一种可活体成像监测肝脏中NF-κB活性的小鼠模型及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种可活体成像监测肝脏中NF-κB活性的小鼠模型及其构建方法。本发明通过构建携带噬菌体整合酶识别位点attB基因、NFκB基因以及萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因的重组载体，用水动力法将其导入小鼠体内，得到受NFκB基因调控表达的萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因整合于小鼠肝脏的小鼠模型。用本发明的小鼠模型可以评价不同因素在体内对NF-κB活性的调节作用，也可作为天然免疫中干扰素或炎性因子调节药物、分子和病毒的评价模型，可广泛应用于各个门类的生物医学动物实验当中。
【专利说明】-种可活体成像监测肝脏中NF-κ B活性的小鼠模型及其 构建方法
[0001] 本发明为申请日2011年12月26日，申请号201110441969. 9,发明名称"一种可 活体成像监测肝脏中IFN- β或NF- κ B活性的小鼠模型及其构建方法"的分案申请。
【技术领域】
[0002] 本发明属于生物学领域中的动物模型及其构建方法，特别是涉及一种可活体成像 监测有NF- κ Β活性的小鼠模型及其构建方法。
【背景技术】
[0003] I型干扰素（Interferon，IFN)在天然免疫反应中有着重要作用，其主要成员是 IFN-α和IFN-β，肝脏是蛋白合成和许多天然免疫成分活化的一个重要场所，许多免疫相 关分子能够被肝细胞来源的信号活化，肝脏的天然免疫系统在肝炎病毒感染及其免疫致病 中发挥何种效应，已经成为学者们研究的热点。IFN在细胞水平的研究无法反映出其在复杂 完整免疫体系中的真实情况，目前尚无合适的动物模型，用来探讨IFN在活体动物肝脏中 的活性。
[0004] 核因子-κ B是1986年由Sen和Baltimore在小鼠 B淋巴细胞中发现的一种能 与免疫球蛋白κ轻链基因增强子B位点特异结合的核蛋白因子，并将其命名为Nuclear Factor-κ B (NF-κ B)。核因子-κ B是一个具有广泛生物活性的转录因子，调控多种信号传 导途径。作为细胞内信号传递的一个枢纽，核因子-κ B在免疫、炎症、肿瘤等众多疾病的发 生发展过程中都起到重要作用，其表达的异常通常会导致机体的多种病理、生理学改变。然 而，现今大多数关于NF-κ B的研究都是基于细胞水平进行的，真正动物整体水平的调控机 制研究相对较少、较为困难，其主要原因就是缺乏实时、动态、易于建模、方便使用的动物模 型。
[0005] 活体成像技术和生物发光技术由于其实用性，是近年来在生物医学研究领域应用 较为广泛的报告基因监测手段。活体成像系统可以使研究人员直接实时的观察活体动物体 内的细胞生长和基因表达情况，大大提高了生物学实验的可视性和可操作性，但成本相对 较高，结合生物发光技术则可以有效控制由活体成像系统产生的高额成本。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种可活体成像监测肝脏中NF- κ B活性的小鼠模型。
[0007] 本发明所提供的可活体成像监测肝脏中NF-κ B活性的小鼠模型，是肝脏转染有 报告基因及NF- κ B基因的小鼠模型，所述NF- κ B基因调控报告基因的表达，所述报告基因 用于指不NF- κ B的表达水平。
[0008] 在上述小鼠模型中，所述报告基因可为各种荧光素酶或碱性磷酸酶报告基因，优 选为萤火虫荧光素酶（Flue)基因。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种上述活体成像监测肝脏中NF-κ B活性的小鼠模 型的构建方法。
[0010] 本发明所提供的上述活体成像监测肝脏中NF-κ B活性的小鼠模型的构建方法， 可包括以下步骤：
[0011] 1)载体构建：构建携带噬菌体整合酶识别位点attB基因、NFk B基因以及萤火虫 荧光素酶（Flue)报告基因的重组载体，所述噬菌体整合酶识别位点attB基因与NF κ B基 因位于Flue报告基因的上游；
[0012] 2)将步骤1)构建的重组载体及噬菌体整合酶质粒用尾静脉高压注射的方法（水 动力法）导入小鼠体内，得到受NFkB基因调控表达的萤火虫荧光素酶（Flue)报告基因整 合于小鼠肝脏的小鼠模型。
[0013] 在上述小鼠模型的构建方法中，所述步骤1)中用于构建携带噬菌体整合酶识别 位点attB基因、NFkB基因以及Flue报告基因的重组载体的出发载体为pNFK B-Luc，以 pNF κ B-Luc为出发载体构建的携带噬菌体整合酶识别位点attB基因、NF- κ B基因以及萤 火虫荧光素酶（Flue)报告基因的重组载体pattB-NFKB-Fluc。
[0014] 所述步骤2)中的噬菌体整合酶质粒为PhiC31o,所述将步骤1)构建的重组载体及 噬菌体整合酶质粒用尾静脉高压注射的方法（水动力法）导入小鼠体内的方法具体为：取 4-6周龄的雄性小鼠，称重，将重组质粒10 μ g和噬菌体整合酶表达质粒PhiC31〇20 μ g混合 于相当于小鼠体重10%的生理盐水，在3秒钟以内通过尾静脉快速转染至小鼠肝脏。
[0015] 本发明提供了一种可活体成像监测有NF-K B活性的小鼠模型及其构建方法。本 发明的小鼠模型是通过构建含有噬菌体整合酶识别位点attB基因、由NF κ B基因调控萤火 虫荧光素酶（Flue)报告基因表达的重组载体，再通过水动力注射法将该重组载体转染至 小鼠肝脏，并可通过活体成像技术检测NF-κ B活性。本发明的小鼠模型可用于评价NF-κ B 抑制剂TOTC抑制NF- κ B激活的药效作用。用本发明的小鼠模型可以评价不同因素在体内 对NF-κΒ活性的调节作用，也可作为天然免疫中干扰素或炎性因子调节药物、分子和病毒 的评价模型，可广泛应用于各个门类的生物医学动物实验当中。
[0016] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为载体pGL3_Basic的物理图谱
[0018] 图2A为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型肝脏中萤火虫荧光素酶 (Flue)活性的活体成像检测结果
[0019] 图2B为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型肝脏中萤火虫荧光素酶 (Flue)表达水平的Western blot检测结果
[0020] 图2C为可活体成像监测肝脏中IFN- β活性的小鼠模型稳定性的活体成像检测结 果
[0021] 图2D为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型稳定性的巢式PCR检测结 果
[0022] 图3Α为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型其IFN-β启动子活化的 活体成像检测结果
[0023] 图3Β为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型其血清中IFN-β含量的 检测结果
[0024] 图4A为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型其IFN-β启动子被 HCVNS3/4A蛋白酶抑制的活体成像检测结果
[0025] 图4B为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型其IFN-β启动子被 HCVNS3/4A蛋白酶抑制的血清中IFN-β ELISA检测结果
[0026] 图4C为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型其IFN-β启动子被 HCVNS3/4A蛋白酶抑制的Western blot检测结果
[0027] 图5为可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型来评价真实病毒对IFN-β 启动子作用的活体成像检测结果
[0028] 图6Α为重组载体pattB-NF κ B-Fluc的结构示意图
[0029] 图6B为可活体成像监测肝脏中NF κ B活性的小鼠模型肝脏Flue表达情况的活体 荧光成像监测结果
[0030] 图7A为pattB-NF K B-Fluc质粒在小鼠肝脏长效整合激活再表达情况的检测结果
[0031] 图7B为nest-PCR对可活体成像监测肝脏中NF κ B活性的小鼠模型整合位点的鉴 定结果
[0032] 图8为利用可活体成像监测肝脏中NF κ B活性的小鼠模型对NF- κ B抑制剂TOTC 的作用评价结果
【具体实施方式】
[0033] 实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0034] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0035] 实施例1、构建可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型
[0036] 用本发明的方法构建可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型，具体方法 包括以下步骤：
[0037] -、构建携带噬菌体整合酶识别位点attB基因、IFN-β启动子以及萤火虫荧光素 酶（Flue)报告基因的重组载体pGL3-attB-IFN3
[0038] 以！fepG2细胞基因组为模板，在上游引物IFNBpf :
[0039] AGATCTAATTCTCAGGTCGTTTGCTT 和下游引物 IFNBpr :
[0040] AAGCTTAAAGGTTGCAGTTAGAATGT 的引导下，利用高保真 PrimeSTAR? HS DNA 聚合 酶，PCR扩增人的IFN-β启动子序列（其核苷酸序列如序列表中序列1所示），扩增结束 后，对PCR扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化300bp的IFN-β启动子序列， 然后将IFN-β启动子序列经Bglll和Hindlll双酶切处理后，与经过相同酶（Bglll和 Hindlll)酶切的载体pGL3-Basic (其物理图谱如图1所示）进行连接，得到携带萤火虫荧 光素酶（Flue)报告基因和IFN-β启动子的重组载体pGL3-IFN-P，再以pTA-attB(GR0TH A C, OLIVARES E C, THYAGARAJAN B, CALOS Μ P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells.Proc Natl Acad Sci USA 2000 ； 97(11) :5995-6000.由Μ. P. Calos博士提供）为模板，在上游引物attBf :
[0041] CTCGAGGCAGGTACCGTCGACGATG 和下游引物 attfc :
[0042] AGATCTGGCTGTCGACATGCCC的引导下，PCR扩增attB基因（其核苷酸序列如序列表 中序列2所示），扩增结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化297bp 的attB基因，然后将attB基因经Xhol和Bglll双酶切处理后，与经过相同酶（Xhol和 Bglll)酶切的载体pGL3-Basic进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛 选阳性克隆，提质粒，得到含有噬菌体整合酶识别位点attB基因、IFN-β启动子引导萤火 虫荧光素酶（Flue)报告基因表达的重组载体，命名为pGL3-attB-IFNi3。
[0043] 二、获得活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型
[0044] 1、获得活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型
[0045] 将步骤一构建的重组载体pGL3-attB_IFN0及噬菌体整合酶质粒PhiC31o利用 尾静脉高压注射的方法（水动力法）导入小鼠体内，得到受IFN-β启动子调控表达的萤 火虫荧光素酶（Flue)报告基因整合于小鼠肝脏的活体成像监测IFN-β活性的小鼠模型， 具体方法为：先将步骤一得到的重组质粒pGL3-attB-IFNP用无内毒素质粒大量纯化试 剂盒进行质粒纯化（按照 QIA，GEN 公司、Protocol for EndoFree Plasmid Maxi Kit 进 行），然后选4-6周龄的雄性BALB/c小鼠（购于军事医学科学院实验动物中心）20只，将 pGL3-attB-IFN β 10 μ g和噬菌体整合酶表达质粒PhiC31o (购自Addgene公司）20 μ g混合 于相当于小鼠体重10%的生理盐水，在3秒钟以内通过尾静脉快速转染至小鼠肝脏。
[0046] 三、活体荧光成像仪监测小鼠模型肝脏中萤火虫荧光素酶（Flue)的活性
[0047] 分别在转染后的不同时间点（0、8、36、60小时）注射Flue的作用底物一 D-Luciferin至步骤二中的小鼠腹腔，5min后麻醉小鼠，置于IVIS活体突光成像仪进行检 测。
[0048] 结果如图2A所示，荧光素酶活性在第8个小时就已经达到了高峰，随着时间延长， 荧光素酶活性逐渐降低，到了 60小时基本上检测不到。
[0049] 四、Western blot验证小鼠模型肝脏中萤火虫突光素酶（Flue)的表达水平
[0050] 在相应时间点（8、36、60小时）处死步骤二获得的模型小鼠，取肝脏蛋白用 Western blot法检测肝脏中萤火虫突光素酶（Flue)的表达水平，一抗为anti-luciferase mAb (购自Promega公司），二抗为辣根酶标记的羊抗鼠抗体（购自北京中杉金桥生物技术 有限公司），以β -actin为内参。
[0051] 结果如图2B所示，可以看出，小鼠模型肝脏中萤火虫荧光素酶（Flue)的表达水平 随着时间的延长，发光减弱，蛋白表达量也减少。
[0052] 五、小鼠模型的稳定性评价
[0053] 为了验证噬菌体整合酶的整合效率，构建了两组小鼠模型，一组是只转染 pGL3-attB-IFN0质粒，第二组是共转染pGL3-attB-IFN0和PhiC31o质粒，转染后第5天 和第30天分别用水动力方法注射10 μ g poly (I: C)(聚肌胞苷酸，聚肌苷酸-聚胞苷酸）， 8小时后活体成像检测荧光素酶的表达水平。结果如图2C所示，可以看出，在第5天荧光 素酶都能够被poly (I:C)激活，两组之间没有明显差别，而在第30天，第一组已经不能被 p〇ly(I:C)激活，而第二组由于同时转染了噬菌体整合酶，仍然能够被p〇ly(I :C)激活。
[0054] 再取两组小鼠的肝脏基因组DNA作为模板，进行巢式PCR扩增，引物序列如下：
[0055] mspLl(forward) :5， -GTGGCACATTCCTTAATCCC-3，，
[0056] mspLl(reverse) :5， -TGAGGAGGAGCCTTAGCAAC-3，；
[0057] attB-1 :5' -GTAGGTCACGGTCTCGAAGC-3，，
[0058] attBU' -CGAAGCCGCGGTGCGGGTGCCA-3'。
[0059] 扩增结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2D所示，可 以看出，第二组3只小鼠 attL和attR都能见到250bp左右特异性的条带。将PCR扩增产 物回收连接到T载体上进行克隆测序，测序结果如下：
[0060] 测序序列attL arm sequence report:
[0061] attB arm core mpsLl arm
[0062] Mouse -1:CGCGGTGCGGGTGCCAGG**GT*CCCTT*ac*cccaaaggccctattaatttagggagcct
[0063] Mouse - 2:CGCGGTGCGGGTGCCAG*G*GT**CCTTgac*cccaaaggccctattaatttagggagcct
[0064] Mouse - 3:CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC*T*C*CTT**c**ccaaaggccctattaatttagggagcct
[0065] attR arm sequence report:
[0066] attB arm core mpsLl arm
[0067] Mouse -1: CGCGGTGCGGGTGCCAGGGCG*GCCCTTg**ccccaaaggccctattaatttagggagcct
[0068] Mouse - 2: CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC*TGC*CTTgaca*ccaaaggccctattaatttagggagcct
[0069] Mouse - 3: CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC***C*CTTgacacccaaaggccctattaatttagggagcct
[0070] 对测序结果进行BLAST比对分析，结果发现，表达载体attB位点和小鼠第2号染 色体的mpsLl位点发生整合，整合铰链区（core area)为TTG，有3-7个碱基丢失。
[0071] 实施例2、用可活体成像监测IFN-β活性的小鼠模型评价IFN-β启动子的活化
[0072] 为了验证实施例1构建的活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型能否用来 评价IFN-β在小鼠肝脏的活化，选用IFN-β产生的信号途径中一种病原相关分子模式 poly(I:C)来作为诱导剂。将poly(I:C)加至相当于小鼠体重10%的生理盐水，利用水动 力转染方法快速注射（5-8 sec)入小鼠体内，分别检测小鼠肝脏荧光素酶的表达及血清中 IFN-β的水平，具体为：将poly (I:C) 10 μ g靶向送入3只小鼠肝脏（实验组），并在4、8、 12、24、48、60小时活体成像监测小鼠肝脏的荧光活性，同时设3只对照组小鼠水动力注射 生理盐水。
[0073] 活体成像检测结果如图3A所示，仅仅注射生理盐水的小鼠没有检测到光子，而注 射poly (I:C)的小鼠4小时就能够看到明显的发光，在8小时发光值达到顶峰，然后随着时 间延长，发光越来越弱，60小时就完全检测不到。
[0074] 在上述时间点活体成像完成后，随即通过眼眶后静脉丛采血，取血清测量血清中 IFN-β的含量。结果如图3B所示，实验组血清IFN-β在4-8小时达到高峰，然后逐渐下 降，24小时后基本达到基础水平，而对照组血清中的IFN-β并没有明显变化。
[0075] 实施例3、用可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型评价IFN-β启动子的 抑制
[0076] HCV NS3/4A蛋白酶是已知的IFN-β活化信号通路中的抑制剂，在细胞水平的研 究已经证明HCV NS3/4A蛋白酶能够通过剪切人类的细胞中MAVS来阻断IFN-β活化信号的 传导。用实施例1构建的活体成像监测IFN-β活性的小鼠模型来评价HCV NS3/4A蛋白酶 对IFN- β抑制作用。将pCI-neo (对照组，购自Promega公司）和pCI-HCV NS3/4A (实验 组，将HCV NS3/4A插入pCI-neo载体中构建）两组质粒分别用水动力的方法转染至实施例 1构建的活体成像监测IFN- β活性的小鼠模型的肝脏中，24小时后用poly (I: C) 10 μ g (或 生理盐水）刺激IFN-β活化，8小时后通过活体荧光成像监测荧光素酶的表达，在活体成像 后随即采血收集血清，然后处死部分小鼠取肝脏冻存。通过ELISA检测血清中IFN-β的表 达水平（Mouse Interferon beta ELISA kit，购自 PBL 公司），用 Western blot 检测肝脏 中HCV NS3/4A蛋白的表达水平，一抗为anti-NS3 mAb (购自Santa Cruz公司），二抗为辣 根酶标记的鼠抗羊抗体（购自北京中杉金桥生物技术有限公司）。
[0077] 活体荧光成像监测荧光素酶表达水平的检测结果如图4A所示，用p〇ly(I:C)刺 激后，对照组对比实验组的荧光素酶表达水平有显著性差异（P = 〇. 018)，对照组荧光值比 实验组高约6倍；血清中IFN-β表达水平的ELISA检测结果如图4B所示，对照组血清中 IFN-β的表达水平平均为实验组的4倍；血清中IFN-β表达水平的Western blot检测结 果如图4C所示（Intact MAVS表示完整的MAVS，Cleaved MAVS表示切割的MAVS)，能够检 测到实验组小鼠肝脏中的HCV NS3/4A的表达及MAVS的切割，从而证实IFN- β活化信号能 够被HCV NS3/4A蛋白酶阻断。
[0078] 实施例4、用可活体成像监测肝脏中IFN-β活性的小鼠模型来评价真实病毒对 IFN-β启动子的作用
[0079] 病毒为鼠肝炎病毒MHV-3,病毒滴度为100PFU，将100 μ 1的该病毒通过腹腔注射 来感染实施例1构建的可活体成像监测有IFN-β活性的模型小鼠，分别在4、8、12、24、28 小时进行活体成像观察小鼠肝脏的荧光素酶表达。
[0080] 观察结果如图5所示，在病毒接种后4小时就能够见到肝脏荧光素酶的表达，在 8小时达到峰值，表明本发明的小鼠模型可以用来评价病毒感染引起的天然免疫中IFN-β 活化。
[0081] 实施例5、构建可活体成像监测肝脏中NF-κ Β活性的小鼠模型
[0082] 用本发明的方法构建可活体成像监测肝脏中NF-κ Β活性的小鼠模型，具体方法 包括以下步骤：
[0083] 一、构建携带噬菌体整合酶识别位点attB基因、NF-κ Β基因以及萤火虫荧光素酶 (Flue)报告基因的重组载体pattB-NF κ B-Fluc
[0084] 使用ΚρηΙ单酶切，对pNFK B-Fluc(购自Promega)进行单酶切，其单酶切体系如 下：pNFKB-Fluc 7μ1、ΚρηΙ 5yl、10XBuffer 5μ1、(ΜΗ20 33 μ1，总体积 50μ1。37?酶 切8h，酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳后切取5kb大小片段的条带进行产物回收（按试剂 盒说明书操作）将回收获得的pNF κ B-Fluc载体与attB片段（297bp)进行连接，构建目的 质粒pattB-NF κ B-Fluc，酶切产物连接反应体系：pattB-NF κ B-Fluc载体质粒1 μ 1、attB 片段 5μ1、10ΧΤ4 DNA Ligase Buffer 1μ1、Τ4 DNA Ligase 1μ1、(ΜΗ20 2 μ1，共 10μ1， 4°C过夜连接。载体的结构示意图如图6Α所示。
[0085] 二、获得可活体成像监测肝脏中NF-κ B活性的小鼠模型
[0086] 水动力转染法将步骤一构建的重组载体pattB-NF κ B-Fluc分别转染小鼠，具体 方法为：取6-8周龄的雄性BALB/c小鼠（H-2d)(购于军事医学科学院实验动物中心）10 只，将10 μ g重组质粒pattB-NF κ B-Fluc和20 μ g噬菌体整合酶表达质粒PhiC31o (购自 Addgene公司）混合于相当于小鼠体重10%的生理盐水，在五秒钟以内通过尾静脉快速转 染至小鼠肝脏。
[0087] 三、活体荧光成像监测模型小鼠肝脏Flue的表达
[0088] 分别在转染后的第1、3、6天，通过小动物活体成像系统监测NF-κ B的激活过程， 方法为：首先，注射D-Luciferin(FluC作用底物）至转染pattB-NFKB-Fluc小鼠腹腔， 5min后麻醉小鼠，置于IVIS活体荧光成像仪进行检测。
[0089] 结果如图6B所示，可以看出，转染pattB-NFK B-Fluc的小鼠肝脏中Flue表达时 间约为5-6天，且第一天的表达最为强烈，与水动力造成的肝损伤的过程相近。
[0090] 实施例6、pattB-NF K B-Fluc质粒在小鼠肝脏中长效整合激活再表达及药效评价
[0091] 一、pattB-NF κ B-Fluc质粒长效整合激活再表达
[0092] 分别于水动力转染pattB-NF κ B-Fluc后的11天、30天、60天、80天通过10 μ g/ 只的脂多糖（LPS)腹腔注射造成小鼠（实施例5构建的小鼠模型）急性肝损伤，激发小鼠 肝脏NF- κ B的表达，LPS注射后12小时进行活体成像。
[0093] 结果如图7A所示，可以看出，每次激活NFk B后，肝脏均有106_107的荧光光子数 可以被检出，而LPS注射前荧光光子数为零，说明本发明的小鼠模型可以灵敏的反应肝脏 组织中NF- κ B的活性情况。
[0094] 二、nest-PCR对小鼠模型整合位点的鉴定
[0095] 使用Invitrogen公司的DNA Zol提取实施例5构建的转染pattB-NF κ B-Fluc质 粒的模型小鼠的肝脏基因组DNA，进行巢式PCR扩增，引物序列如下：
[0096] mspLl(forward) :5， -GTGGCACATTCCTTAATCCC-3，，
[0097] mspLl(reverse) :5， -TGAGGAGGAGCCTTAGCAAC-3，；
[0098] attB-1 :5' -GTAGGTCACGGTCTCGAAGC-3，，
[0099] attBU' -CGAAGCCGCGGTGCGGGTGCCA-3'。
[0100] 扩增结束后，对PCR扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图7B所示，可 以看出，3只小鼠 attL和attR都能见到250bp左右特异性的条带。将PCR扩增产物回收连 接到T载体上进行克隆测序，测序结果如下：
[0101] 测序序列attL arm sequence report:
[0102] attB arm core mpsLl arm
[0103] Mouse -1: CGCGGTGCGGGTGCCAGG**GT*CCCTT*ac*cccaaaggccctattaatttagggagcct
[0104] Mouse - 2: CGCGGTGCGGGTGCCAG*G*GT**CCTTgac*cccaaaggccctattaatttagggagcct
[0105] Mouse - 3: CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC*T*C*CTT**c**ccaaaggccctattaatttagggagcct
[0106] attR arm sequence report:
[0107] attB arm core mpsLl arm
[0108] Mouse -1: CGCGGTGCGGGTGCCAGGGCG*GCCCTTg**ccccaaaggccctattaatttagggagcct
[0109] Mouse - 2: CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC*TGC*CTTgaca*ccaaaggccctattaatttagggagcct
[0110] Mouse - 3: CGCGGTGCGGGTGCCAGGGC***C*CTTgacacccaaaggccctattaatttagggagcct
[0111] 对测序结果进行BLAST比对分析，结果发现，表达载体attB位点和小鼠第2号染 色体的mpsLl位点发生整合，整合铰链区（core area)为TTG，有3-7个碱基丢失。
[0112] 三、利用可活体成像监测肝脏中NFk B活性的小鼠模型对NF-κ B抑制剂H3TC的 作用评价
[0113] 首先向小鼠腹腔注射120mg/kg的roTC(NF_K B抑制剂/抗氧化剂），半小时后在 腹腔注射10 μ g/只的LPS，在腹腔注射LPS之后开始计时，分别于2、4、12运用活体成像技 术检测NF- κ B的激活情况和被TOTC的抑制情况。
[0114] 利用可活体成像监测肝脏中NF κ B活性的小鼠模型活体成像结果如图8所示，LPS 激活两小时后roTC对NF- Κ B有明显的抑制作用。
【权利要求】
1. 一种可活体成像监测肝脏中NF-κ B活性的小鼠模型的构建方法，包括以下步骤： 1) 载体构建：构建携带噬菌体整合酶识别位点attB基因、NFk B基因以及萤火虫荧光 素酶（Flue)报告基因的重组载体，所述噬菌体整合酶识别位点attB基因与NFkB基因位 于Flue报告基因的上游； 2) 将步骤1)构建的重组载体及噬菌体整合酶质粒利用尾静脉高压注射的方法（水动 力法）导入小鼠体内，得到受NFkB基因调控表达的萤火虫荧光素酶（Flue)报告基因整合 于小鼠肝脏的小鼠模型。
2. 根据权利要求1所述的小鼠模型构建方法，其特征在于：所述步骤1)中用于构建携 带噬菌体整合酶识别位点attB基因、NFk B基因以及Flue报告基因的重组载体的出发载 体为pNF κ B-Luc，以pNF κ B-Luc为出发载体构建的携带噬菌体整合酶识别位点attB基因、 NF-κΒ基因以及萤火虫荧光素酶（Flue)报告基因的重组载体pattB-NFKB-Fluc。
3. 根据权利要求1或2所述的小鼠模型构建方法，其特征在于：所述步骤2)中的噬菌 体整合酶质粒为PhiC31o,所述将步骤1)构建的重组载体及噬菌体整合酶质粒利用尾静脉 高压注射的方法（水动力法）导入小鼠体内的方法具体为：取4-6周龄的雄性小鼠，称重， 将重组质粒10 μ g和噬菌体整合酶表达质粒PhiC31o 20 μ g混合于相当于小鼠体重10%的 生理盐水，在3秒钟以内通过尾静脉快速转染至小鼠肝脏。
4. 用权利要求1-3任一项所述方法构建的可活体成像监测肝脏中NF-κ B活性的小鼠 模型。
5. 根据权利要求4所述的小鼠模型，其特征在于：所述小鼠模型是肝脏转染有报告基 因及NF- κ B基因的小鼠模型，所述NF- κ B基因调控报告基因的表达，所述报告基因用于指 不NF- κ Β基因的表达水平。
6. 根据权利要求4所述的小鼠模型，其特征在于：所述报告基因为各种荧光素酶或碱 性磷酸酶报告基因，优选为萤火虫荧光素酶（Flue)基因。
【文档编号】A01K67/027GK104232685SQ201410447646
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2011年12月26日 优先权日:2011年12月26日
【发明者】詹林盛, 周勇, 阎少多, 贾帅争 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所