粉防已的种子组培繁殖方法
【专利摘要】本发明公开了一种粉防已的种子组培繁殖方法，包括种子储藏、种子消毒、启动培养、诱导培养、增殖培养、生根培养六大步骤，其特征在于，诱导培养步骤中，首先采用诱导培养基一对萌动膨大的种子进行培养，诱导出无菌苗，然后采用诱导培养基二对无菌苗进行继续培养，从而降低了丛生芽的褐化率并消除了丛生芽的部分玻璃化现象。在增殖培养步骤中采用两步增殖培养，第一步可以快速培养出大量的丛生芽，第二步可以培养出用于生根的健壮丛生芽苗以及部分新增殖的丛生芽，有效的提高本组培方法的繁殖效率，本发明方法培养流程简单，繁殖系数高，操作方便，适宜工厂化育苗，为商业化培养粉防已种苗提供了技术支持。
【专利说明】粉防已的种子组培繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织培养【技术领域】，具体地说是一种粉防已的种子组培繁殖方法。
【背景技术】
[0002]粉防己，又叫汉防己，或者白木香，为防己植物石蟾蜍的根，属野生资源，多年生藤本植物，生于山坡、丘陵地带的草丛及灌木林缘。主产地江西、安徽。有利水消肿，祛风止痛之功效。
[0003]粉防己喜湿润潮湿环境，灌木阴凉处生长，怕干旱、水涝，由于根茎生长较深，所以要求土层松软，沙质泥土，人工栽培种苗主要来源以两方面，一是利用成熟果实经发芽成苗后移植栽培，但由于自身繁殖能力低下，所以很少应用，二是利用强壮成熟根茎培育发芽，这是我国多年从事粉防己栽培的主要方法之一。
[0004]粉防己是中药防己的唯一来源。安徽作为粉防己的主产区之一，主要集中分布在皖南山区的岳西、宁国、祁门、休宁、绩溪、旌德、石台等(市)县。通过对上述地区粉防己野生资源的调查发现:粉防己自然繁殖成活率低，以根的无性繁殖为主，5年以上才能采挖入药，生长年限长。目前粉防己药材主要来源于野生，人工种植受种源的限制和生产周期长等的影响，未见有规模的人工栽培，近十多年以来该药材价格一涨再涨，伴随着人们对野生资源的掠夺式采挖，已使粉防己资源濒临枯竭的边缘。由于粉防己种子繁殖发芽率低，且3年以上的植株才开始渐渐挂果，而根茎繁殖又需要大量强壮新鲜根茎培育发芽，因此现有的种子和根茎繁殖技术都难以适应人工培育的种源需求，为此利用现代生物技术之组织培养技术繁殖粉防己种苗，解决粉防己人工种植的种源问题，进行野生变家种或人工半野生抚育是解决粉防己资源紧缺的有效途径之一。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种粉防已的种子组培繁殖方法，旨在寻求粉防己组织培养繁殖的新途径，提供充足优良的粉防己种苗，以期规模化规范化种植，解决该药材供应紧张的资源问题。
[0006]本发明解决技术问题采用如下技术方案:
[0007]粉防已的种子组培繁殖方法，包括种子储藏、种子消毒、启动培养、诱导培养、增殖培养、生根培养六大步骤，其特点在于，
[0008]所述启动培养是指:将消毒好的种子接种到MS培养基上，在夜温18°C，日温22°C，相对湿度50%?60%暗箱条件下进行种子启动培养，15天后，种子开始萌动膨大；
[0009]所述诱导培养是指:将萌动膨大的种子接种于诱导培养基一中培养，其中，诱导培养基一为 MS+BA2.0—3.0mg/L+NAA0.1-0.2mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5g/L，pH 值为 5.8，培养条件为:光照强度1500LX，光照12h，温度22?26°C，培养4?6周，萌动膨大的种子萌发为无菌苗；将无菌苗分切成l_3mm的块茎段置于诱导培养基二中培养，其中诱导培养基二为 MS+Ca (NO3) 2200mg/L+BAl.0—2.0mg/L+IAA0.2mg/L+VC10-20mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5g/L，pH值为5.8，培养条件为:光照强度1500LX，光照12h，温度22?26°C，培养4周，即可诱导出大量的丛生芽；
[0010]所述增殖培养是指:将生长至5mm以上的丛生芽切下接种于增殖培养基一中，增殖培养基一为 MS+Ca(NO3)2200mg/L+BA1.0mg/L+IAA0.5mg/L+VC10_20mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂5g/L，pH值为5.8，培养条件为:光照强度1500LX，光照12h，温度22?26°C，培养4周，可观察到大量新增殖的丛生芽；将Icm以上的丛生芽丛切割成2-5mm的芽丛块接种于增殖培养基二中，增殖培养基二为 MS+Ca (NO3) 2200mg/L+IBA2.5mg/L+IAA2.0mg/L+VC10-20mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8，培养条件为:光照强度2000?3000LX，光照12h，温度22?26°C，培养4-8周，获得部分长成2?4cm的健壮丛生芽苗以及部分新增殖的丛生芽。
[0011]本发明特点还在于:
[0012]所述种子储藏是指:采集当年秋后粉防已的成熟种子，将种子与含水率40% -50%的湿沙混合，混合体积比为1: 3，混合后放置于4°C的冰箱中储藏2周以上。
[0013]所述种子消毒是指:将储藏的种子取出，于流水中冲洗30min，在超净工作台内用体积分数75%酒精处理30s，无菌水冲洗3次，然后放入质量分数0.1 %的HgCl2中处理5?1min,无菌水冲洗4?6次,然后置于无菌滤纸上吸干水分。
[0014]所述生根培养是指:取增殖培养基二中的长到2?4cm时的健壮丛生芽苗，将其切分成单芽，转入生根培养基上进行生根诱导培养，其中，部分新增殖的丛生芽切割成丛生芽块接种于增殖培养基二中继续增殖培养，所述生根培养基组分为I/2MS+Ca(NO3)210mg/L+IBA2.0mg/L+VC10mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5g/L，pH 值为 5.8 ;在夜温 22°C，日温 26°C，光照强度30001x，每天光照时长12小时的条件下进行生根培养1-2周，将形成根部突起的组培苗再进行瓶外生根培养和苗床培养，可获得大量的粉防已组培种苗。
[0015]与已有技术相比，本发明有益效果体现在:
[0016]本发明采用种子组培繁殖，外植体的消毒成功率达95%以上，诱导得到的无菌苗污染率低，遗传性状稳定，繁殖系数达4-6倍，本发明方法培养流程简单，操作方便，适宜工厂化育苗，为商业化培养粉防已种苗提供了技术支持。
[0017]本发明将种子与湿沙按1:3的体积比混合后放置于4°C的冰箱中储藏，可以使防已种子提前进入生理休眠期。
[0018]本发明种子消毒方法，其消毒成功率达95%以上。
[0019]本发明启动培养步骤，可以缩短种子萌发时间。
[0020]本发明诱导培养步骤中，首先采用诱导培养基一对萌动膨大的种子进行培养，诱导出无菌苗，然后采用诱导培养基二对无菌苗进行继续培养，丛生芽的褐化率降低至5%以下并消除了丛生芽的部分玻璃化现象。
[0021]本发明增殖培养分两步，第一步可以快速培养出大量的丛生芽，第二步可以培养出可用于生根的健壮的丛生芽苗以及部分仍可用于增殖培养二中继续培养的新增殖丛生芽。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是本发明诱导培养中采用诱导培养基一培养获得的无菌苗。
[0023]图2是本发明诱导培养中采用诱导培养基二培养获得的丛生芽。
[0024]图3、图4均为本发明增殖培养中在增殖培养基二中获得的健壮的丛生芽苗以及部分仍可用于增殖培养二中继续培养的新增殖丛生芽。
[0025]图5是本发明生根培养步骤中获得的形成根部突起的组培苗。
【具体实施方式】
[0026]本实施例粉防已的种子组培繁殖方法，包括种子储藏、种子消毒、启动培养、诱导培养、增殖培养、生根培养六大步骤，
[0027]种子储藏是指:采集当年秋后粉防已的成熟种子，将种子与含水率40% -50%的湿沙混合，混合体积比为1: 3，混合后放置于4°C的冰箱中储藏2周以上。
[0028]种子消毒是指:将储藏的种子取出，于流水中冲洗30min，在超净工作台内用体积分数75%酒精处理30s，无菌水冲洗3次，然后放入质量分数0.1%的HgCl2中处理5?1min,无菌水冲洗4?6次,然后置于无菌滤纸上吸干水分。
[0029]启动培养是指:将消毒好的种子接种到MS培养基上，在夜温18°C，日温22°C，相对湿度50%?60%暗箱条件下进行种子启动培养，15天后，种子开始萌动膨大；
[0030]诱导培养是指:将萌动膨大的种子接种于诱导培养基一中培养，其中，诱导培养基一为 MS+BA2.0—3.0mg/L+NAA0.1-0.2mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5g/L，pH 值为 5.8，培养条件为:光照强度1500LX，光照12h，温度22?26°C，培养4_6周，萌动膨大的种子萌发为无菌苗，如图1所示；将无菌苗分切成1_3_的块茎段置于诱导培养基二中培养，其中诱导培养基二为 MS+Ca (NO3) 2200mg/L+BAl.0—2.0mg/L+IAA0.2mg/L+VC10_20mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂5g/L, pH值为5.8，培养条件为:光照强度1500LX，光照12h，温度22?26°C，培养4周，SP可诱导出大量的丛生芽，如图2所示；
[0031]增殖培养是指:将生长至5mm以上的丛生芽切下接种于增殖培养基一中，增殖培养基一为 MS+Ca (NO3) 2200mg/L+BAl.0mg/L+IAA0.5mg/L+VC10_20mg/L+蔗糖 30g/L+ 琼脂5g/L, pH值为5.8，培养条件为:光照强度1500LX，光照12?16h，温度22?26°C，培养4周，可观察到大量新增殖的丛生芽；将Icm以上的丛生芽丛切割成2-5mm的芽丛块接种于增殖培养基二中，增殖培养基二为 MS+Ca (NO3) 2200mg/L+IBA2.5mg/L+IAA2.0mg/L+VC10-20mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8，培养条件为:光照强度2000?3000LX，光照12h，温度22?26°C，培养4-8周，获得部分长成2?4cm的健壮丛生芽苗以及部分仍可用于增殖培养二中继续培养的新增殖丛生芽，如图3、图4所示。
[0032]生根培养是指:取增殖培养基二中的长到2?4cm时的健壮丛生芽苗，将其切分成单芽，转入生根培养基上进行生根诱导培养，其中，部分新增殖的丛生芽切割成丛生芽块接种于增殖培养基二中继续增殖培养，所述生根培养基组分为I/2MS+Ca (NO3) 210mg/L+IBA2.0mg/L+VC10mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5g/L，pH 值为 5.8 ;在夜温 22°C，日温 26°C，光照强度30001x，每天光照时长12小时的条件下进行生根培养1-2周，将形成根部突起的组培苗，如图5所示，然后将根部突起的组培苗再进行瓶外生根培养和苗床培养，可获得大量的粉防已组培种苗。
【权利要求】
1.粉防已的种子组培繁殖方法，包括种子储藏、种子消毒、启动培养、诱导培养、增殖培养、生根培养六大步骤，其特征在于， 所述启动培养是指:将消毒好的种子接种到MS培养基上，在夜温18°C，日温22°C，相对湿度50%?60%暗箱条件下进行种子启动培养，15天后，种子开始萌动膨大； 所述诱导培养是指:将萌动膨大的种子接种于诱导培养基一中培养，其中，诱导培养基一为 MS+BA2.0—3.0mg/L+NAA0.1-0.2mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5g/L，pH 值为 5.8，培养条件为:光照强度1500LX，光照12h，温度22?26°C，培养4?6周，萌动膨大的种子萌发为无菌苗；将无菌苗分切成l_3mm的块茎段置于诱导培养基二中培养，其中诱导培养基二为MS+Ca (NO3) 2200mg/L+BAl.0—2.0mg/L+IAA0.2mg/L+VC10-20mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5g/L，pH值为5.8，培养条件为:光照强度1500LX，光照12h，温度22?26°C，培养4周，即可诱导出大量的丛生芽； 所述增殖培养是指:将生长至5mm以上的丛生芽切下接种于增殖培养基一中，增殖培养基一为 MS+Ca (NO3) 2200mg/L+BAl.0mg/L+IAA0.5mg/L+VC10_20mg/L+蔗糖 30g/L+ 琼脂5g/L，pH值为5.8，培养条件为:光照强度1500LX，光照12h，温度22?26°C，培养4周，可观察到大量新增殖的丛生芽；将Icm以上的丛生芽丛切割成2-5mm的芽丛块接种于增殖培养基二中，增殖培养基二为 MS+Ca(NO3)2200mg/L+IBA2.5mg/L+IAA2.0mg/L+VC10-20mg/L+ 蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8，培养条件为:光照强度2000?3000LX，光照12h，温度22?26°C，培养4-8周，获得部分长成2?4cm的健壮丛生芽苗以及部分新增殖的丛生芽。
2.根据权利要求1所述的粉防已的种子组培繁殖方法，其特征在于，所述种子储藏是指:采集当年秋后粉防已的成熟种子，将种子与含水率40% -50%的湿沙混合，混合体积比为1: 3，混合后放置于4°C的冰箱中储藏2周以上。
3.根据权利要求2所述的粉防已的种子组培繁殖方法，其特征在于，所述种子消毒是指:将储藏的种子取出，于流水中冲洗30min，在超净工作台内用体积分数75%酒精处理30s，无菌水冲洗3次，然后放入质量分数0.1 %的HgCl2中处理5?lOmin，无菌水冲洗4?6次，然后置于无菌滤纸上吸干水分。
4.根据根据权利要求1所述的粉防已的种子组培繁殖方法，其特征在于，所述生根培养是指:取增殖培养基二中的长到2?4cm时的健壮丛生芽苗，将其切分成单芽，转入生根培养基上进行生根诱导培养，其中，部分新增殖的丛生芽切割成丛生芽块仍可接种于增殖培养基二中继续增殖培养，所述生根培养基组分为1/2MS+Ca (NO3) 2100mg/L+IBA2.0mg/L+VC10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8 ;在夜温22 °C，日温26 °C，光照强度30001x，每天光照时长12小时的条件下进行生根培养1-2周，将形成根部突起的组培苗再进行瓶外生根培养和苗床培养，可获得大量的粉防已组培种苗。
【文档编号】A01H4/00GK104170732SQ201410401162
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年8月13日
【发明者】邝荔香, 刘静, 赵笑, 闫雨滢 申请人:安徽医科大学