一种果寡糖饲料添加剂的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种果寡糖饲料添加剂的制备方法，步骤如下：(1)配制蔗糖溶液，制得反应液；(2)向反应液中接种黑曲霉菌种液，发酵培养，然后加入酿酒酵母继续发酵，灭菌，制得果寡糖饲料添加液；(3)将果寡糖饲料添加液经干燥、粉碎，制得果寡糖饲料添加剂。本发明以从土壤中筛选获得具有高果糖转移基酶活性的黑曲霉菌种直接发酵生产果寡糖，该菌种所产生的果糖转移基酶的活性较传统黑曲霉所产酶活性提高15-20％以上，同时采用酵母发酵，使终产品中果寡糖三糖含量提高20％以上。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种果寡糖饲料添加剂的制备方法，属于功能糖制造【技术领域】。 一种果寡糖饲料添加剂的制备方法
【背景技术】
[0002] 随着中国近年来养殖业的不断发展，在饲料中滥用抗生素的问题越来越严重。据 统计，中国所生产的抗生素一半以上用于在饲料中添加，由此而导致的动物食品中抗生素 残留超标、耐药性细菌甚至"超级细菌"等问题不断出现，对人类的健康产生重大威胁，鉴于 抗生素的种种副作用和对食品安全的影响，欧盟已经于2006年全面禁止在动物饲料中添 加抗生素，从目前来看，中国禁止在饲料中使用抗生素也是大势所趋。
[0003] 果寡糖又称低聚果糖，是由1?3个果糖基通过β (2 - 1)糖苷键与蔗糖中的果糖 基结合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。它能明显改善肠道内微生物种 群比例，减少和抑制肠内腐败物质的产生，抑制有害细菌的生长，调节肠道内平衡；促进微 量元素铁、钙的吸收与利用，防止骨质疏松症，增强免疫调节功能，被誉为继抗生素时代后 最具潜力的新一代添加剂--促生物质。然而由于果寡糖的价格比较昂贵，极大地限制了 果寡糖作为抗生素的替代品在饲料中的使用。
[0004] 中国专利文献CN 1160769Α(申请号96106345. 9)公开了一种低聚果糖的制备方 法，以蔗糖为原料，收集能产生果糖转移酵素的麴菌体，然后加入蔗糖溶液，这样麴菌产生 的酵素使蔗糖液起反应，反应温度为40°C-60°C，反应进行20- 25小时，将反应后的反应 液脱色、脱盐、浓缩，就可得到含本发明低聚果糖含量55%以上的糖液。
[0005] 中国专利文献CN1290753A(申请号00130200. 0)公开了一种新型机能食品的制备 方法，该制备方法工艺简单，能提高有效成份蔗果三、四、五糖，使蔗糖溶液中低聚果糖的 转化率提高，它采用黑曲霉（Aspergillus nigerV.Tiegh)菌种，经二级培养得到果糖转 移酶，加入浓度为30%?50%的蔗糖溶液中，在酶化罐内调pH值为5?8,于62?70°C 下进行一次酶化接触反应，反应进行8?10小时，一次酶化的产品进行一次纳滤处理， 纳滤后的滤出液糖浆进行二次酶化，然后将酶化的糖浆再进行二次纳滤处理。
[0006] 但上述技术方案仍然无法大批量高效生产果寡糖用于饲料添加。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的不足，提供一种果寡糖饲料添加剂的制备方法。经过本发 明生产方法制备的果寡糖饲料添加剂成本低廉，非常适合作为抗生素的替代品在饲料中添 加使用。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] -种果寡糖饲料添加剂的制备方法，步骤如下：
[0010] ⑴配制质量浓度为25%?60%的蔗糖溶液，调蔗糖溶液的pH5?6,温度20? 40°C，制得反应液；
[0011] (2)向步骤⑴制得的反应液中接种黑曲霉菌种液，菌种按体积百分比5?10% 接种量接种，在20?40°C条件下，发酵培养20?25h，然后按1?3%接种量加入酿酒酵母 继续发酵10?15h，灭菌，制得果寡糖饲料添加液；
[0012] 所述黑曲霉为黑曲霉菌株（Aspergillus niger)BLCY-02,该菌株已于2014年07 月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No. 9449 ;
[0013] (3)将步骤（2)制得的果寡糖饲料添加液经干燥、粉碎，制得果寡糖饲料添加剂。
[0014] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中的黑曲霉菌种液按如下方法制备：
[0015] I、将黑曲霉BLCY-02接种于种子培养基中，在25?40°C、通气量200?800ml/min 条件下培养25?45小时，制得种子液；
[0016] 所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
[0017] 马铃薯5?10%，蔗糖3?8%，磷酸二氢钾0· 1?0· 3%，硫酸镁0· 1?0· 5%， 硝酸钠〇· 1?〇· 5%，余量水，ρΗ5· 5?6. 5 ;
[0018] II、将步骤I制得的种子液按体积百分比1?5%的比例接种于扩大培养基中，在 28?30°C，通风量200?800ml/min，培养25?50h，制得黑曲霉菌种液；
[0019] 所述扩大培养基组分如下，均为重量百分比：
[0020] 蔗糖5?10%，麸皮3?8%，玉米粉1?2%，酵母膏1?2%，硫酸镁0. 1? 〇· 5%，磷酸二氢钾0· 1?0· 5%，余量水，pH值5. 5?6. 5。
[0021] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中的酿酒酵母为购自安琪酵母公司的酿酒酵 母。酿酒酵母的添加目的为快速消耗反应液中的剩余蔗糖和葡萄糖制备蛋白质，因此本领 域技术人员也可以根据需要选择其他酿酒酵母。
[0022] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中黑曲霉的接种量为体积百分比的5%。
[0023] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中酿酒酵母的接种量为体积百分比的1%。
[0024] 有益效果
[0025] 1、本发明以从土壤中筛选获得具有高果糖转移基酶活性的黑曲霉菌种直接发酵 生产果寡糖，该菌种所产生的果糖转移基酶的活性较传统黑曲霉所产酶活性提高15-20% 以上，同时采用酵母发酵，使终产品中果寡糖三糖含量提高20%以上。
[0026] 2、本发明最后加入酵母发酵剩余的葡萄糖和蔗糖，不仅使果寡糖三糖含量升高 20%以上，同时生产的酵母含有大量的蛋白质和其它营养元素，应用在饲料中提高饲料的 营养品质。
[0027] 3、传统生产工艺采用酵母发酵后，分离的蛋白无法加以利用被白白丢弃，造成了 环境污染，本专利不用除去蛋白，简化了生产工艺，减少了饲料中蛋白的添加量，降低了饲 料成本，保护了生态环境。
[0028] 4、本发明采用黑曲霉菌种直接发酵，省去了提取酶的过程，同时省去了过滤、离交 脱色等精制过程，使生产成本大大降低，较传统生产方法降低成本达12000-15000元/吨左 右，使产品的竞争力大大增强。
[0029] 5、本发明产品应用在饲料中可选择性地使肠道中有益菌群如双岐杆菌、乳酸杆菌 等快速增殖，使有益菌群在肠道中占有优势，抑制有害菌的生长，减少有毒物质（如内毒 素、氨类等）的形成，对肠粘膜细胞和肝具有保护作用，在畜禽的大肠内被细菌发酵生成 L 一乳酸，可以溶解钙、镁、铁等矿物质，促进畜禽对矿物质的吸收。以促进生长发育和防止 骨质疏松症。同时还可促进维生素 Bl、B2、B3、B6、B12及叶酸的自然形成。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于 此。
[0031] 实施例1
[0032] 一株黑曲霉（Aspergillus niger)BLCY-02, 2014年07月15日保存于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 9449,地址：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0033] 本发明所述黑曲霉（Aspergillus niger)BLCY_02的原始菌株分离于山东德州百 龙创园低聚果糖生产车间附近的土壤，具体分离过程如下：
[0034] (1)富集培养
[0035] 选取山东德州百龙创园低聚果糖生产车间附近的土壤，用小铲子除去表土，取离 地面5-15cm处的土壤约10g，用无菌水稀释10倍，加入察氏培养基进行富集培养，察氏培 养基成分：硝酸钠〇. 3% ;磷酸氢二钾0. 1% ;硫酸镁（MgS04 · 7H20)0. 05% ;氯化钾0. 05% ; 硫酸亚铁0.001%;蔗糖3(%;?!1为6.0 ;培养温度为281：，培养2811。
[0036] (2)纯种分离
[0037] 采用划线分离法，取一支盛有5ml无菌水的大试管，取步骤（1)中富集培养后的 菌液2ml放入其中稀释，充分振荡分散，用接种环以无菌操作挑取稀释液一环先在平板培 养基一边做第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约60度角，将接种环上剩余物烧掉，待 冷却后同一次划线方法做第二次划线，同法依次做第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿 盖，将培养皿倒置，28-32°C培养28h后，挑取单个菌落接种于10个斜面培养基上，分别编号 01-10。
[0038] 将01-10斜面种子接种于摇瓶培养基中培养28-32°C培养28h，对01-10摇瓶发酵 液β -果糖基转移酶酶活进行测定，06号摇瓶酶活最高，达到655U/ml。
[0039] 平板培养基成分：硝酸钠0. 3 % ;磷酸氢二钾0. 1 % ;硫酸镁（MgS04 · 7H20) 0. 05 % ; 氯化钾0.05% ;硫酸亚铁0.001 % ;蔗糖3% ;琼脂2%，pH为6.0 ;
[0040] 摇瓶培养基成分：硝酸钠0· 3 % ;磷酸氢二钾0· 1 % ;硫酸镁（MgS04 · 7H20) 0· 05 % ; 酵母膏0· 5% ;蔗糖5%，pH为4· 0-6. 0 ;
[0041] (3)诱变筛选
[0042] 对06号菌种进行紫外线诱变，紫外线诱变采用15W紫外线灯20cm照射，照射时间 为120s，得到的高产菌种再进行亚硝基胍诱变处理，最终得到高产β-果糖基转移酶的高 产菌株命名为BLCY-02,其酶活达到1000U/ml。
[0043] 酶活测定用 ρΗ5· 5、50mmol/L Na2HP04_NaH2P04 缓冲溶液配制，10% (w/v，单位 g/ ml)的蔗糖溶液作底物，加入适量的酶液（控制三糖最终生成量10%)，40°C水浴振荡反应 40min后，立即于100°C沸水浴中15min，终止反应，离心，取上清液测定各糖组分含量。
[0044] 酶活定义如下：在上述反应条件下，每分钟产生1 μ mol鹿果三糖所需酶量为转移 酶1个活力单位（U)。
[0045] 生物学形态
[0046] 平板培养基可见分布有较多独立分布的单菌落，呈黑褐色，直径15?20pm，长约 1?3mm，壁厚而光滑。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有 成串褐黑色的球状，直径2. 5?4. 0 μ m。分生孢子头球状，直径700?800 μ m，褐黑色。蔓 延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。分生孢子 头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一。
[0047] 实施例2
[0048] -种果寡糖饲料添加剂的制备方法，步骤如下：
[0049] (1)配制质量浓度为25%的蔗糖溶液，调蔗糖溶液的pH5,温度20°C，制得反应 液；
[0050] (2)向步骤⑴制得的反应液中接种黑曲霉菌种液，接种量为反应液体积的5%， 在20°C条件下，发酵培养20h，然后按体积百分比3%的接种量加入酿酒酵母继续发酵10h， 灭菌，制得果寡糖饲料添加液；
[0051] (3)将步骤（2)制得的果寡糖饲料添加液经带式干燥机干燥、粉碎机粉碎，制得果 寡糖饲料添加剂。
[0052] 所述步骤（2)中的黑曲霉菌种液按如下方法制备：
[0053] I、将黑曲霉BLCY-02接种于种子培养基中，在25°C、通气量200ml/min条件下培养 45小时，制得种子液；
[0054] 所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
[0055] 马铃薯5%，蔗糖3%，磷酸二氢钾0. 1%，硫酸镁0. 1%，硝酸钠0. 1%，余量水， ρΗ5· 5 ;经121°C灭菌30分钟后备用。
[0056] II、将步骤I制得的种子液按体积比的1%接种于扩大培养基中，在28°C，通风量 200ml/min，培养25h，制得黑曲霉菌种液。
[0057] 所述黑曲霉菌株（Aspergillus niger)BLCY_02,该菌株具备高产β -果糖基转移 酶的特点，可用于果寡糖生产，该菌株已于2014年07月15日保存于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研究所。保藏号CGMCC No. 9449。
[0058] 所述扩大培养基组分如下，均为重量百分比：
[0059] 蔗糖5%，麸皮3%，玉米粉1 %，酵母膏1 %，硫酸镁0. 1 %，磷酸二氢钾0. 1 %，余 量水，pH值5.5 ;经121 °C灭菌30分钟后备用。
[0060] 经检测，制得的每百克果寡糖饲料添加剂中果寡糖三糖含量为80g，粗蛋白含量 15g，可直接按需要添加到饲料中作为饲料添加剂使用。
[0061] 实施例3
[0062] -种果寡糖饲料添加剂的制备方法，步骤如下：
[0063] (1)配制质量浓度为60%的蔗糖溶液，调蔗糖溶液的pH6,温度40°C，制得反应 液；
[0064] (2)向步骤⑴制得的反应液中接种黑曲霉菌种液，接种量为反应液体积的40%， 在40°C条件下，发酵培养25h，然后按体积百分比的8%接种量加入酿酒酵母继续发酵15h， 灭菌，制得果寡糖饲料添加液；
[0065] (3)将步骤（2)制得的果寡糖饲料添加液经带式干燥机干燥、粉碎机粉碎，制得果 寡糖饲料添加剂。
[0066] 所述步骤（2)中的黑曲霉菌种液按如下方法制备：
[0067] I、将黑曲霉菌株BLCY-02接种于种子培养基中，在40°C、通气量800ml/min条件下 培养45小时，制得种子液；
[0068] 所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
[0069] 马铃薯10 %，蔗糖8 %，磷酸二氢钾0. 3 %，硫酸镁0. 5 %，硝酸钠0. 5 %，余量水， pH6. 5 ;经121°C灭菌30分钟后备用。
[0070] II、将步骤I制得的种子液按体积百分比的3%接种于扩大培养基中，在30°C，通 风量800ml/min，培养50h，制得黑曲霉菌种液；
[0071] 所述黑曲霉菌株（Aspergillus niger)BLCY_02,该菌株具备高产β -果糖基转移 酶的特点，可用于果寡糖生产，该菌株已于2014年07月15日保存于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研究所。保藏号CGMCC No. 9449。
[0072] 所述扩大培养基组分如下，均为重量百分比：
[0073] 蔗糖10 %，麸皮8 %，玉米粉2 %，酵母膏2 %，硫酸镁0. 5 %，磷酸二氢钾0. 5 %，余 量水，pH值6.5 ;经121 °C灭菌30分钟后备用。
[0074] 经检测，制得的每百克果寡糖饲料添加剂中果寡糖三糖含量为90g，粗蛋白含量 5g，可直接按需要添加到饲料中作为饲料添加剂使用。
[0075] 实施例4
[0076] -种果寡糖饲料添加剂的制备方法，步骤如下：
[0077] (1)配制质量浓度为40%的蔗糖溶液，调蔗糖溶液的pH5. 5,温度30°C，制得反应 液；
[0078] (2)向步骤⑴制得的反应液中接种黑曲霉菌种液，接种量为反应液体积的10%， 在30°C条件下，发酵培养22h，然后按体积百分比的3%接种量加入酿酒酵母继续发酵13h， 灭菌，制得果寡糖饲料添加液；
[0079] (3)将步骤（2)制得的果寡糖饲料添加液经带式干燥机干燥、粉碎机粉碎，制得果 寡糖饲料添加剂。
[0080] 所述步骤（2)中的黑曲霉菌种液按如下方法制备：
[0081] I、将黑曲霉菌株BLCY-02接种于种子培养基中，在35°C、通气量600ml/min条件下 培养35小时，制得种子液；
[0082] 所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
[0083] 马铃薯8%，蔗糖6%，磷酸二氢钾0. 15%，硫酸镁0. 25%，硝酸钠0. 25%，余量水， pH6. 0 ;经121°C灭菌30分钟后备用。
[0084] II、将步骤I制得的种子液按体积百分比的5%接种于扩大培养基中，在29°C，通 风量600ml/min，培养30h，制得黑曲霉菌种液；
[0085] 所述黑曲霉菌株（Aspergillus niger)BLCY_02,该菌株具备高产β -果糖基转移 酶的特点，可用于果寡糖生产，该菌株已于2014年07月15日保存于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研究所。保藏号CGMCC No. 9449。
【权利要求】
1. 一种果寡糖饲料添加剂的制备方法，其特征在于，步骤如下： (1) 配制质量浓度为25%?60%的蔗糖溶液，调蔗糖溶液的pH5?6,温度20?40°C， 制得反应液； (2) 向步骤（1)制得的反应液中接种黑曲霉菌种液，菌种按体积百分比5?10%接种 量接种，在20?40°C条件下，发酵培养20?25h，然后按1?3%接种量加入酿酒酵母继续 发酵10?15h，灭菌，制得果寡糖饲料添加液； 所述黑曲霉为黑曲霉菌株（Aspergillus niger)BLCY-02,该菌株已于2014年07月15 日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No. 9449 ; (3) 将步骤（2)制得的果寡糖饲料添加液经干燥、粉碎，制得果寡糖饲料添加剂。
2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2)中的黑曲霉菌种液按如下 方法制备： I、 将黑曲霉BLCY-02接种于种子培养基中，在25?40°C、通气量200?800ml/min条 件下培养25?45小时，制得种子液； 所述种子培养基组分如下，均为重量百分比： 马铃薯5?10%，蔗糖3?8%，磷酸二氢钾0. 1?0.3%，硫酸镁0. 1?0.5%，硝酸 钠0· 1?0· 5%，余量水，ρΗ5· 5?6. 5 ; II、 将步骤I制得的种子液按体积百分比1?5%的比例接种于扩大培养基中，在28? 30°C，通风量200?800ml/min，培养25?50h，制得黑曲霉菌种液； 所述扩大培养基组分如下，均为重量百分比： 蔗糖5?10%，麸皮3?8%，玉米粉1?2%，酵母膏1?2%，硫酸镁0. 1?0. 5%， 磷酸二氢钾〇· 1?〇· 5%，余量水，pH值5. 5?6. 5。
3. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2)中的酿酒酵母为购自安琪 酵母公司的酿酒酵母。
4. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤⑵中黑曲霉的接种量为体积 百分比的5%。
5. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤⑵中酿酒酵母的接种量为体 积百分比的1%。
【文档编号】A23K1/16GK104116000SQ201410391714
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2014年8月8日
【发明者】李方华, 邵先豹, 干昭波, 窦光朋, 杨腾腾 申请人:山东百龙创园生物科技有限公司