一种组织培养装置及光皮桦微型扦插快繁方法
【专利摘要】一种组织培养装置，属于生物【技术领域】。该组织培养装置包括培养容器主体和盖子，其特征在于：所述培养容器主体下部装有半固体培养基，半固体培养基的上表面设有固定片，所述固定片上设有开孔，用于插入植物外植体。结合该装置本发明还提供了一种光皮桦微型扦插快繁方法，该方法步骤简单，生长速度快，减少了变异的发生。通过该方法，可以实现在体外进行无菌培养，在一个很小的范围以及有限的培养时间内，用较少的外植体材料繁殖出大量的植株。
【专利说明】一种组织培养装置及光皮桦微型扦插快繁方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种组织培养装置以及采用该培养装置用于光皮 桦微型扦插快繁。
【背景技术】
[0002] 微型扦插技术指离体培养带一个芽的茎段，使顶芽或腋芽发育成苗。它与传统的 扦插极为类似，但是微型扦插一般不需要添加外源激素来打破顶端优势，有时也可加入少 量生长素，不仅促使腋芽萌发，同时也会产生较好的生根效果。微型扦插技术的最大优点 是通过体外无菌培养，在一个很小的范围以及有限的培养时间内，用尽可能少的外植体材 料繁殖出尽可能多的植株。近年来微型扦插技术在茶树5·Υ/--?/75·Υ5·)、北美海棠 (ife/iAs cv. "American")、木薯escWeflia)等木本植物育种中应用， 而关于光皮桦(及的微型扦插技术目前尚未报道。然而，传统的微型扦 插培养基均为固体培养基，若培养过程中需更换培养基，同时需保持植株的完整性，采用固 体培养基不能实现，尤其针对那些须根性植物，从固体培养基中取出植株，不能完整保持植 株的根系，甚至会导致植株的死亡。
【发明内容】
[0003] 鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明的目的之一在于提供一种组织培养装 置，通过在该装置中加入适合特定植物外植体培养的营养元素，制成半固体培养基，当培养 一段时间后，培养基中的营养不再满足或不适合该外植体的生长时，吸出培养基而不用将 组培苗从培养装置中拔出，保持了根系的完整性，避免了固体培养基更换造成根系破坏对 植株生长带来的负面影响。本发明的目的之二是利用该培养装置并结合特定培养基和培养 方法进行光皮桦微型扦插快繁。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下： 一种组织培养装置，包括培养容器主体和盖子，其特征在于：所述培养容器主体下部装 有半固体培养基，半固体培养基的上表面设有固定片，所述固定片上设有开孔，用于插入植 物外植体。
[0005] 所述的一种组织培养装置，其特征在于：所述培养容器主体位于固定片（3)下方 的容器壁上设有向外延伸的小管，小管的端口设有管帽或塞子。
[0006] 所述的一种组织培养装置，其特征在于：所述固定片为滤纸。
[0007] 光皮桦微型扦插快繁方法，其特征在于其采用上述的组织培养装置进行培养。
[0008] 光皮桦微型扦插快繁方法，其特征在于包括如下步骤： 1) 制备半固体培养基，倒入培养容器中，高压灭菌后培养基自然冷却成半凝固状态； 2) 在无菌操作台上，将经过高温灭菌的滤纸放置在培养容器中的半固体培养基表面； 3) 选择长势一致的光皮桦同一无性系无菌苗，在无菌操作台上，剪取第3-4和5-6节茎 段，每个外植体上顶端留半个叶片； 4) 将外植体的形态学下端穿过滤纸孔插入半固体培养基中，扶正，拧紧培养容器的盖 子，置于培养架上； 5) 放入培养室内光照培养，温度保持在23-27 °C，光/暗周期16h/8h，光照强度 1000-1500LX ； 6) 培养30天后，取下小管的塞子或盖子，从小管口吸出半固体培养基，并注入新的培 养基让幼苗继续生长；或者当幼苗生长到一定高度后，取下盖子，用吸取装置穿过固定片的 边缘吸出半固体培养基，并注入新的培养基让幼苗继续生长。
[0009] 所述的光皮桦微型扦插快繁方法，其特征在于所述的半固体培养基为MSB5,配方 如下： 半固体培养基（1L) :MS大量母液（20 X ) 50ml，MS微量母液（20 X ) 50 ml ;MS铁盐母液 (20X) 50 ml ;B5 有机母液（100X) 10 ml，蔗糖 30 g，琼脂粉 2.8 g，PH 调至 5.9 ; 其中 MS 大量母液（20X)配方为：NH4N03 33g、KN03 38g、KH2P04 3 . 4g、KH2P04 3 . 4g、 MgS04 · 7H20 7. 4g，用去离子水定容到1L ; MS 微量母液（20X )配方为：KI 0· 166g、Η3Β031· 24g、MnS04 · 4H20 4. 46g、ZnS04 · 7H20 1. 72g、Na2Mo04 · 2H20 0· 05g、CuS04 · 5H20 0· 005g、CoCl2 · 6H20 0· 005g，用去离子水定容到 1L； MS 铁盐母液（20X )配方为：FeS04 · 7H20 5. 56g、Na2EDTA · 2H20 7. 46g，用去离子水定 容到1L ; B5有机母液（100X )配方为：肌醇10g、烟酸0. lg、VB6 0. lg、VBi 0. lg，用去离子水定 容到1L。
[0010] 本发明提供的一种组织培养装置，可以用于不同植物的半固体培养，尤其适用于 须根系植物，如光皮桦，采用该装置与采用液体培养基相比，克服了水分胁迫等原因造成外 植体生长发育不良，或因液体培养基的流动性导致其难以生根。与固体培养基相比，避免了 培养基更换对根系造成的破坏，此外，相对固体培养基而言，采用半固体培养基其生根数量 更多，根的长度更长，极大程度地缩短了生长周期。
[0011] 光皮桦是一种须根系植物，为我国特有树种，因其速生、材 质优良，已成为我国南方山地造林的首选树种。本发明提供的光皮桦微型扦插快繁方法可 为光皮桦优良单株的扩繁推广提供前期的组培苗，采用该方法与传统的组培而言，一是采 用半固体培养基，避免了用固体培养基培养时，更换培养基时将植株取出造成根系不完整 和植株死亡；二是通过特定的配方，制成培养基后能实现生根和发芽同时进行，而不需要先 在诱导培养基培养，然后转移至生根培养基中，简化了培养步骤；三是采用第3-4和5-6节 茎段，每个外植体上顶端留半个叶片，并在特定的光照条件下，生长速度快，发芽和生根情 况良好，长势相对一致，四是本方法可以不使用激素，减少了变异的发生。通过该方法，可以 实现在体外进行无菌培养，在一个很小的范围以及有限的培养时间内，用较少的外植体材 料繁殖出大量的植株。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1和图2为组织培养装置的结构示意图； 图3为固定片的结构示意图； 其中：1-培养容器主体；2-半固体培养基；3-固定片；4-外植体；5-盖子；6-小管； 7_开孔。
【具体实施方式】
[0013] 现结合本发明的实施例对本发明作进一步说明。
[0014] 实施例1 : 图1为本发明提供的组织培养装置的结构示意图，包括培养容器主体1和盖子5,培养 容器主体1和盖子5为现有技术，在此不做赘述。与现有技术不同的是，本发明在容器主体 1内设有固定片3,培养容器主体1下部为半固体培养基2,固定片3即位于半固体培养基2 的上表面，固定片3上设有开孔7,用于插入植物外植体2,外植体即固定在固定片上。固定 片3可以用滤纸通过打孔器打孔制成，也可以采用其它材料，固定片需要满足如下要求：一 方面能固定外植体，另一方面不会限制植株生长。采用该装置进行培养，在需要更换培养基 时，可以用注射器外接一根长吸管，长吸管从固定片3的边缘插入，先将原来的半固体培养 基2吸出，再用干净的注射器和吸管向培养容器主体1中注入处理所用的培养基。
[0015] 为了更为方便地更换培养基，本发明对培养容器主体1进行改进，即在培养容器 主体1位于固定片3下方的容器壁上设置一个向外延伸的小管5,小管6与培养容器主体1 一体成型，小管6的端口设有管帽或塞子，在更换培养基时将塞子或者盖子取下，通过吸取 装置如注射器、吸管等工具从小管6处将培养基吸出或注入，见图2。
[0016] 实施例2: 采用实施例1中的装置进行光皮桦微型扦插快繁时，操作步骤如下： 1) 制备半固体培养基，倒入培养容器中，高压灭菌后培养基自然冷却成半凝固状态； 2) 在无菌操作台上，将经过高温灭菌的滤纸放置在培养容器中的半固体培养基表面； 3) 选择长势一致的光皮桦同一无性系无菌苗，在无菌操作台上，剪取第3-4和5-6节茎 段，每个外植体上顶端留半个叶片； 4) 将外植体的形态学下端穿过滤纸孔插入半固体培养基中，扶正，拧紧培养容器的盖 子，置于培养架上； 5) 放入培养室内光照培养，温度保持在23-27 °C，光/暗周期16h/8h，光照强度 1000-1500LX ； 6) 当幼苗生长到一定高度后，当采用图1所示的装置时，取下盖子5,用吸取装置穿过 固定片3的边缘吸出半固体培养基，并注入新的培养基。当采用图2所示的装置时，取下小 管6的塞子或盖子，从小管口吸出半固体培养基，并注入新的培养基让幼苗继续生长。
[0017] 实施例3 :光皮桦半固体培养基配方 采用MSB5半固体培养基，具体配方如下： MSB5半固体培养基（1L) MS大量母液（20 X) 50ml MS微量母液（20 X ) 50 ml MS铁盐母液（20 X) 50 ml B5有机母液（100 X) 10 ml 鹿糖30 g 琼脂粉2. 8 g PH调至5. 9 具体母液配方如下： MS大量母液（20X) (1L)
【权利要求】
1. 一种组织培养装置，包括培养容器主体（1)和盖子（5)，其特征在于：所述培养容器 主体（1)下部装有半固体培养基（2)，半固体培养基（2)的上表面设有固定片（3)，所述固定 片（3 )上设有开孔（7 )，用于插入植物外植体。
2. 根据权利要求1所述的一种组织培养装置，其特征在于：所述培养容器主体（1)位于 固定片（3)下方的容器壁上设有向外延伸的小管（6)，小管（6)的端口设有管帽或塞子。
3. 根据权利要求1或2所述的一种组织培养装置，其特征在于：所述固定片（3)为滤 纸。
4. 光皮桦微型扦插快繁方法，其特征在于其采用权利要求1-3中任何一项所述的组织 培养装置进行培养。
5. 光皮桦微型扦插快繁方法，其特征在于包括如下步骤： 1) 制备半固体培养基，倒入培养容器中，高压灭菌后培养基自然冷却成半凝固状态； 2) 在无菌操作台上，将经过高温灭菌的滤纸放置在培养容器中的半固体培养基（2)表 面； 3) 选择长势一致的光皮桦同一无性系无菌苗，在无菌操作台上，剪取第3-4和5-6节茎 段，每个外植体上顶端留半个叶片； 4) 将外植体的形态学下端穿过滤纸孔插入半固体培养基（2)中，扶正，拧紧培养容器的 盖子（5)，置于培养架上； 5) 放入培养室内光照培养，温度保持在23-27 °C，光/暗周期16h/8h，光照强度 1000-1500LX ； 6) 当幼苗生长到一定高度后，取下小管（6)的塞子或盖子，从小管口吸出半固体培养基 (2)，并注入新的培养基让幼苗继续生长。
6. 根据权利要求5所述的光皮桦微型扦插快繁方法，其特征在于所述的半固体培养基 (2)为MS*B5,配方如下： 半固体培养基（1L) :MS大量母液（20 X ) 50ml，MS微量母液（20 X ) 50 ml ;MS铁盐母液 (20X) 50 ml ;B5 有机母液（100X) 10 ml，蔗糖 30 g，琼脂粉 2.8 g，PH 调至 5.9 ; 其中 MS 大量母液（20X)配方为：NH4N03 33g、KN03 38g、KH2P04 3 . 4g、KH2P04 3 . 4g、 MgS04 · 7H20 7. 4g，用去离子水定容到1L ; MS 微量母液（20X )配方为：KI 0· 166g、Η3Β031· 24g、MnS04 · 4H20 4. 46g、ZnS04 · 7H20 1. 72g、Na2Mo04 · 2H20 0· 05g、CuS04 · 5H20 0· 005g、CoCl2 · 6H20 0· 005g，用去离子水定容到 1L； MS 铁盐母液（20X )配方为：FeS04 · 7H20 5. 56g、Na2EDTA · 2H20 7. 46g，用去离子水定 容到1L ; B5有机母液（100X )配方为：肌醇10g、烟酸0. lg、VB6 0. lg、VBi 0. lg，用去离子水定 容到1L。
7. 根据权利要求5所述的光皮桦微型扦插快繁方法，其特征在于步骤6)为：当幼苗生 长到一定高度后，取下盖子（5)，用吸取装置穿过固定片（3)的边缘吸出半固体培养基（2)， 并注入新的培养基让幼苗继续生长。
【文档编号】A01H4/00GK104186311SQ201410372236
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】张俊红, 吴骏, 童再康 申请人:浙江农林大学