌株大孢子母细胞减数分裂的雌花(子房的长度为
7.0mm < L<9.0mm)。
[0038]〈3>将标记雌花放入0.5mL的离心管中，加入90 μ M Oryzalin水溶液0.5mL，进行浸泡处理6h。
[0039]<4>处理结束后,取出雌花,用清水清洗,去除Oryzalin。
[0040]<5>0ryzalin处理雌花开放的第I天，采用二倍体雄株新鲜花粉进行人工授粉。
[0041]〈6>待雌花膨大形成果实，且果实颜色由绿色转变为黄绿色时，采摘果实。
[0042]〈7>剥取果实中的种子，人工去除种壳，播种育苗，植株具2-4片真叶时，取根尖进行染色体鉴定，具体方法如下:于晴天上午10-12点，取生长旺盛的根尖，放入0.002M的8-羟基喹啉溶液中预处理6h,转入卡诺氏固定液(无水酒精:冰醋酸=3:1)固定16h,蒸馏水清洗根尖3次后，加入lmol/L HC1，60°C水浴条件下水解8_10min，蒸馏水清洗根尖3次，卡宝品红染液染色2min，压片，显微镜下进行染色体计数。染色体鉴定为三倍体的植株取幼嫩叶片放入培养皿里，加入1000 μ I WPS提取缓冲液；用刀片切碎叶片，30 μ m微孔滤膜过滤，加入PI染色液，染色lmin，PARTEC倍性分析仪上样检测。
[0043] 结果:90μΜ Oryzalin处理6h获得的后代植株中，三倍体比率为12.59%，无嵌合
体发生。
【权利要求】
1.一种快速获得罗汉果三倍体的方法，其特征在于:采用Oryzalin浸泡处理减数分裂时期的罗汉果雌花，诱导未减数雌配子产生，然后用清水清洗解除，开花后采用二倍体雄株新鲜花粉进行授粉，从后代中获得三倍体植株。
2.根据权利要求1所述的快速获得罗汉果三倍体的方法，其特征在于:所述Oryzalin浸泡处理使用30~90 μ M的Oryzalin水溶液。
3.根据权利要求2所述的快速获得罗汉果三倍体的方法，其特征在于:所述Oryzalin浸泡处理时间为3~9h。
4.根据权利要求3所述的快速获得罗汉果三倍体的方法，其特征在于:所述罗汉果雌花处于大孢子母细胞减数分裂时期。
5.根据权利要求4所述的快速获得罗汉果三倍体的方法，其特征在于:所述罗汉果雌花子房的长度为7.0mm ^ L〈9.0mm。
6.根据权利要求5所述的快速获得罗汉果三倍体的方法，其特征在于:所述开花后是经处理的雌花开放的第I天。
7.根据权利要求6所述的快速获得罗汉果三倍体的方法，其特征在于:授粉后收获成熟果实，剥取果实中的种子，进行播种育苗，出苗后鉴定植株染色体倍性，从而获得三倍体植株。
【文档编号】A01H1/08GK103931491SQ201410167680
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】董志渊, 马小军, 缪剑华, 白隆华, 潘丽梅, 冯世鑫, 莫长明 申请人:广西壮族自治区药用植物园