拟南芥ttg1基因在植物抗盐抗旱方面的新应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程应用【技术领域】，具体涉及拟南芥 TTG1 基因（拟南芥基因组编码为At5g24520）在培育耐盐耐旱植物新品种方面的应用。该基因使拟南芥耐受盐胁迫或干旱胁迫生长环境，转化该基因的植物体可耐受盐胁迫或干旱胁迫的生长环境。本发明经过一系列实验研究，发现该基因特异性的调控植物对盐和干旱等引起的渗透胁迫反应，表现出抗盐抗旱特性，证明了该基因在植物抗盐抗旱方面有着巨大的潜在的应用功能，通过将该基因超表达并转化进植物体，可以获得耐盐、耐旱胁迫相关的新的转基因植物品种，从而实现植物的抗盐和抗干旱功能，本发明为培育抗盐抗干旱的转基因作物新品种奠定了理论和生产实践基础。
【专利说明】拟南芥TTG1基因在植物抗盐抗旱方面的新应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程应用【技术领域】，具体涉及拟南芥77^7基因(拟南芥基因组编码为At5g24520)在培育耐盐耐旱植物新品种方面的应用。
【背景技术】
[0002]当前，全球水资源短缺日趋加剧，而人类大量使用化肥使土壤盐溃化日益严重，制约了农业的持续生产和发展。随着分子生物学和基因工程研究的深入，国际上很多科技工作者也在努力寻找与植物抗盐相关的基因，拟通过基因工程技术改良作物的抗盐性，但是目前可利用的成果甚少。
[0003]拟南芥属十字花科鼠耳芥属植物,又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草，是植物遗传学、分子生物学常用的模式植物之一，也常用于植物逆境条件下抗性基因研究。
[0004]现有研究一般认为种皮的颜色除作为一个形态指示形状外，也常与植物品质有所关联，因此利用模式植物拟南芥开展种皮色素形成调控机理的研究也有较多成果。拟南芥种皮中色素主要是类黄酮，确切的说是花青素中的原花青素和栎精中的黄酮醇。TTGl基因(拟南芥基因组编码为At5g24520)是调控拟南芥种皮色素的基因之一，所编码的341个氨基酸属于一种WD-repeat蛋白，是类黄酮代谢途径中的一种重要的转录因子，参与调控了拟南芥的多种发育和生化合成途径，包括毛状体的分化、花青素的生物合成、种子粘液的生成、种皮和种皮色素的发育，同时它还能够调节DFR的表达。然而关于此基因的其他用途，特别是植物抗旱方面的研究尚无报道。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供拟南芥TTGl基因(At5g24520基因)在植物抗盐抗旱特性方面的新应用，从而为培育抗盐抗旱植物新品种提供新的可能性。
[0006]本发明所采用的技术方案如下:
拟南芥TTGl基因(At5g24520基因)在植物抗盐抗旱方面的新应用，该基因使拟南芥耐受盐胁迫或干旱胁迫生长环境。
[0007]所述拟南芥TTGl基因(At5g24520基因)在植物抗盐抗旱方面的应用，该基因使拟南芥耐受100 mMNaCl的盐胁迫或200mM甘露醇胁迫生长环境。
[0008]所述拟南芥TTGl基因(At5g24520基因)在植物抗盐抗旱方面的应用，转化拟南芥TTGl基因(At5g24520基因)的植物体耐受盐胁迫或干旱胁迫的生长环境，即通过基因工程手段将拟南芥TTGl基因(At5g24520基因)转化进入其他植物体后，可使该植物体耐受盐胁迫或干旱胁迫的生长环境，所述盐胁迫为NaCl胁迫，干旱胁迫为甘露醇胁迫。
[0009]现有研究表明，拟南芥TTGl基因(At5g24520基因)，其CDS长度为1026 bp，编码341个氨基酸的蛋白，编码一个WD-repeat蛋白，是类黄酮代谢途径中的一种重要的转录因子，参与调控了拟南芥的多种发育和生化合成途径，包括毛状体的分化、花青素的生物合成、种子粘液的生成、种皮和种皮色素的发育，同时它还能够调节DFR的表达，通过调节TT8和TT2的表达控制种皮发育。而本发明通过对拟南芥TTGl基因(At5g24520基因)在高盐高旱逆境中的研究，发现该基因特异性地调控植物对盐和干旱等引起的渗透胁迫反应，表现出抗盐抗旱特性，因此通过该基因的进一步研究和转化，可以培育出新的优良的耐盐耐旱植物品种。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为拟南芥野生型(WT)、Ugl-1和ttgl-2突变体在盐胁迫/干旱下的生理表型，其中图A为拟南芥野生型(WT)、ttgl-Ι和?&.2-之突变体分别在100 mM NaCl,200 mMMan (甘露醇)和0.1 μ M ABA条件下的子叶变绿情况；图B为拟南芥野生型(WT)、Ugl-1和?&.2-J?突变体子叶变绿情况统计；
图2为TTGl在NaCl、甘露醇和ABA胁迫下的表达情况；
图3为TTGl基因的组织表达定位情况，其中图A为拟南芥生长7天时转基因幼苗中TTGl基因的组织表达情况；图B为子叶、茎和根成熟区中TTGl基因的组织表达情况；图C为成熟叶片中TTGl基因的表达情况；图D为根尖和分生区中TTGl基因的组织表达情况；图E为TTGl基因在花器官中的组织表达情况；图F为TTGl基因在果荚中的组织表达情况；图G为拟南芥生长14d后幼苗中TTGl基因的组织表达情况，图H和图1为图G中的部分放大图；
图4为拟南芥野生型(WT)、ttgl-Ι和(反2-J?突变体在NaCl胁迫下的根伸长表型；
图5为干旱胁迫条件下拟南芥野生型(WT)、ttgl-Ι和(反2突变体叶表面远红外成像分析，其中图A为正常情况下突变体和野生型叶片温度检测；图B为相对应的生长的幼苗。
【具体实施方式】
[0011]下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
实施例
[0012](I)验证TTGl基因(At5g24520基因)基因与植物抗盐抗旱相关
为证明TTGl基因(At5g24520基因)与植物抗盐抗旱作用相关，发明人以拟南芥野生型(WT)、ttgl-Ι和ttgl-2突变体进行了对比实验验证。所述ttgl-Ι和ttgl-2突变体为从拟南芥资源中心获得的TTGl基因(At5g24520基因)T-DNA插入突变体(CS89，CS67772)，该突变体的TTGl基因失活，不能正确编码相关蛋白质。
[0013]具体实验验证过程简介如下:
将拟南芥野生型(WT)、iig7-7和突变体种子分别播种于含有100 mM NaCl、含有200 mM甘露醇、含有0.1 μ M ABA的MS培养基上，同时设置未添加其他物质的MS培养基对照，MS培养基琼脂质量含量为0.6%。
[0014]拟南芥培养生长，生长环境为:光/暗周期为8/16h，日光温度22°C，黑暗温度18 0C，相对湿度70%,光照强度90 μ mo I.m_2.s-1。
[0015]待拟南芥种子萌发并生长I周后，进行具体观察。
[0016]实验结果如图1所示，从图中可以看出，在胁迫条件下，即在100 mM NaCl (盐胁迫)和/或200 mM甘露醇(干旱胁迫)的培养基上，ttgl-Ι和ttgl-2突变体种子萌发后，子叶变绿情况受到严重抑制，而野生型(WT)种子能够正常萌发并且子叶变绿生长正常，即在胁迫条件下ttgl-Ι和ttgl-Ι突变体种子子叶变绿能力显著弱于野生型(WT)。
[0017]进一步的ABA实验表明，ttgl-Ι和ttgl-2突变体种子萌发后，子叶变绿情况受到严重抑制，而野生型(WT)种子能够正常萌发并且子叶变绿生长正常，这种现象说明TTGl基因(At5g24520基因)调节植物盐胁迫和干旱胁迫应答依赖于ABA的信号转导途径。
[0018](2) TTGl基因(At5g24520基因)表达受盐胁迫、干旱胁迫以及ABA诱导
以拟南芥野生型(WT)为材料，将野生型(WT)的种子用0.1%升汞进行表面消毒，分别播种于对照、含100 mM NaCl,200 mM甘露醇和0.1 μ M ABA的MS培养基表面，4°C条件下春化3 d,放置于培养间(光/暗为16 h / 8 h,光照强度为0.3^0.4 mmol.m_2.s_S温度18^22 °C，相对湿度80%左右)中培养一周。
[0019]分别提取上述不同处理材料的总RNA，反转录为cDNA。
[0020]通过PCR扩增拟南芥内参基因ACTIN2 (编码肌动蛋白，组成型表达蛋白)片段，将对照及各处理的起始cDNA模板加入量调节至一致，在保证对照及各处理起始cDNA模板加样量基本一致的条件下，PCR扩增TTGl基因片段，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察并比较对照及各处理的PCR产物条带亮度，以判断不同处理对TTGl基因表达量变化的影响。
[0021]结果如图2所示。从图中可以看出，100 mM的NaCl、200 mM的甘露醇、0.1 μ M ABA均能明显诱导TTGl基因的表达。
[0022]与对照相比，100 mM的NaCl、200 mM的甘露醇能够明显诱导TTGl的基因表达，该结果与0.1 μ M ABA处理结果相似。结合ttgl-Ι和ttgl-2突变体表现对100 mM的NaCl、200 mM的甘露醇和0.1 μ M ABA相似的敏感表型(B卩100 mM的NaCl、200 mM的甘露醇和0.1μ M ABA均可明显抑制ttgl-Ι和-J?突变体种子萌发后的生长)，这种结果表明NaCl和甘露醇参与诱导的TTGl基因表达依赖于ΑΒΑ，以调节植物对盐和干旱等逆境的应答反应。
[0023](3) TTiW基因(At5g24520基因)在拟南芥组织中的表达分析
将TTGl的启动子片段与⑶S报告基因的编码区融合，\MIpTTG1::pCAMBIA1381载体，并采用农杆菌侵染拟南芥花絮的方法获得了野生型拟南芥转化TTG1::GUS的转基因植株。材料具体构建方法如下:
(I)从拟南芥网站(http://www.arabidopsis.0rg)上，获得At5g24520基因的启动子序列，根据P以载体(花椰菜病毒35S启动子，能有效表达外源基因，含有潮霉素抗性基因)多克隆位点，利用primerf.0软件设计特异性引物，以拟南芥基因组DNA为模板，PCR扩增出At5g24520基因启动子序列，经过对启动子片段和/7以通以2激7质粒的双酶切、连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，进一步PCR、双酶切筛选重组质粒并测序比对，即获得含有At5g24520基因启动子序列的/7/7^7:.77以通以7激7载体。
[0024]ViympTTGl::pCAMBIA1381载体转化农杆菌GV3101感受态细胞，挑取阳性农杆菌单菌落扩大培养至OD6tltl=L 2^1.6间。
[0025](3)当拟南芥野生型WT幼苗花序长至5?10 cm高时，进行农杆菌介导的转化，即将拟南芥花絮浸没在菌液中，每株浸花30 S，将浸花过的苗盆平放在托盘中，以塑料膜覆盖保持湿度，避光放置16?24 h后取出，正常培养；5-7天后，重复浸染一次。
[0026](4)将上述农杆菌侵染的拟南芥收获的种子，撒种于含25 mg/L潮霉素的MS培养基平板上，4°C春化3 d，移到材料室培养，阳性植株对潮霉素有抗性，可正常生长，阴性植株对潮霉素敏感，不能正常生长最后死亡。
[0027](5)将筛选出的阳性幼苗移栽到营养土中，对2周大的幼苗分别取幼嫩叶片进行GUS染色检测，将检测为阳性的幼苗继续培养至种子成熟，所得种子继续用潮霉素筛选并做GUS染色检测鉴定，并将阳性苗进一步扩大繁殖。
[0028]将转基因拟南芥种子放在1.5 ml离心管中,用0.1%升萊表面消毒5 min,以无菌水冲洗51次。选取尖头滴管吸取种子，将种子点播于MS固体培养基(MS盐+3wt%蔗糖+0.6wt%琼脂，pH 6.0)上，4°C条件下春化3 d，放置于培养间(光/暗为16 h / 8 h，光照强度为0.3-0.4 mmol.m_2.s_S温度18_22°C，相对湿度80%左右)中培养一周，移入质量比1: 2的营养土 /蛭石中，放入培养室(温度为20±2°C，生长的光暗周期为16 h / 8 h，相对湿度(80%)至种子开始成熟。然后采用⑶S染色方法(根据组织大小取适量⑶S染液于适当容器中(保证浸没组织)，避光条件下，37°C水浴染色至少4-5h，然后依次用50v%乙醇脱色、75￥%乙醇脱色和无水乙醇进行脱色，直至叶绿素全部被脱去，进行染色情况观察并照相)对其各个器官(根、茎、叶以及花和种子等)进行染色。
[0029]⑶S染色液的配制方法:称取I mg的X-Gluc (5_溴_4氯_3_吲哚-β -葡糖醛酸)放入锡箔纸包好的1.5mL的EP管中，入1-2滴N，N- 二甲基甲酰胺使X-Gluc完全溶解，依次加入980 μ L 100禮磷酸缓冲液化!1=7.0)，1(^1^ 5mM铁氰化钾和10 μ L 5 mM亚铁氰化钾，最后加入I μ L Triton X-100，混匀即可。
[0030]结果如图3所示。从图中可以看出，TTGl基因在拟南芥根茎叶和花中均有表达，表明TTGl基因调节拟南芥抗逆体现各个器官组织，体现在多个方面。
[0031](4) TTGl基因(At5g24520基因)特异调节植物盐胁迫反应
TTGl基因(At5g24520基因)特异调节植物盐胁迫反应的实验过程简要介绍如下。
[0032]首先，将拟南芥野生型(WT)、iig7-7和(反2-J?突变体种子经升汞消毒5飞min后，在超净台内用灭菌水冲洗5飞次，分别点播于琼脂粉为1.0wt%的MS培养基中；
其次，4°C春化2?3天，然后置于材料室中垂直培养3?4天至根长为Icm左右；
最后，在超净台内分别将拟南芥野生型(WT)、ttgl-Ι和(反2-之突变体置于100 mMNaCl、琼脂粉为1.0被％的1^培养基中，同时设置对照，使拟南芥倒置垂直生长，以观察其在盐胁迫下的根生长情况。
[0033]结果如图4所示。从图中可以看出，在100 mM似(:1处理的条件下，《貧7-7、《貧7-之突变体的根伸长反应受到了明显的抑制，这说明TTGl基因参与了 NaCl胁迫下的根伸长生长反应。
[0034](5) TTGl基因(At5g24520基因)调节植物气孔运动参与植物抗旱反应
植物叶片表面温度，可以直接反应其失水的快慢，反应气孔开度，从而指示其植物抗旱性能。为证明TTGl基因(At5g24520基因)调节干旱胁迫反应，发明人对生长2周拟南芥野生型(WT)、ttgl-Ι和(反2-J?突变体的幼苗，干旱处理I周(即停止浇水I周)，进行叶面温度检测。
[0035]结果如图5所示。从图中可以看出，在干旱情况下,通过远红外成像仪(ThermaCAM SC3000,美国，配备320X240 PtSi探测器，在室温下温度分辨率小于0.03°C，安装在距叶片35 - 45 cm的高度，同时与监视器连接，获得可视的植物热成像)，检测发现突变体ttgl-Ι^ (反2-之的叶片叶温明显低于野生型,从而表明TTGl蛋白调节植物的气孔运动,参与调节直接对干旱的应答反应。
[0036]综上所述，经过一系列实验研究，发明人证明了 TTGl基因(At5g24520基因)在植物抗盐抗旱方面有着巨大的潜在的应用功能，通过将该基因超表达并转化进植物体，可以获得耐盐、耐旱胁迫相关的新的转基因植物品种，从而实现植物的抗盐和抗干旱功能，本发明为培育抗盐抗干旱的转基因作物新品种奠定了理论和生产实践基础。
【权利要求】
1.拟南芥r/^7基因在植物抗盐抗旱方面的新应用，其特征在于，该基因用于拟南芥耐受盐胁迫或干旱胁迫生长环境。
2.如权利要求1所述拟南芥TTGl基因在植物抗盐抗旱方面的应用，其特征在于，该基因使拟南芥耐受100 mMNaCl的盐胁迫或200mM甘露醇胁迫生长环境。
3.如权利要求1所述拟南芥TTGl基因在植物抗盐抗旱方面的应用，其特征在于，转化拟南芥TTGl基因的植物体耐受盐胁迫或干旱胁迫的生长环境。
【文档编号】A01H5/00GK104263735SQ201410372200
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】张骁, 赵翔, 王琳丹, 王进, 赵青平, 臧毅浩 申请人:河南大学