抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基和土壤筛选方法
【专利摘要】本发明主要涉及抗草铵膦紫花苜蓿植株的筛选方法。具体涉及抗草铵膦种质筛选方法。一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法，其主要特点在于包括如下步骤：(1)MS培养基萌发种子；(2)剂量筛选；(3)甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子；(4)抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选；(5)抗性植株再次筛选。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：本发明简便易行，见效快捷，在短期内可以获得抗除草剂紫花苜蓿的单株。本发明采用的是诱变手段。利用化学诱变剂EMS诱变紫花苜蓿种子产生点突变，通过培养基和土壤筛选两种途径筛选抗除草剂紫花苜蓿单株，不但为常规育种提供了新的种质资源，对其他植物的抗除草剂选育也提供了一定的参考。
【专利说明】抗草铵滕紫花苜蓿植株的培养基和土壤筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明主要涉及抗草铵膦紫花苜蓿植株的筛选方法。具体涉及抗草铵膦种质筛选 方法。
【背景技术】
[0002] 紫花苜猜（Medicago sativa L.)具有优质、高产、饲用价值高（粗蛋白含量 21%)、适口性好、用途广泛等特点，被世界誉为"牧草之王"，有着很好的固氮、保肥、保持 水土的作用，具有食用价值，产业化发展前景良好。而苜蓿地杂草种类繁多，双子叶杂草和 单子叶杂草兼具，其中以双子叶杂草的危害最为严重。杂草与苜蓿争夺阳光、水分、养分和 空间，还会将病虫害传播给苜蓿，对苜蓿品质和产量造成了严重的不良影响，联合国粮农组 织近年来的统计数据表明，全世界每年由草害造成的作物减产率平均达9. 7%，减产值高达 204亿美元（张殿京和陈仁霖，1992)。人工除草成本又高，这为除草剂的研发开拓了市场， 草铵膦为灭生性除草剂，但灭生性除草剂在杀死杂草的同时也伤害了苜蓿，选育并发展抗 除草剂作物势在必行，这远比研制新型除草剂更加经济实惠，可节省20到100倍的成本，所 以获得抗草铵膦苜蓿品种显得尤为重要。
[0003] 对除草剂抗性的研究，早期是直接从自然界中筛选抗除草剂作物，接着是采用传 统杂交育种手段将具有抗性的基因转入目标作物中，随后是细胞培养、突变等方法，当前获 取抗除草剂作物的技术主要分为转基因、非转基因两大类。在外源基因的不可预知性渐渐 变为转基因作物发展的阻碍时，非转基因抗除草剂作物的发展愈来愈受重视，诱变育种为 其中一种手段。目前，通过非转基因手段培育的抗除草剂作物有玉米、大豆、菜豆和烟草等 20余种，抗除草剂种类包括ALS类（如咪唑啉酮类、磺酰脲类）、ACCase类（如环己烯二酮 类）、草甘膦类、草铵膦类和合成生长素类等。然而目前鲜有抗除草剂牧草的相关报道。因 此，筛选抗草铵膦除草剂的紫花苜蓿对于我国牧草产业发展具有十分重要意义。然而，在本 发明申请之前，国内还没有公开或发表过抗草铵膦紫花苜蓿植株的筛选方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是避免现有技术的不足，提出一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基 筛选方法。
[0005] 本发明的又一目的提出一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的土壤筛选方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养 基筛选方法，其主要特点在于包括如下步骤：
[0007] (1)MS培养基萌发种子
[0008] 精选紫花苜蓿种子；配制MS培养基培养板备用；无菌条件下进行种子消毒： 60-100%酒精浸洗种子2-0.511^11 ;2%次氯酸钠溶液浸洗5-151^11;(1(1!120清洗种子3-10 次；铺板，用镊子将消过毒的种子均匀铺于MS培养基上，封口膜封口后置于人工培养箱， 22-18°C，0_18h光照，24-6h黑暗发芽；胚根突破种皮视为萌发，第3-6天，平均发芽率达到 50%以上，待用；
[0009] (2)剂量筛选
[0010] 草铵膦设置多个处理，浓度分别为〇mg/L至15mg/L，配置以上不同浓度的草铵膦 培养基，每个浓度3个重复，设与浓度相匹配的多个培养板；
[0011] 无菌条件下，将MS培养基中发芽的健康种子转入不同浓度草铵膦培养基，封口膜 封口后置于22-18°C人工培养箱培养，于培养箱中培养18天，18天后统计致死率，筛选出用 于培养基筛选的草铵膦致死剂量为8mg/L ;
[0012] (3)甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子
[0013] 紫花苜蓿种子用98 %浓硫酸处理3-10min先打破硬实，蒸馏水冲洗3-10次；种子 在磷酸缓冲液（l〇〇mM，PH7. 0)，于4°C下预浸种6-18h，用磷酸缓冲液配置浓度为0. 2-2. 0 % (v/v)的甲基磺酸乙酯（EMS)溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长12-24h， 置于低温摇床，120rpm/min，18-22°C不断摇晃，再用自来水冲洗2-5h以去除残留的EMS，每 25-35min放置10-20min ;之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的 紫花苜蓿种子，分装于离心管中；配制MS基本培养基培养板备用；在MS培养基萌发诱变后 的种子，封口膜封口后置于人工培养箱，22-18°C，0_18h光照，24-6h黑暗发芽；
[0014] (4)抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选
[0015] 配置添加了致死剂量（8mg/L)草铵膦的MS培养基培养板备用；无菌条件下，将步 骤（3)中MS培养基萌发第3-6天的健康种子转入添加了致死剂量的草铵膦培养基中，封口 膜封口后置于18_22°C人工培养箱培养，于培养箱中培养10-20d，每天观察统计，10-20d后 筛选出抗性植株；
[0016] 配置1/2MS培养基，将筛选出的存活植株转入1/2MS培养基中继续培养，每2-3天 更换一次1/2MS培养基，待存活株长出复叶移栽到花盆继续生长；
[0017] (5)抗性植株再次筛选
[0018] 将1/2MS培养基中长出一片复叶的幼苗移栽至土壤继续培养，待幼苗长至2-3叶 期开始用80mg/L的草铵膦溶液进行喷施，每隔4-8d喷一次，喷施2次。
[0019] 一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的土壤筛选方法，其主要特点在于包括如下步骤：
[0020] (1) 土壤萌发种子
[0021] 将挑选出的健康饱满的紫花苜蓿种子播种于花盆，盆栽土壤为草炭土与蛭石1:1 比例混合，pH为8. 7,植物生长室培养，25-15°C，14-18h光照，10-6h黑暗；每盆均匀撒播种 子，覆土厚度约〇. 5-2cm，浇水200-500mL后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长2-5天，出苗后 揭掉保鲜膜；
[0022] (2)剂量筛选
[0023] 草铵膦设置多个处理，浓度分别为Omg/L至120mg/L，配置以上不同浓度的草铵膦 溶液装于喷壶；每个浓度多个重复；
[0024] 待幼苗长至第一复叶期，在生长至第14-16天时，开始喷施除草剂；每隔4-8天喷 施1次，连续12-24d，喷施3次；喷施除草剂时一来一回扫过叶面算作一次，保证除草剂均 匀撒施到叶面上，第3次喷施后的第7天统计致死率，筛选出用于土壤筛选的草铵膦致死剂 量为 80mg/L ;
[0025] (3)甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子
[0026] 紫花苜蓿种子用98 %浓硫酸处理3-10min先打破硬实，蒸馏水冲洗3-10次； 种子在磷酸缓冲液中，l〇〇mM，PH7. 0,于4°C下预浸种6-18h，用磷酸缓冲液配置浓度为 0. 2-2.0% (v/v)的甲基磺酸乙酯（EMS)溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时 长12-24h，置于低温摇床，120rpm/min，18-22°C不断摇晃，再用自来水冲洗2-5h以去除残 留的EMS，每25-35min放置10-20min ;之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变 后饱满完好的种子，分装于离心管中；将诱变后的紫花苜蓿种子均匀播种于土壤表面，覆土 厚度约0. 5-2cm，浇水200-500mL后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长2-5天，出苗后揭掉保鲜 膜；
[0027] (4)抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选
[0028] 待幼苗长至第一复叶期，剔除生长不一致的植株，用筛选出的草铵膦的致死剂量 开始喷施，每隔4-8天喷施1次，连续12-24d，喷施3次；喷施草铵膦时一来一回扫过叶面 算作一次，保证草铵膦均匀撒施到叶面上；3次喷施结束后的一周左右选取存活植株保活 待用；
[0029] (5)抗性植株再次筛选
[0030] 筛选出的可能具有草铵膦抗性的植株通过再次喷施草铵膦进行鉴定。盆中存活单 株继续在土壤中生长，待苜蓿长至2-3叶期开始用80mg/L的草铵膦溶液进行喷施，喷施草 铵膦时一来一回扫过叶面算作一次；每隔4-8天喷一次，喷施2次。
[0031] 本发明一是将EMS诱变后的紫花苜蓿种子在MS培养基上萌发，然后在附加最佳筛 选剂量的草铵膦培养基上进行筛选，对筛选存活的幼苗进行恢复培养，之后转入1/2MS培 养基上分化成苗，小苗生根长大后移栽，检测其抗草铵膦的效能；二是将EMS诱变后的种子 在土壤中萌发，然后用最佳筛选剂量的草铵膦对幼苗进行喷施，保留存活幼苗恢复培养。
[0032] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：本发明简便易行，见效快捷，在短 期内可以获得抗除草剂紫花苜蓿的单株。本发明采用的是诱变手段。利用化学诱变剂EMS 诱变紫花苜蓿种子产生点突变，通过培养基和土壤筛选两种途径筛选抗除草剂紫花苜蓿单 株，不但为常规育种提供了新的种质资源，对其他植物的抗除草剂选育也提供了一定的参 考。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1.不同浓度草铵膦下紫花苜蓿单株生长情况（10d);
[0034] 图中：从左至右为紫花苜蓿种子在0、l、2、3、5、8、10、12、15mg/L草铵膦培养基中 培养l〇d的单株生长状况；
[0035] 图2.不同浓度草铵膦下紫花苜蓿在MS培养基的生长情况（10d);
[0036] 图中：从左至右为紫花苜蓿种子在0、l、2、3、5、8、10、12、15mg/L草铵膦培养基中 培养l〇d的生长状况；
[0037] 图3.草铵膦培养基中不同天数紫花苜蓿的生长情况；
[0038] 图中：从左至右为紫花苜蓿幼苗在8mg/L草铵膦培养基中生长0、6、8、10、12、15、 18d的状况；
[0039] 图4.培养基中筛选出的抗性植株与非抗性植株对比；
[0040] 图中：左1为培养基中非抗性单株生长状况，2-6株为培养基中筛选出来的抗性植 株生长状况；
[0041] 图5.不同浓度草铵膦下紫花苜蓿在土壤中的生长情况（出苗20d);
[0042] 图中：左为对照，右两列为紫花苜蓿品种在喷施10、30、50、80、100、120mg/L草铵 膦后的生长状况；
[0043] 图6. 80mg/L草铵膦筛选后存活的抗性植株；
[0044] 图中：最佳筛选剂量80mg/L草铵膦喷施筛选后盆中植株生长状况；
[0045] 图7. 土壤中筛选出的抗性植株与非抗性植株对比；
[0046] 图中：左为盆中非抗性单株生长状况，右为盆中筛选出来的抗性植株生长状况；
[0047] 图8.筛选获得的抗性植株生长情况；
[0048] 图中：培养基和土壤两种筛选途径获得的抗性植株生长状况。
【具体实施方式】
[0049] 以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明， 并非用于限定本发明的范围。
[0050] 下述实施例与实验例中的MS培养基：硝酸钾（1900mg/L)，硝酸铵（1650mg/L)，七 水合硫酸镁（370mg/L)，二水合氯化興（440mg/L)，磷酸二氢钾（170mg/L)，四水合硫酸猛 (22. 3mg/L)，七水合硫酸锌（8. 6mg/L)，硼酸（6. 2mg/L)，碘化钾（0· 83mg/L)，二水合钥酸钠 (0.25mg/L)，五水合硫酸铜（0.025mg/L)，六水合氯化钴（0.025mg/L)，肌醇（100mg/L)，甘 氨酸（2. Omg/L)，盐酸卩比卩多醇（0. 5mg/L)，盐酸硫胺素（0. lmg/L)，烟酸（0. 5mg/L)，乙二胺四 乙酸二钠（37. 3mg/L)，七水合硫酸亚铁（27. 8mg/L)，琼脂（7g/L)，蔗糖（30g/L)。
[0051] 1/2MS培养基：硝酸钾（950mg/L)，硝酸铵（825mg/L)，磷酸二氢钾（85mg/L)，七水 合硫酸镁（185mg/L)，二水合氯化钙（220mg/L)，四水合硫酸锰（22. 3mg/L)，七水合硫酸锌 (8. 6mg/L)，硼酸（6. 2mg/L)，碘化钾（0. 83mg/L)，二水合钥酸钠（0. 25mg/L)，五水合硫酸铜 (0. 025mg/L)，六水合氯化钴（0. 025mg/L)，肌醇（100mg/L)，甘氨酸（2. Omg/L)，盐酸批卩多醇 (0· 5mg/L)，盐酸硫胺素（0· lmg/L)，烟酸（0· 5mg/L)，乙二胺四乙酸二钠（37. 3mg/L)，七水 合硫酸亚铁（27.8mg/L)，琼脂（7g/L)，蔗糖（30g/L)。
[0052] 实施例1 :一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法，其特征在于包括如下 步骤：
[0053] (1)MS培养基萌发种子
[0054] 精选紫花苜蓿种子；配制MS培养板备用；无菌条件下进行种子消毒：100%酒精浸 洗种子0. 5min ;2%次氯酸钠溶液浸洗15min ;ddH20清洗种子10次；铺板，用镊子将消过毒 的种子均勻铺于MS培养基上，封口膜封口后置于人工培养箱，22°C，18h光照，6h黑暗发芽； 胚根突破种皮视为萌发，第6天，平均发芽率达到50%以上，待用；
[0055] (2)剂量筛选
[0056] 草铵膦设置 9 个处理，浓度分别为 0mg/L、lmg/L、2mg/L、3mg/L、5mg/L、8mg/L、 10mg/L、12mg/L、15mg/L，配置以上不同浓度的草铵膦培养基，每个浓度3个重复，共27个培 养板；
[0057] 无菌条件下，将MS培养基中发芽的健康种子转入不同浓度草铵膦培养基，封口膜 封口后置于22°C人工培养箱培养，于培养箱中培养18天，18天后统计致死率，筛选出用于 培养基筛选的草铵膦致死剂量为8mg/L ;
[0058] (3)甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子
[0059] 紫花苜猜种子用浓硫酸（98% )处理lOmin先打破硬实，蒸馈水冲洗10次；种子 在磷酸缓冲液中（100mM，pH7.0)，于4°C下预浸种18h，用磷酸缓冲液配置浓度为2.0% (v/ v)的EMS (甲基磺酸乙酯）溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长24h，置于低 温摇床，120rpm/min，22°C不断摇晃，再用自来水冲洗5h以去除残留的EMS，每35min放置 20min ;之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心 管中；配制MS基本培养基培养板备用；在MS培养基萌发诱变后的种子，封口膜封口后置于 人工培养箱，22°C，18h光照，6h黑暗发芽；
[0060] (4)抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选
[0061] 配置添加了致死剂量8mg/L草铵膦的MS培养基培养板，备用；无菌条件下，将步骤 (3)中MS培养基中发芽第6天的健康种子转入添加了致死剂量的草铵膦培养基中，封口膜 封口后置于22°C人工培养箱培养，于培养箱中培养20d，每天观察统计，20d后筛选出抗性 植株；
[0062] 配置1/2MS培养基，将筛选出的存活植株转入1/2MS培养基中继续培养，每3天更 换一次1/2MS培养基，待存活株长出复叶移栽到花盆继续生长；
[0063] (5)抗性植株再次筛选
[0064] 将1/2MS培养基中长出一片复叶的幼苗移栽至土壤继续培养，待幼苗长至2-3叶 期开始用80mg/L的草铵膦溶液进行喷施，每隔8d喷一次，喷施2次。
[0065] 实施例2 :-种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法，其特征在于包括如下 步骤：
[0066] (1)MS培养基萌发种子
[0067] 精选紫花苜蓿种子；配制MS培养基培养板备用；无菌条件下进行种子消毒：75% 酒精浸洗种子lmin ;2%次氯酸钠溶液浸洗lOmin ;ddH20清洗种子5次；铺板，用镊子将消 过毒的种子均勻铺于MS培养基上，封口膜封口后置于人工培养箱，20°C，16h光照，8h黑暗 发芽；胚根突破种皮视为萌发，第5天，平均发芽率达到50%以上，待用；
[0068] (2)剂量筛选
[0069] 草铵膦设置 9 个处理，浓度分别为 0mg/L、lmg/L、2mg/L、3mg/L、5mg/L、8mg/L、 10mg/L、12mg/L、15mg/L，配置以上不同浓度的草铵膦培养基，每个浓度3个重复，共27个培 养板；
[0070] 无菌条件下，将MS培养基中发芽的健康种子转入不同浓度草铵膦培养基，封口膜 封口后置于20°C人工培养箱培养，于培养箱中培养18天，18天后统计致死率，筛选出用于 培养基筛选的草铵膦致死剂量为8mg/L ;
[0071] (3)甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子
[0072] 紫花苜蓿种子用浓硫酸（98% )处理5min先打破硬实，蒸馏水冲洗5次；种子在 磷酸缓冲液中（100mM，pH7.0)，于4°C下预浸种12h，用磷酸缓冲液配置浓度为0.8% (v/v) 的EMS (甲基磺酸乙酯）溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长18h，置于低温 摇床，120rpm/min，2(TC不断摇晃，再用自来水冲洗4h以去除残留的EMS，每30min放置片 亥IJ ;之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心管 中；配制MS基本培养基培养板备用；在MS培养基萌发诱变后的种子，封口膜封口后置于人 工培养箱，20°C，16h光照，8h黑暗发芽；
[0073] (4)抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选
[0074] 配置添加了致死剂量8mg/L草铵膦的MS基本培养基培养板，备用；无菌条件下，将 步骤（3)中MS培养基萌发第5天的健康种子转入添加了致死剂量的草铵膦培养基中，封口 膜封口后置于20°C人工培养箱培养，于培养箱中培养18d，每天观察统计，18d后筛选出抗 性植株；
[0075] 配置1/2MS培养基，将筛选出的存活植株转入1/2MS培养基中继续培养，每2天更 换一次1/2MS培养基，待存活株长出复叶移栽到花盆继续生长；
[0076] (5)抗性植株再次筛选
[0077] 将1/2MS培养基中长出一片复叶的幼苗移栽至土壤继续培养，待幼苗长至2-3叶 期开始用80mg/L的草铵膦溶液进行喷施，每隔6d喷一次，喷施2次。
[0078] 实施例3 :-种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法，其特征在于包括如下 步骤：
[0079] (1)MS培养基萌发种子
[0080] 精选紫花苜蓿种子；配制MS培养基培养板备用；无菌条件下进行种子消毒：60% 酒精浸洗种子2min ;2%次氯酸钠溶液浸洗5min ;ddH20清洗种子3次；铺板，用镊子将消过 毒的种子均勻铺于MS培养基上，封口膜封口后置于人工培养箱，18°C，0h光照，24h黑暗发 芽；胚根突破种皮视为萌发，第3天，平均发芽率达到50%以上，待用；
[0081] (2)剂量筛选
[0082] 草铵膦设置 9 个处理，浓度分别为 0mg/L、lmg/L、2mg/L、3mg/L、5mg/L、8mg/L、 10mg/L、12mg/L、15mg/L，配置以上不同浓度的草铵膦培养基，每个浓度3个重复，共27个培 养板；
[0083] 无菌条件下，将MS培养基中发芽的健康种子转入不同浓度草铵膦培养基，封口膜 封口后置于18°C人工培养箱培养，于培养箱中培养18天，18天后统计致死率，筛选出用于 培养基筛选的草铵膦致死剂量为8mg/L ;
[0084] (3)甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子
[0085] 紫花苜蓿种子用浓硫酸（98% )处理3min先打破硬实，蒸馏水冲洗3次；种子在 磷酸缓冲液中（l〇〇mM，PH7.0)，于4°C下预浸种6h，用磷酸缓冲液配置浓度为0. 2% (v/v) 的EMS (甲基磺酸乙酯）溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长12h，置于低 温摇床，120rpm/min，18°C不断摇晃，再用自来水冲洗2h以去除残留的EMS，每25min放置 lOmin ;之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心 管中；配制MS基本培养基培养板备用；在MS培养基萌发诱变后的种子，封口膜封口后置于 人工培养箱，18°C，0h光照，24h黑暗发芽；
[0086] (4)抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选
[0087] 配置添加了致死剂量8mg/L草铵膦的MS培养基培养板，备用；无菌条件下，将步骤 (3)中MS培养基中发芽第3天的健康种子转入添加了致死剂量的草铵膦培养基中，封口膜 封口后置于18°C人工培养箱培养，于培养箱中培养18d，每天观察统计，10d后筛选出抗性 植株；
[0088] 配置1/2MS培养基，将筛选出的存活植株转入1/2MS培养基中继续培养，每2天更 换一次1/2MS培养基，待存活株长出复叶移栽到花盆继续生长；
[0089] (5)抗性植株再次筛选
[0090] 将1/2MS培养基中长出一片复叶的幼苗移栽至土壤继续培养，待幼苗长至2-3叶 期开始用80mg/L的草铵膦溶液进行喷施，每隔4d喷一次，喷施2-次。
[0091] 实施例4 :一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的土壤筛选方法，其特征在于包括如下步 骤：
[0092] (1) 土壤萌发种子
[0093] 将挑选出的健康饱满的紫花苜蓿种子播种于花盆，盆栽土壤为草炭土与蛭石1:1 比例混合，pH为8. 7,植物生长室适宜条件培养，25°C，18h光照，6h黑暗。每盆均匀撒播种 子，覆土厚度约2cm，浇水500mL后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长5天，出苗后揭掉保鲜 膜；
[0094] (2)剂量筛选
[0095] 草铵膦设置 7 个处理，浓度分别为 Omg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L、80mg/L、100mg/ L、120mg/L，配置以上不同浓度的草铵膦溶液装于喷壶；每个浓度3个重复；
[0096] 待幼苗长至第一复叶期，在生长至第16天时，开始喷施除草剂；每隔8天喷施1 次，连续24d，喷施3次；喷施除草剂时一来一回扫过叶面算作一次，保证除草剂均匀撒施 到叶面上，第3次喷施后的第7天统计致死率，筛选出用于土壤筛选的草铵膦致死剂量为 80mg/L ；
[0097] (3)甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子
[0098] 紫花苜蓿种子用浓硫酸（98% )处理lOmin先打破硬实，蒸馏水冲洗10次；种子 在磷酸缓冲液中（100mM，pH7.0)，于4°C下预浸种18h，用磷酸缓冲液配置浓度为2.0% (v/ v)的EMS (甲基磺酸乙酯）溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长24h，置于低 温摇床，120rpm/min，22°C不断摇晃，再用自来水冲洗5h以去除残留的EMS，每35min放置 20min ;之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心 管中；将诱变后的紫花苜蓿种子均匀播种于土壤表面，覆土厚度约2cm，浇水500mL后用保 鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长5天，出苗后揭掉保鲜膜；
[0099] (4)抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选
[0100] 待幼苗长至第一复叶期，剔除生长不一致的植株，用筛选出的草铵膦的致死剂量 开始喷施，每隔8天喷施1次，连续24d，喷施3次；喷施草铵膦时一来一回扫过叶面算作一 次，保证草铵膦均匀撒施到叶面上；3次喷施结束后的一周左右选取存活植株保活待用；
[0101] (5)抗性植株再次筛选
[0102] 筛选出的可能具有草铵膦抗性的植株通过再次喷施草铵膦进行鉴定。盆中存活单 株继续在土壤中生长，待苜蓿长至2-3叶期开始用80mg/L的草铵膦溶液进行喷施，喷施草 铵膦时一来一回扫过叶面算作一次；每隔8天喷一次，喷施2次。
[0103] 实施例5 :-种抗草铵膦紫花苜蓿植株的土壤筛选方法，其特征在于包括如下步 骤：
[0104] (1) 土壤萌发种子
[0105] 将挑选出的健康饱满的紫花苜蓿种子播种于花盆，盆栽土壤为草炭土与蛭石1:1 比例混合，pH为8. 7,植物生长室适宜条件培养（20°C，16h光照，8h黑暗）。每盆均匀撒播 种子，覆土厚度约lcm，浇适量水（200-500mL)后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长3天，出苗 后揭掉保鲜月吴；
[0106] (2)剂量筛选
[0107] 草铵膦设置 7 个处理，浓度分别为 Omg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L、80mg/L、100mg/ L、120mg/L，配置以上不同浓度的草铵膦溶液装于喷壶；每个浓度3个重复；
[0108] 待幼苗长至第一复叶期，在生长至第15天时，开始喷施除草剂；每隔6天喷施1 次，连续18d，喷施3次；喷施除草剂时一来一回扫过叶面算作一次，保证除草剂均匀撒施 到叶面上，第3次喷施后的第7天统计致死率，筛选出用于土壤筛选的草铵膦致死剂量为 80mg/L ；
[0109] (3)甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子
[0110] 紫花苜蓿种子用浓硫酸（98% )处理5min先打破硬实，蒸馏水冲洗5次；种子在磷 酸缓冲液中（100mM，pH7.0)，于4°C下预浸种12h，用磷酸缓冲液配置浓度为0.8% (v/v)的 EMS (甲基磺酸乙酯）溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长18h，置于低温摇 床，120rpm/min，20°C不断摇晃，再用自来水冲洗4h以去除残留的EMS，每30min放置片刻； 之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心管中； 将诱变后的紫花苜蓿种子均匀播种于土壤表面，覆土厚度约lcm，浇适量水（200-500mL)后 用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长3天，出苗后揭掉保鲜膜；
[0111] (4)抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选
[0112] 待幼苗长至第一复叶期，剔除生长不一致的植株，用筛选出的草铵膦致死剂量开 始喷施，每隔6天喷施1次，连续18d，喷施3次；喷施草铵膦时一来一回扫过叶面算作一次， 保证草铵膦均匀撒施到叶面上；3次喷施结束后的一周左右选取存活植株保活待用；
[0113] (5)抗性植株再次筛选
[0114] 筛选出的可能具有草铵膦抗性的植株通过再次喷施草铵膦进行鉴定。盆中存活单 株继续在土壤中生长，待苜蓿长至2-3叶期开始用80mg/L的草铵膦溶液进行喷施，喷施草 铵膦时一来一回扫过叶面算作一次；每隔6天喷一次，喷施2次。
[0115] 实施例6 :-种抗草铵膦紫花苜蓿植株的土壤筛选方法，其特征在于包括如下步 骤：
[0116] (1) 土壤萌发种子
[0117] 将挑选出的健康饱满的紫花苜蓿种子播种于花盆，盆栽土壤为草炭土与蛭石1:1 比例混合，pH为8. 7,植物生长室适宜条件培养（15°C，14h光照，10h黑暗）。每盆均匀撒播 种子，覆土厚度约〇. 5cm，浇水200mL后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长2天，出苗后揭掉保 鲜膜；
[0118] (2)剂量筛选
[0119] 草铵膦设置 7 个处理，浓度分别为 Omg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L、80mg/L、100mg/ L、120mg/L，配置以上不同浓度的草铵膦溶液装于喷壶；每个浓度3个重复；
[0120] 待幼苗长至第一复叶期，在生长至第14天时，开始喷施除草剂；每隔4天喷施1 次，连续12d，喷施3次；喷施除草剂时一来一回扫过叶面算作一次，保证除草剂均匀撒施 到叶面上，第3次喷施后的第7天统计致死率，筛选出用于土壤筛选的草铵膦致死剂量为 80mg/L ；
[0121] (3)甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子
[0122] 紫花苜蓿种子用浓硫酸（98% )处理3min先打破硬实，蒸馏水冲洗3次；种子在 磷酸缓冲液中（l〇〇mM，PH7.0)，于4°C下预浸种6h，用磷酸缓冲液配置浓度为0. 2% (v/v) 的EMS (甲基磺酸乙酯）溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长12h，置于低 温摇床，120rpm/min，18°C不断摇晃，再用自来水冲洗2h以去除残留的EMS，每25min放置 lOmin ;之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑选诱变后饱满完好的种子，分装于离心 管中；将诱变后的紫花苜蓿种子均匀播种于土壤表面，覆土厚度约〇. 5cm，浇水200mL后用 保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长2天，出苗后揭掉保鲜膜；
[0123] (4)抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选
[0124] 待幼苗长至第一复叶期，剔除生长不一致的植株，用筛选出的草铵膦的致死剂量 开始喷施，每隔4天喷施1次，连续12d，喷施3次；喷施草铵膦时一来一回扫过叶面算作一 次，保证草铵膦均匀撒施到叶面上；3次喷施结束后的一周左右选取存活植株保活待用；
[0125] (5)抗性植株再次筛选
[0126] 筛选出的可能具有草铵膦抗性的植株通过再次喷施草铵膦进行鉴定。盆中存活单 株继续在土壤中生长，待苜蓿长至2-3叶期开始用80mg/L的草铵膦溶液进行喷施，喷施草 铵膦时一来一回扫过叶面算作一次；每隔4天喷一次，喷施2次。
[0127] 实验例1 : 一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法
[0128] 1、MS培养基萌发种子
[0129] 精选6000粒紫花苜蓿种子。配制60个MS培养板备用。无菌条件下进行种子消 毒：（1) 75 %酒精浸洗种子lmin ; (2) 2 %次氯酸钠溶液浸洗lOmin ; (3) ddH20清洗种子5次。 铺板，用镊子将消过毒的种子均匀铺于MS培养基上，每皿100粒种子，共60皿，封口膜封口 后置于人工培养箱（20°C，16h光照，8h黑暗）发芽。胚根突破种皮视为萌发，第5d，平均发 芽率达到50 %以上，待用。
[0130] 2、剂量筛选
[0131] 草铵膦设置 9 个处理，浓度分别为 0mg/L、lmg/L、2mg/L、3mg/L、5mg/L、8mg/L、 10mg/L、12mg/L、15mg/L，配置以上不同浓度的草铵膦培养基，每个浓度3个重复，共27个培 养板。
[0132] 无菌条件下，将MS培养基中发芽的健康种子转入不同浓度草铵膦培养基，每皿放 置50粒，封口膜封口后置于20°C人工培养箱培养，共计27皿。于培养箱中培养18d，18d后 统计致死率，筛选出用于培养基筛选的草铵膦致死剂量为8mg/L。
[0133] 见图1和图2,从左至右为紫花苜蓿在不同浓度草铵膦培养基中培养10天的生长 情况，随着草铵膦浓度的增加，幼苗死亡率逐渐增高，浓度达到8mg/L时，死亡率突增接近 100%，10mg/L以上浓度完全致死，致死作用明显，说明高浓度的草铵膦对植株造成了很大 伤害。其中8mg/L是临界值，从8mg/L开始植株生长严重受到抑制，叶片完全枯黄萎蔫。
[0134] 3、甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子
[0135] 紫花苜蓿种子用浓硫酸（98% )处理5min先打破硬实，蒸馏水冲洗5次。种子于 4°C磷酸缓冲液中（100mM，pH7. 0)预浸种12h。用磷酸缓冲液配置浓度为0.8% (v/v)的 EMS (甲基磺酸乙酯）溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长18h，置于低温摇 床（120rpm/min，2(TC )不断摇晃，再用自来水冲洗4h以去除残留的EMS，每30min放置片 亥IJ。之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用。挑选诱变后饱满完好的紫花苜蓿种子10000 粒，分装于100个1. 5mL离心管中，每管100粒种子。配置MS培养基，高压灭菌后于无菌条 件下分装于100个培养皿中备用。同样在MS培养基萌发诱变后的种子，每皿铺100粒，封 口膜封口后置于人工培养箱（20°C，16h光照，8h黑暗）发芽。
[0136] 4、抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选
[0137] 配置添加了致死剂量8mg/L草铵膦的MS培养板100个，备用。无菌条件下，将步 骤3中MS培养基中发芽第5d的健康种子转入添加了致死剂量的草铵膦培养基中，每皿50 株，封口膜封口后置于20°C人工培养箱培养，共计100皿。于培养箱中培养18d，每天观察 统计，18d后筛选出抗性植株。
[0138] 配置1/2MS培养基，将筛选出的存活植株转入1/2MS培养基中继续培养，每2d更 换一次1/2MS培养基，待存活株长出复叶移栽到花盆继续生长。
[0139] 见图3,从左至右为诱变后的紫花苜蓿种子在8mg/L草铵膦培养基中生长不同天 数的状况，致死数随着培养时间的增加而增加，但部分诱变株在筛选18d后表现出了一定 的耐药性，并无完全致死。
[0140] 见图4,左1为培养基中非抗性紫花苜蓿生长状况，右2-6株为培养基中筛选出来 的抗性植株生长状况，培养基中培养18天后的非抗性和抗性植株相比，长势明显较好，根 系相对发达，生长速度较快；抗性植株多为两片子叶，少有真叶伸出，生长受到抑制。
[0141] 5、抗性植株再次筛选
[0142] 将1/2MS培养基中长出一片复叶的紫花苜蓿移栽至土壤继续培养，待苜蓿长至 2-3叶期开始用80mg/L的草铵膦溶液进行喷施，每隔6d喷一次，喷施两次。
[0143] 见图8,培养基和土壤两种筛选途径获得的抗性植株生长状况，抗性植株移栽至土 壤再次筛选后，仍具有抗性。
[0144] 实验例2 : -种抗草铵膦紫花苜蓿植株的土壤筛选方法
[0145] 1、土壤萌发
[0146] 将挑选出的健康饱满的紫花苜蓿种子播种于花盆，花盆规格250 X 160,盆栽土壤 为草炭土与蛭石1:1比例混合，pH为8. 7,植物生长室适宜条件培养。每盆均匀撒播100粒 种子，覆土厚度约lcm，浇适量水后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长3d左右，出苗后揭掉保 鲜膜。总计42盆。
[0147] 2、剂量筛选
[0148] 草铵膦设置 7 个处理，浓度分别为 Omg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L、80mg/L、100mg/ L、120mg/L，配置以上不同浓度的草铵膦溶液装于喷壶。每个浓度3个重复，共21盆。
[0149] 待幼苗长至第一复叶期，约在生长至第15d时，开始喷施除草剂。每隔6d喷施1 次，连续18d，喷施3次。喷施除草剂时一来一回扫过叶面算作一次，保证除草剂均匀撒施 到叶面上。第3次喷施后的第7d统计致死率，筛选出用于土壤筛选的草铵膦致死剂量为 80mg/L。
[0150] 见图5,左为对照，右两列为紫花苜蓿在喷施不同浓度草铵膦后的生长状况，随着 草铵膦喷施浓度的加大，对紫花苜蓿幼苗的伤害愈大，植株渐渐枯黄萎蔫，到80mg/L时，植 株已基本致死。选此浓度为草铵膦土壤筛选的最佳剂量。
[0151] 3、甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子
[0152] 紫花苜蓿种子用浓硫酸（98% )处理5min先打破硬实，蒸馏水冲洗5次。种子于 4°C磷酸缓冲液中（100mM，pH7. 0)预浸种12h。用磷酸缓冲液配置浓度为0.8% (v/v)的 EMS (甲基磺酸乙酯）溶液，在室温黑暗条件下用EMS处理种子，处理时长18h，置于低温摇 床（120rpm/min，20°C )不断摇晃，再用自来水冲洗4h以去除残留的EMS，每30min放置片 亥IJ。之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用。挑选诱变后饱满完好的紫花苜蓿种子10000 粒，播种于土壤表面，共100盆，每盆均匀撒播100粒种子。覆土厚度约lcm，浇适量水后用 保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长3d左右，出苗后揭掉保鲜膜。
[0153] 4、抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选
[0154] 待幼苗长至第一复叶期，剔除生长不一致的植株，用筛选出的草铵膦的致死剂量 开始喷施，每隔6d喷施1次，连续18d，喷施3次。喷施草铵膦时一来一回扫过叶面算作一 次，保证草铵膦均匀撒施到叶面上。3次喷施结束后的一周左右选取存活植株保活待用。
[0155] 见图6,为土壤中80mg/L草铵膦喷施筛选后盆中植株生长状况，从图中可以看出， 3次筛选后，盆中植株仅有极少数存活，可初步确定为抗性植株。
[0156] 见图7,左为盆中非抗性单株生长状况，右为盆中筛选出来的抗性植株生长状况， 最终存活下来的抗性单株与非抗性的对比，同培养基筛选途径结果一致，抗性单株长势明 显比对照弱，对照植株已5叶期，而抗性植株才至1叶期，叶色黄绿，根长明显比对照短，有 明显的生长滞后性。
[0157] 5、抗性植株再次筛选
[0158] 筛选出的可能具有抗草铵膦性的植株通过再次喷施草铵膦进行鉴定，盆中存活单 株继续在土壤中生长，待苜蓿长至2-3叶期开始用80mg/L的草铵膦溶液进行喷施，每隔6d 喷一次，喷施两次。
[0159] 见图8,培养基和土壤两种筛选途径获得的抗性植株生长状况，随着时间的增长， 抗性植株逐渐长大。
[0160] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种抗草铵膦紫花苜蓿植株的培养基筛选方法，其特征在于包括如下步骤： (1) MS培养基萌发种子 精选紫花苜蓿种子；配制MS培养基培养板备用；无菌条件下进行种子消毒：60-100% 酒精浸洗种子2-0. 5min ;2%次氯酸钠溶液浸洗5-15min ;ddH20清洗种子3-10次；铺板， 用镊子将消过毒的种子均匀铺于MS培养基上，封口膜封口后置于人工培养箱，22-18°C， 〇_18h光照，24-6h黑暗发芽；胚根突破种皮视为萌发，第3-6天，平均发芽率达到50 %以 上，待用； (2) 剂量筛选 草铵膦设置多个处理，浓度分别为〇mg/L至15mg/L，配置以上不同浓度的草铵膦培养 基，每个浓度多个重复，设与浓度相匹配的多个培养板； 无菌条件下，将MS培养基中发芽的健康种子转入不同浓度草铵膦培养基，封口膜封口 后置于18-22°C人工培养箱培养，于培养箱中培养18天，18天后统计致死率，筛选出用于培 养基筛选的草铵膦致死剂量为8mg/L ; (3) 甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子 紫花苜蓿种子用98 %浓硫酸处理3-10min先打破硬实，蒸馏水冲洗3-10次；种子在 100mM，pH7. 0的磷酸缓冲液中，于4°C下预浸种6-18h，用磷酸缓冲液配置浓度为0. 2-2. 0 % (v/v)的甲基磺酸乙酯溶液，在室温黑暗条件下用甲基磺酸乙酯处理种子，处理时长 12-24h，置于低温摇床，120rpm/min，18-22°C不断摇晃，再用自来水冲洗2-5h以去除残留 的甲基磺酸乙酯，每25-35min放置10-20min ;之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑 选诱变后饱满完好的种子，分装于离心管中；配制MS基本培养基培养板备用；在MS培养基 萌发诱变后的种子，封口膜封口后置于人工培养箱，22-18°C，0_18h光照，24-6h黑暗发芽； (4) 抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选 配置添加了致死剂量8mg/L草铵膦的MS培养基培养板备用；无菌条件下，将步骤（3) 中MS培养基萌发第3-6天的健康种子转入添加了致死剂量的草铵膦培养基中，封口膜封口 后置于22-18°C人工培养箱培养，于培养箱中培养10-20d，每天观察统计，10-20d后筛选出 抗性植株； 配置1/2MS培养基，将筛选出的存活植株转入1/2MS培养基中继续培养，每2-3天更换 一次1/2MS培养基，待存活株长出复叶移栽到花盆继续生长； (5) 抗性植株再次筛选 将1/2MS培养基中长出一片复叶的幼苗移栽至土壤继续培养，待幼苗长至2-3叶期开 始用80mg/L的草铵膦溶液进行喷施，每隔4-8d喷一次，喷施2次。
2. -种抗草铵膦紫花苜蓿植株的土壤筛选方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 土壤萌发种子 将挑选出的健康饱满的紫花苜蓿种子播种于花盆，盆栽土壤为草炭土与蛭石1:1比例 混合，pH为8. 7,植物生长室培养，25-15°C，14-18h光照，10-6h黑暗；每盆均匀撒播种子，覆 土厚度约〇. 5-2cm，浇水200-500mL后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长2-5天，出苗后揭掉保 鲜膜； (2) 剂量筛选 草铵膦设置多个处理，浓度分别为〇mg/L至120mg/L，配置以上不同浓度的草铵膦溶液 装于喷壶；每个浓度多个重复； 待幼苗长至第一复叶期，在生长至第14-16天时，开始喷施除草剂；每隔4-8天喷施1 次，连续12-24d，喷施3次；喷施除草剂时一来一回扫过叶面算作一次，保证除草剂均匀撒 施到叶面上，第3次喷施后的第7天统计致死率，筛选出用于土壤筛选的草铵膦致死剂量为 80mg/L ； (3) 甲基磺酸乙酯半致死剂量诱变紫花苜蓿种子 紫花苜蓿种子用98 %浓硫酸处理3-10min先打破硬实，蒸馏水冲洗3-10次；种子在 100mM，pH7. 0的磷酸缓冲液中，于4°C下预浸种6-18h，用磷酸缓冲液配置浓度为0. 2-2. 0 % (v/v)的甲基磺酸乙酯溶液，在室温黑暗条件下用甲基磺酸乙酯处理种子，处理时长 12-24h，置于低温摇床，120rpm/min，18-22°C不断摇晃，再用自来水冲洗2-5h以去除残留 的甲基磺酸乙酯，每25-35min放置10-20min ;之后铺于干净的滤纸上将种子晾干待用；挑 选诱变后饱满完好的种子，分装于离心管中；将诱变后的紫花苜蓿种子均匀播种于土壤表 面，覆土厚度约〇. 5-2cm，浇水200-500mL后用保鲜膜覆盖，保鲜膜覆盖生长2-5天，出苗后 揭掉保鲜膜； (4) 抗草铵膦紫花苜蓿植株筛选 待幼苗长至第一复叶期，剔除生长不一致的植株，用筛选出的草铵膦致死剂量开始喷 施，每隔4-8天喷施1次，连续12-24d，喷施3次；喷施草铵膦时一来一回扫过叶面算作一 次，保证草铵膦均匀撒施到叶面上；3次喷施结束后的一周左右选取存活植株保活待用； (5) 抗性植株再次筛选 筛选出的可能具有草铵膦抗性的植株通过再次喷施草铵膦进行鉴定；盆中存活单株继 续在土壤中生长，待幼苗长至2-3叶期开始用80mg/L的草铵膦溶液进行喷施，喷施草铵膦 时一来一回扫过叶面算作一次；每隔4-8天喷一次，喷施2次。
【文档编号】A01H1/06GK104186308SQ201410429290
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】张吉宇, 霍雅馨, 段珍, 狄红艳, 骆凯, 吴凡 申请人:兰州大学