一种作物专用型生物磷肥及其制备方法
【专利摘要】一作物专用型生物磷肥，该生物磷肥为溶磷真菌磷矿粉发酵液，溶磷真菌为Aspergillus?niger?XXR-B1、溶磷真菌为Penicillium?sp.XXR-G或溶磷真菌为Fungalsp.XXR-E，并分别制得玉米、大豆、绿豆专用型生物磷肥。将土壤样本经溶磷菌培养并分离纯化后得到的溶磷真菌置于磷矿粉发酵液中，在28℃-30℃下发酵培养15-18天，得到溶磷真菌磷矿粉发酵液，该溶磷真菌磷矿粉发酵液即为专用型生物磷肥。该生物磷肥避免了矿物磷肥带来的环境污染，食品污染等问题，弥补了目前生物磷肥缺乏专用型的不足之处，充分挖掘了自然界的溶磷微生物资源，为农作物增产提供了更好的技术保障。
【专利说明】一种作物专用型生物磷肥及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物磷肥菌，尤其是一种专用型生物磷肥制备方法。
【背景技术】
[0002] 磷肥利用率低的主要由磷肥在土壤中固定引起的。为了满足农业生产对 磷肥的需求，人们加大了磷矿开采的力度，却对生态环境造成了无法弥补的损失： ω磷矿开采对环境严重破坏；⑵磷肥生产过程中排出的废水；(31矿物磷肥含有某些重 金属（如镉等）/放射性物质导致食物污染。化学肥料的长期使用，导致化学物质在土壤中 大量残留，破坏了土壤的有机组成、生态平衡，出现土壤盐碱化现象，粮食产量下降。现在提 倡生态农业、发展绿色食品，要求人们施用生物肥料来代替化肥，因此，生物磷肥应运而生。
[0003] 生物磷肥是通过固体或者液体深层发酵而得到的含菌制剂，菌群主要是溶磷微 生物，该微生物不但能溶解矿物磷，也能溶解土壤中的非水溶性磷，使之转化为能够被作 物吸收利用的生物有效磷。生物磷肥具有以下优势：ω供肥速度均衡适中，肥效持久，不 易被土壤固定和流失，磷素利用率高于矿物磷肥；(2i长期施用，有利于促进土体腐殖化， 提高土壤保水保肥能力；?有效预防根腐，烂根等根系病害，减少农药的使用量，提高作 物品质。
[0004] 然而，目前市场上的生物磷肥缺乏作物专用型，严重影响了生物磷肥的肥效，不利 于作物增产，甚至一些生物磷肥中的溶磷微生物还可能抑制作物生长，反而导致作物产量 下降。微生物与作物之间存在着显著的相互作用，有的可以促进作物生长，有的可以抑制作 物生长；同时，不同作物的根系分泌物种类及数量差异显著，从而影响着溶磷菌在土壤中定 殖和生长，进而影响溶磷能力。所以筛选具有良好溶磷能力、定植生长能力、促进作物生长 的溶磷微生物，生产作物专用型生物磷肥，是生物磷肥的发展趋势，也是避免目前生物磷肥 肥效不高的主要手段之一。本发明提供的一种专用型生物磷肥制备方法，采用盆栽方式测 试作物专用型生物磷肥增产效果，能方便、快捷、准确地获得促进特定作物生长及提高产量 的作物专用型生物磷肥，避免了矿物磷肥引发的环境污染、食品污染等不利因素，同时弥补 了目前生物磷肥缺乏专用型的不足之处，充分挖掘了自然界的溶磷微生物资源，为农作物 增产提供了更好的技术保障。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是采用盆栽方式测试专用型生物磷肥增产效果，提供 一种作物专用型生物磷肥及其制备方法。
[0006] 本发明的专用型生物磷肥为溶磷真菌磷矿粉发酵液，溶磷真菌为 /?i职r XXR-B1，GenBank登陆号KF572126时，制得玉米专用型生物磷肥。
[0007] 本发明提供的另一种专用型生物磷肥，该生物磷肥为溶磷真菌磷矿粉发酵液，溶 磷真菌为腫5/7. XXR-G，GenBank登陆号KF572132时，制得大豆专用型生物磷肥。
[0008] 本发明还提供了一种专用型生物磷肥，该生物磷肥为溶磷真菌磷矿粉发酵液，溶 磷真菌为Fungal sp. XXR-E，GenBank登陆号KF572130时，制得绿豆专用型生物磷肥。
[0009] 本发明所提供的一种专用型生物磷肥制备方法，该方法包括以下步骤： 一种专用型生物磷肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1.采集土壤样本，并将该土壤样本经梯度稀释后接种于溶磷菌筛选培养基 中，在25°C -30°C下培养5-10天，使土壤样本中的真菌菌落边缘出现溶磷圈，将产生 溶磷圈的真菌菌落转接至新的溶磷菌筛选培养基上，在25°C -30°C下培养3-5天，进行分 离纯化后得到溶磷真菌。所述的土壤样本经梯度稀释为ΚΓ1、1〇_ 2、1〇_3。所述的溶磷菌 筛选培养基是将葡萄糖、磷酸钙、6水氯化镁、7水硫酸镁、氯化钾、硫酸铵、琼脂以质量比为 15:5:5:0. 25:0. 2:0. 1:15 混合。
[0010] 2.将经分离纯化后的溶磷真菌置于磷矿粉发酵液中，在28°C -30°C下发酵培 养15-18天，得到溶磷真菌磷矿粉发酵液，该溶磷真菌磷矿粉发酵液即为专用型生物 磷肥。所述的磷矿粉发酵液是将葡萄糖、磷矿粉、6水氯化镁、7水硫酸镁、氯化钾、硫酸铵按 重量比为 10:10:5:0. 25:0. 2:0. 1 混合。
[0011] 专用型生物磷肥的筛选具体应用为： 从种植地取土，过筛至6_，将过筛的土壤与粉碎至5-10mm的农作物結杆 混合，喷水至土壤秸杆的混合物含水量为40-50%，再往土壤秸杆混合物中添加步骤2) 中的溶磷真菌磷矿粉发酵液，并将该混合好的土壤置于预先设置有栽培基质的栽培桶中， 作为栽培土壤；所述的栽培土壤与秸杆的质量比为8:1，添加溶磷真菌磷矿粉发酵液的量 为1 X 105-9 X 105 CFU/克土壤；栽培基质为将20-250kg土壤过2cm的孔径后装入栽培桶中， 敦实，达到栽培桶的4/5高度。
[0012] 在栽培桶的栽培基质土壤上覆盖栽培土壤(桶内上部1/5高度)，喷水至土壤含水 量为60-75%，并将作物种子种于桶内上部1/5处的栽培土壤层中筛选合适的专用型生物磷 肥生产菌种。
[0013] 本发明提供的一种专用型生物磷肥制备方法，采用盆栽方式测试专用型生物磷肥 增产效果，能方便、快捷、准确地获得促进作物生长及提高产量的作物专用型生物磷肥，避 免了矿物磷肥引发的环境污染、食品污染等不利因素，同时弥补了目前生物磷肥缺乏专用 型的不足之处，充分挖掘了自然界的溶磷微生物资源，为农作物增产提供了更好的技术保 障。
【具体实施方式】
[0014] 实施例一 一种专用型生物磷肥制备方法，该方法包括以下步骤： 1)从不同作物种植地采集土壤样本57个。
[0015] 2)培养：将土壤样本作ΙΟ'ΙΟ'ΚΓ3等系列稀释后，接种于溶磷菌筛选培养 基 NBRIP (NBRIP 每升含有：10 g 葡萄糖，5 g Ca3(P04)2,5 g MgCl2.6H20，0.25 g MgS04 · 7Η20,0· 2 g KC1，0. 1 g (NH4)2S04，15 g agar)中，28°C培养 10 天。
[0016] 3)观察溶磷圈：10个真菌群落边缘出现溶磷圈。
[0017] 4)分离纯化：将步骤3)产生溶磷圈的菌落转接至新的溶磷菌筛选培养基NBRIP 上，进行分离纯化，获得8株溶磷真菌。
[0018] 5)将在NBRIP液体发酵时活性高[发酵液磷含量>25 μ g/ml]的4株溶磷真菌 (均为真菌，编号为Z01、Z02、Z03和Z04)，用磷矿粉发酵液[磷矿粉发酵液，每升含有：10 g 葡萄糖，10 g 磷矿粉(含 P205 26%)，5 g MgCl2.6H20，0.25 g MgS04,7H20,0.2 g KC1，0.1 g (NH4)2S04)]，扩大培养，28°C培养16天；对照组为没有加入溶磷真菌磷矿粉发酵液。
[0019] 6)选择栽培桶直径为40cm，深60cm，桶底部钻孔直径3cm利于多余水分下渗。
[0020] 7)将栽培桶放入提前挖好的土坑内，桶上平面高出地面5cm，然后用土填实桶与周 围土壤的孔隙。
[0021] 8)将土坑挖出的土壤用2cm孔径粗径不锈钢网除去大颗粒，经过多次混匀后作为 栽培基质，每桶装载150kg，踏实至栽培桶的4/5高度。
[0022] 9)从种植地取土（含水量为40-50%)，用筛孔6mm不锈钢网除去大颗粒，将过筛的 土壤用粉碎的玉米芯混合，按土壤：玉米芯=8 :l(w/w)充分混匀（玉米芯含水量为40-50%)， 将混合后的土壤与溶磷真菌磷矿粉发酵液混合(含菌量为7.0X10 5 cfu / g 土)，或者对照 磷矿粉培养液混合。将含有溶磷菌或者对照培养液的土壤装在栽培桶内栽培基质上方，达 到栽培桶上方边缘(栽培桶上部1/5部位)，种植时使得土壤含水量为60-75%，测得种植土 壤有效磷含量14. 52 mg/kg。
[0023] 10)将玉米种子（中农大451)种到桶内上部1/5的土壤中，出苗后每个桶留1株 健壮的苗。收获时，对照组土壤有效磷含量5. 034±0. 214 mg/kg (n=10)，与其它溶磷菌组 比较，Z02桶栽土壤有效磷含量最高（9. 942±0· 421 mg/kg，n=10)，土壤中Z02的数量也 是最高[(4.41±0. 26)X 104 cfu / g 土，n=10];玉米单株干燥后生物产量(包括根重、茎 叶重、果穗重）和穗粒重在Z02处理组最高(生物产量342. 86 ±6. 44 g/株，n=10 ;穗粒重 134. 39±2. 07g/株，n=10)，并且和其它组相比差异显著〇7〈0. 05)。生物产量和穗粒重均 值分别比对照组(生物产量290. 65±5. 81g/株，n=10 ;穗粒重107. 27±2. 41g/株，n=10) 提高17. 96%和25. 28%。对溶磷真菌Z02的分子鉴定发现与黑曲霉Usper价7Λλ5 /?i职r) 相似度达99%，命名为/?i供τ XXR-B1，GenBank登陆号 KF572126,溶磷真菌Z02 制备的玉米专用型生物磷肥，具有明显的增产效果。
[0024] 实施例二 1)将实施例一中的4株溶磷真菌(编号为Z01、Z02、Z03和Z04)测试对大豆产量的影 响。
[0025] 2)用磷矿粉发酵液[磷矿粉发酵液，每升含有：10 g葡萄糖，10 g磷矿粉(含P205 26%)，5 g MgCl2.6H20，0.25 g MgS04.7H20,0.2 g KC1，0.1 g (NH4)2S04)]，扩大培养， 28°C培养16天；对照组为没有加入溶磷真菌磷矿粉发酵液。
[0026] 3)选择栽培桶直径为25cm，深40cm，桶底部钻孔直径2cm利于多余水分下渗。
[0027] 4)将栽培桶放入提前挖好的土坑内，桶上平面高出地面5cm，然后用土填实桶与周 围土壤的孔隙。
[0028] 5)将土坑挖出的土壤用2cm孔径粗径不锈钢网除去大颗粒，经过多次混匀后作为 栽培基质，将40kg 土壤装桶踏实至栽培桶的4/5高度。
[0029] 6)从种植地取土（含水量为40-50%)，用筛孔6mm不锈钢网除去大颗粒，将过筛 的土壤用粉碎的大豆茎杆混合，按土壤：大豆茎杆=8 :1 (w/w)充分混匀（大豆茎杆含水量为 40-50%)，将混合后的土壤与溶磷真菌磷矿粉发酵液混合(含菌量为6. ΟΧΙΟ5 cfu / g 土)， 或者对照磷矿粉培养液混合。将含有溶磷菌或者对照培养液的土壤装在栽培桶内栽培基质 上方，达到栽培桶上方边缘(栽培桶上部1/5部位)，种植时使得土壤含水量为60-75%，测得 种植土壤有效磷含量15. 67 mg/kg。
[0030] 7)将大豆种子(南农38)种到桶内上部1/5的土壤中，出苗后每个桶留2株健壮 的苗。收获时，对照组土壤有效磷含量4.90±0. 13mg/kg (n=10)，与其它溶磷菌组比较， Z03桶栽土壤有效磷含量最高（7. 26±0· 37mg/kg，n=10)，土壤中Z03的数量也是最高[( 5·43±(λ 43) X 104 cfu / g 土，n=10] ;Z03单株有效荚数(个)、单株粒数(粒)、单株粒重 (g)和百粒重（g)[分别是 23. 00±1· 66、47· 60±2· 75、12· 13±0· 82 g 和 18. 83±0· 50， (n=l0)]与其它组相比最高，并且和其它组相比差异显著0X0.05)。Z03单株有效荚数、单 株粒数、单株粒重和百粒重均值与对照组相比分别提高18. 56%、18. 11%、20. 94%和6. 8%(对 照组单株有效荚数(个)、单株粒数(粒)、单株粒重（g)和百粒重（g)分别是19. 40±1. 12、 40. 30±2· 17、10· 03±0· 19和17. 63±0· 28, n=10)。对溶磷真菌Z03的分子鉴定发现与 属真菌相似度达96%，序列覆盖度达97%，所以命名为XXR-G, GenBank登陆号KF572132,溶磷真菌Z03制备的大豆专用型生物磷肥，具有明显的增产效 果。
[0031] 实施例三 1)将实施例一中的4株溶磷真菌(编号为Z01、Z02、Z03和Z04)测试对绿豆产量的影 响。
[0032] 2)用磷矿粉发酵液[磷矿粉发酵液，每升含有：10 g葡萄糖，10 g磷矿粉(含P205 26%)，5 g MgCl2.6H20，0.25 g MgS04.7H20,0.2 g KC1，0.1 g (NH4)2S04)]，扩大培养， 28°C培养16天；对照组为没有加入溶磷微生物的磷矿粉培养液。
[0033] 3)选择栽培桶直径为25cm，深40cm，桶底部钻孔直径2cm利于多余水分下渗。
[0034] 4)将栽培桶放入提前挖好的土坑内，桶上平面高出地面5cm，然后用土填实桶与周 围土壤的孔隙。
[0035] 5)将土坑挖出的土壤用2cm孔径粗径不锈钢网除去大颗粒，经过多次混匀后作为 栽培基质，将40kg 土壤装桶踏实至栽培桶的4/5高度。
[0036] 6)从种植地取土（含水量为40-50%)，用筛孔6mm不锈钢网除去大颗粒，将过筛 的土壤用粉碎的绿豆茎杆混合，按土壤：绿豆茎杆=8 :l(w/w)充分混匀（绿豆茎杆含水量为 40-50%)，将混合后的土壤与溶磷真菌磷矿粉发酵液混合(含菌量为6. 0X105 cfu / g 土)， 或者对照磷矿粉培养液混合。将含有溶磷菌或者对照培养液的土壤装在栽培桶内栽培基质 上方，达到栽培桶上方边缘(栽培桶上部1/5部位)，种植时使得土壤含水量为60-75%，测得 种植土壤有效磷含量9. 23mg/kg。
[0037] 7)将绿豆种子(鄂绿4号）种到桶内上部1/5的土壤中，出苗后每个桶留2株健 壮的苗。收获时，对照组土壤有效磷含量4.61±0. 12mg/kg (n=10)，与其它溶磷菌组比较， Z04桶栽土壤有效磷含量最高（5. 23±0· 19mg/kg，n=10)，土壤中Z04的数量也是最高[( 3·93±0·27)Χ104 cfu / g 土，n=10]，并且差异显著（Ρ〈0·05)。Z04 单株荚数(个)、 单荚粒数(粒）和单株产量（g)与其它组相比最高(分别是20. 80±0. 66、9. 90±0. 38和 8. 24±0. 37, n=10)，其中单株荚数和单株产量与其它组相比差异显著〇7〈0. 05)。Z04单株
【权利要求】
1. 一种作物专用型生物磷肥，其特征在于：该生物磷肥为溶磷真菌磷矿粉发酵液，溶 磷真菌为/?i职r XXR-B1，GenBank登陆号KF572126时，制得玉米专用型生物 磷肥。
2. -种作物专用型生物磷肥，其特征在于：该生物磷肥为溶磷真菌磷矿粉发酵液，溶 磷真菌为腫5/7. XXR-G，GenBank登陆号KF572132时，制得大豆专用型生物磷肥。
3. -种作物专用型生物磷肥，其特征在于：该生物磷肥为溶磷真菌磷矿粉发酵液，溶 磷真菌为Fungal sp. XXR-E，GenBank登陆号KF572130时，制得绿豆专用型生物磷肥。
4. 一种作物专用型生物磷肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 采集土壤样本，并将该土壤样本经梯度稀释后接种于溶磷菌筛选培养基中，在 25°C -30°C下培养5-10天，使土壤样本中的真菌菌落边缘出现溶磷圈，将产生溶磷圈的真 菌菌落转接至新的溶磷菌筛选培养基上，在25°C _30°C下培养3-5天，进行分离纯化后得到 溶磷真菌； 2) 将经分离纯化后的溶磷真菌置于磷矿粉发酵液中，在28°C -30°C下发酵培养15-18 天，得到溶磷真菌磷矿粉发酵液，该溶磷真菌磷矿粉发酵液即为专用型生物磷肥。
5. 根据权利要求1所述的作物专用型生物磷肥制备方法，其特征在于：步骤1)中将土 壤样本经梯度稀释为ΚΓ1、1(Γ 2、1(Γ3。
6. 根据权利要求1所述的作物专用型生物磷肥制备方法，其特征在于：步骤1)中溶磷 菌筛选培养基是将葡萄糖、磷酸钙、6水氯化镁、7水硫酸镁、氯化钾、硫酸铵、琼脂以质量比 为 15:5:5:0. 25:0. 2:0. 1:15 混合。
7. 根据权利要求1所述的作物专用型生物磷肥制备方法，其特征在于：步骤2)中 磷矿粉发酵液是将葡萄糖、磷矿粉、6水氯化镁、7水硫酸镁、氯化钾、硫酸铵按重量比为 10:10:5:0. 25:0. 2:0. 1 混合。
【文档编号】C05F11/08GK104086237SQ201410304205
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】陈国华, 程思, 吴广, 陈汉臣, 王凤玲, 陈禹 申请人:三峡大学