复合生物肥及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种复合生物肥及其制备方法，涉及一种新型的生物肥及其生产。一种复合生物肥料，由黑曲霉培养物、解磷巨大芽抱杆菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌菌剂组成，复合生物肥料的重量份数组成为黑曲霉培养物10-25份、解磷巨大芽抱杆菌3-8份、枯草芽孢杆菌菌剂5-25份，植物乳杆菌CGMCC NO.940510-25，聚谷氨酸3-5。所述聚谷氨酸为γ-聚谷氨酸。使用本品可提高粮食产量20-40％，提高蔬菜产量20-40％，还可改善蔬菜、粮食的品质和风味。
CGMCC NO.9405
2014.07.02
【专利说明】复合生物肥及其制备方法
【技术领域】
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[0001]发明涉及农业技术中的肥料，涉及一种新型的生物肥及其生产。
【背景技术】
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[0002]生物肥料从最初的根瘤菌剂到细菌肥料，再到今天的生物肥料，从名称上的演变已说明我国生物肥料逐步发展的过程。目前国际上已有70多个国家生产、应用和推广生物肥料，我国目前也有500家左右企业年产约数百万吨生物肥料应用于生产。这虽与同期化肥产量和用量不能相比，但的确已开始在农业生产中发挥作用，取得了一定的经济效益和社会效应。
[0003]生物肥料是指一类含有大量活的微生物的特殊肥料。这类肥料施入土壤中，大量活的微生物在适宜条件下能够积极活动:有的可在作物根的周围大量繁殖，发挥自生固氮或联合固氮作用；有的还可分解磷、钾矿质元素供给作物吸收或分泌生长激素刺激作物生长。由此可见，生物肥料不是直接供给作物需要的营养物质，而是通过大量活的微生物在土壤中的积极活动来提供作物需要的营养物质或产生激素来刺激作物生长，这与其它有机肥和化肥的作用在本质上是不同的。
[0004]物肥料的种类很多，现在推广应用的主要有根瘤菌类肥料、固氮菌类肥料、解磷解钾菌类肥料、抗生菌类肥料和真菌类肥料等等。这些生物肥料有的是含单一有效菌的制品，也有的是将固氮菌、解磷解钾菌复混制成的复合型制品，市场上除了根瘤菌类等少数肥料制品是含单一的有效菌外，大多数制品都是复合型的生物肥料。各种固氮菌肥料，可以增加土壤中的氮素来源，解磷解钾菌肥料可以将土壤中难溶性的磷、钾溶解出来，增加土壤中磷(P)、钾(K)元素的来源。另外，生物肥料还能促进作物的生长，改善农产品的品质。各种生物肥施入土壤中，都能产生不同的生长激素，刺激作物的生长，如“5406”放线菌生物肥，不但有拮抗病原菌防病壮菌的作用，还能分泌细胞分裂素促进作物的生长。真菌类的生物肥不仅在协助作物吸收磷、锌及铜等矿质元素方面有很强的作用，还有增强作物的吸水、保水以提高作物抗旱能力的作用。由于生物肥料能制造和协助作物吸收利用多种营养元素，因此对农产品的品质有很大的改善，可以改变因施化肥产生的“瓜不香，果不甜，茶无味”的现状，使农产品各项指标达到绿色食品的标准。
[0005]一种好的生物肥料在有效活菌数、含水量、PH值、吸附剂颗粒细度、有机质含量、杂菌率以及有效保存期等方面都有严格的要求。根据我国NY227 - 94农业行业标准规定，液体生物肥料每毫升应含5亿?15亿个活的有效菌。固体生物肥每克含活的有效菌为I亿?3亿个，含水量20 %?35 %为宜，吸附剂细度在0.18毫米左右，吸附剂的细度越细吸附的有效菌就越多。PH5.5?7.5，杂菌率低于15%?20 %，不含致病菌和寄生虫，有效保存期不低于6个月。
[0006]当前，随着生物肥料的发展，少数地方在生产生物肥料时出现了无生产许可证、生产工艺落后、用未通过鉴定的菌种进行生产、有效菌含量低、杂菌超标等现象。还有些厂家在生物肥料中加入不适量的化肥或其它添加剂，使肥料中化肥的氮、磷、钾含量过高导致有效菌死亡，而失去生物肥的作用。因此在选用生物肥料时要注意产品质量，防止假冒伪劣产品，以避免给农业生产带来不应有的损失。
【发明内容】
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[0007]本发明的发明目的是提供一种能针对我国土壤肥力的基本情况，开发一种复合生物肥。
[0008]本发明的技术解决方案是:
[0009]一种复合生物肥料，由黑曲霉培养物、解磷巨大芽抱杆菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌菌剂组成，复合生物肥料的重量份数组成为黑曲霉培养物10-25份、解磷巨大芽抱杆菌3-8份、枯草芽孢杆菌菌剂5-25份，植物乳杆菌CGMCC N0.9405 10_25，聚谷氨酸3_5。
[0010]所述聚谷氨酸为Y-聚谷氨酸。
[0011]一种复合生物肥料的制备方法，将黑曲霉培养物、解磷巨大芽抱杆菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌分别进行培养、发酵，然后将发酵产物按比例混合造粒后再与Y-聚谷氨酸混匀即可。
[0012]解磷巨大芽抱杆菌是芽抱杆菌属(Bacillus)中的一个种。运动，形成荚膜，好氧。从葡萄糖产酸，也常从阿拉伯糖和甘露醇产酸。水解淀粉，不产生卵磷脂酶，VP阴性。能分解土壤中的有机磷成为植物可利用的速效磷。
[0013]解磷巨大芽孢杆菌剂由沧州旺发生物技术研究所提供，地址:中国河北沧州市运河区解放西路颐和国际商务中心A座I区807-812。
[0014]黑曲霉培养物制备:菌种培养，采用常见固体发酵培养方法:孢子液接种到固态发酵培养料中，26-33 °C培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物。
[0015]本发明中植物乳杆菌菌株特点如下:在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，不产芽孢；在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。
[0016]理化特征为:过氧化氢酶(_)，明胶液化(_)，吲哚实验(+)，运动性(_)，发酵产气(-)，亚硝酸盐还原(_)，发酵产气(_)，产硫化氢气体(_)，PH4.0MRS培养基中生长(+)。
[0017]本发明植物乳杆菌采用下述流程进行选育:
[0018]原始出发菌种一试管活化一硫酸二乙酯(DES)诱变一亚硝基胍(NTG)诱变一等离子体诱变一平板初筛一摇瓶复筛一传代稳定性试验。
[0019]本发明所采用的出发菌株在MRS葡萄糖培养基中，其乳酸的生产速率为1.5g/L/d,当培养基pH为3.5时几乎停止生长，对亚硝酸钠的分解速率为0.34mg/h/kg白菜。出发菌株为李政采集于宁夏盐池县育肥羊场的青储饲料，采集时间2013年9月15日。
[0020]为了提高其乳酸生产速率、耐酸能力和亚硝酸盐的分解速率，依次采用DES和NTG技术对该菌种进行诱变，诱变后菌株采用MRS碳酸钙平板进行初筛，然后采用500mL摇瓶发酵，生物传感器分析仪对高产菌进行复筛，选育优良的植物乳杆菌菌株，然后做传代实验，评价其遗传稳定性。
[0021]植物乳杆菌tlj-2014遗传稳定性结果表明:经过连续传代十次，各项性能指标都比较稳定，遗传性较好，性状没有回复，因此把植物乳杆菌tlj-2014作为选育得到的目的菌株。
[0022]经验证发现:该诱变菌株的乳酸生产速率可以达到35g/L/d，该菌株经过71小时发酵后乳酸浓度达到95g/L ;能够在pH为1.80的条件下存活。降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到9.8mg/h/kg (自然发酵过程亚硝酸盐积累的速率大约为1.lmg/h/kg),能够耐1%胆盐。
[0023]因此采用该菌种生产泡菜，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在5mg/kg以下，远低于国家标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。
[0024]植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) tl j-2014,该菌株已于 2014 年 7 月 2 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编:100101)，保藏号为CGMCC N0.9405。
[0025]1.DES诱变选育
[0026]I)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌L 一环，接入装有50mL培养基MRS (无琼脂，葡萄糖20g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。
[0027]2)取5mL菌液，5000rpm离心1min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
[0028]3)用pH7.0磷酸缓冲液稀释成17个/mL菌悬液。
[0029]4)取32mL pH7.0的磷酸钾缓冲液、8mL菌悬液、0.4mL DES在预先放入转子的150mL三角瓶中充分混合，使DES最终浓度为I % (v/v)。
[0030]5)在 37°C摇床中 150rpm 反应 30min，取 ImL 混合液，加入 0.5mL25% Na2S2O3 溶液中止反应。
[0031]6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸钙筛选培养基(含100g/L葡萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中。在37°C培养2?3天后，采用影印法将该筛选平板的菌株转印到pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS培养基(低pH值改性MRS培养基)上和亚硝酸钠筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上。
[0032]7)在37°C培养2?3天后，挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钠筛选培养基上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取出的菌落命名为植物乳杆菌LI。
[0033]2.亚硝基胍诱变
[0034]I)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌LI 一环，接入装有50mL培养基MRS (无琼脂)培养基(葡萄糖浓度为60g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。
[0035]2)取5mL菌液5000rpm离心1min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
[0036]3)用pH6.0磷酸缓冲液稀释成17个/mL菌悬液。
[0037]4)取1mL菌悬液转移至10mL三角瓶中，加入1mg的NTG，配制成终浓度为1mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0038]5)在37°C下200rpm振荡反应30min, 5000rpm离心1min收集菌体,用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。
[0039]6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸钙筛选培养基(含100g/L葡萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中。在37°C培养2?3天后，采用影印法将该筛选平板的菌株转印到pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS培养基(低pH值改性MRS培养基)上和亚硝酸钠筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上。
[0040]7)挑选菌株方法:挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钠筛选培养基上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取100支符合以上条件的菌落。
[0041]3.摇瓶复筛
[0042]I)在超净台上分别取各试管斜面上的植物乳杆菌一环，接入装有50mL培养基MRS (无琼脂)培养基(葡萄糖浓度为100g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养15h左右，使菌体处于对数生长中期。
[0043]2)分别取5mL菌液，接入装有50mL碳酸钙筛选液体培养基(含250g/L葡萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中、pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS液体培养基(低pH值改性MRS培养基)和亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上(注:采用250mL三角瓶)。200rpm，37°C培养3-4天，每天分别检测碳酸钙筛选液体培养基中L-乳酸产生速率、LPHMRS液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速率。发酵结束后，比较100株菌种的碳酸钙筛选液体培养基中L-乳酸产生速率、LPHMRS液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速率。
[0044]3)选择兼具高L-乳酸产生速率、耐受低pH (该菌种仅能在最低为pHl.8的培养基中生长)和亚硝酸盐的消耗速率高的菌株，将其命名为L2菌。
[0045]4.遗传稳定性试验
[0046]将L2菌在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。菌株命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2014。
[0047]5.5L发酵罐试验
[0048]I)取斜面上的植物乳杆菌L2 —环，接入装有50mL培养基MRS (无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。
[0049]2)将对数期的菌种接入装有3L MRS液体培养基(初始葡萄糖为150g/L)的5L发酵罐中。接种量为10%，37°C下10rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10% (通气0.5L/min)，后期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌L2的乳酸产量达到95g/L。这样的产乳酸速率利于泡菜的快速发酵。
[0050]3)将对数期的菌种接入装有3L pH为1.8的LPHMRS液体培养基(初始葡萄糖为50g/L)的5L发酵罐中。接种量为10%，37°C下10rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10%(通气0.5L/min)，后期厌氧，整个过程用0.5mol/L的氢氧化钠将发酵液pH控制在1.8，总培养时间为48小时。发酵结束后，检测植物乳杆菌L2的生物量为2.5g/L，说明植物乳杆菌L2能够在pHl.8的环境中生存。
[0051]4)将对数期的菌种接入装有3L亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)的5L发酵罐中。接种量为10%，37°C下10rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10% (通气0.5L/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速率流加20g/L的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌L2对亚硝酸钠的降解速率。结果发现:在该条件下，L2对亚硝酸钠的降解速率可以达到563mg/h/L0
[0052]将对数期的菌种1mL接入装有2kg预处理过的白菜中，按照传统泡菜方法进行加工，每12小时测定泡菜中的亚硝酸盐含量。结果发现，在整个发酵过程中，L2菌对亚硝酸钠的分解速率为9.8mg/h/kg白菜。泡菜中的亚硝酸钠含量始终低于5mg/kg，远低于国家标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。
[0053]有益效果:
[0054]实验表明，使用本品可提高粮食产量20-40 %，提高蔬菜产量20-40 %，还可改善蔬菜、粮食的品质和风味。每亩土地使用本发明的肥料的量为50-120克，是目前国内外使用量较少的高效复合生物肥料之一。
【具体实施方式】
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[0055]下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0056]1、菌剂培养制备:
[0057]枯草芽孢杆菌剂培养制备:枯草芽孢杆菌菌剂制备:从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕离心分离获得湿菌体和发酵液；发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的40-50%，得到菌浓缩液。添加载体:向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5:1，载体组成为:CaC0320-40份，糊精10-20份。流化床干燥，干燥温度50°C。
[0058]黑曲霉培养物制备:菌种培养，固体发酵培养:孢子液接种到固态发酵培养料中，26-35 °C培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物；
[0059]本发明提供的产耐高温α-淀粉酶的菌株具体为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)L1-2013-02。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110:，地址为:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为 CGMCC N0.7926。
[0060]所述菌株特点如下:
[0061]所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥不透明，边缘整齐，为具有运动性的好氧菌。镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性。该菌可利用柠檬酸盐，硝酸还原、V-P实验成阳性。
[0062]所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L1-2013_02由一株保藏于本实验室的产耐高温α -淀粉酶的枯草芽孢杆菌L1-2013经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，具体筛选步骤如下:
[0063](I)菌悬液的制备
[0064]将在平板划线分离后长出的L1-2013单菌落接入种子培养基中，100r/min，40°C培养12h后,取ImL培养液离心后用生理盐水洗漆两次,并重悬与9mL生理盐水中。
[0065](2)紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变
[0066]将菌悬液置于无菌平板中，在距离为30cm，功率15w的紫外灯下搅拌照射100s。将经过照射的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板，并以未经紫外照射的菌液稀释涂平板做对照。将上述涂布均匀的平板，用黑色的布或报纸包好，置40°C培养48h，在长出菌落的平板上筛选出水解圈与菌落直径比值最大者挑至斜面保存，纯化后配制成菌悬液，经梯度稀释后与硫酸二乙酯原液充分混合，并于40°C震荡处理40min，将处理过的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板。
[0067](3)高产菌种的初筛
[0068]将上述涂布均匀的平板，置40°C培养48h，在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后获得三株菌L1-2013-01，L1-2013-02，L1-2013-03
[0069](4)摇瓶发酵复筛
[0070]将获得的三株菌L1-2013-01，L1-2013-02, L1-2013-03在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10% (V/V)，40°C、100r/min培养72h，离心取发酵上清液制得粗酶液。
[0071](5)酶活测定
[0072]酶活单位的定义:lmL粗酶液,于105°C、pH 4.2条件下，Imin液化Img可溶性淀粉，即为I个酶活力单位，以U/mL表示。
[0073]经测定，菌株L1-2013-02，为稳定的最高产菌株，且酶活达到30000U/mL，比原始菌株酶活提高1.6倍。
[0074]所述氯化锂平板:淀粉I %，蛋白胨 I %，(NH) 2S040.4 %，K2HPO40.8%, CaCl20.2%,氯化锂0.9%,琼脂2%。
[0075]所述的种子培养基:酵母粉0.5%，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCl I %。
[0076]所述的发酵培养基:玉米粉5%?15%，豆饼粉4%?10%，(NH) 2S040.4 %,K2HP040.8%, CaC120.2%?
[0077]所述的摇瓶培养条件:该菌在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，接种量10%(V/V)，100r/min、40°C 发酵培养 72h。
[0078]由菌株L1-2013-02发酵获得了一种耐高温的α -淀粉酶，其酶学性质如下:
[0079](I)该酶温度适应范围较宽，最适作用温度在105_115°C之间，且在110°C以下保存的温度稳定性较好，而115°C以上保存长时间温度稳定性较差。
[0080](2)该酶最适反应pH值为4.2。在pH值3.0_7.0之间均有较高酶活力，在pH值为3.0时酶活完全稳定。
[0081](3)酶活性:由本发明所提供的突变株L1-2013-02，制备的耐高温α -淀粉酶酶活力为 30000-35000U/ml。
[0082]1、本发明使用紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变的方法获得了一株高产耐高温α -淀粉酶的枯草芽孢杆菌L1-2013-02，该菌株具有强耐酸、耐热性，产酶活力高的特点。
[0083]2、有该菌株生产所得的耐高温α-淀粉酶酶活力高达30000-35000u/ml，；适用温度范围为25-115°C，最适反应温度110°C，在110°C酶活完全稳定；适用反应pH值范围为3.0-7.0，在pH值为3.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为4.2，比现有的耐高温α -淀粉酶酶活力高，酶作用最适PH值范围宽泛，耐温度高，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。
[0084]本发明提供的黑曲霉菌株Aspergillus niger L1-2013-03是由实验室保藏的一株产纤维素酶产的黑曲霉Aspergillus niger L1-2010经多轮亚硝基胍诱变，然后对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产高活力纤维素酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger L1-2013-03o
[0085]本发明提供的产高活力纤维素酶的菌株具体为黑曲霉Aspergillus nigerL1-2013-03。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编100101)，保藏号为 CGMCC N0.7927。
[0086]产高活力纤维素酶菌株的筛选方法，包括以下步骤:
[0087]I)斜面培养:将原始黑曲霉菌株Aspergillus niger L1-2010划线接种斜面培养基，30°C培养2?3d，直至菌丝体成熟、产大量黑色孢子。所述斜面培养基组成如下:12°Brix 麦芽汁 100mL, pH 值自然，121°C灭菌 20min ；
[0088]2)孢子悬液制备(以下步骤均在无菌条件下操作):向试管斜面加入15mL无菌水，把孢子刮下，用滤纸过滤，将滤过液倒入已灭菌、并加有5-10粒无菌玻璃珠的150mL三角瓶中，将三角瓶放入摇床振荡10-15min，使孢子分散。
[0089]3)亚硝基胍(NTG)诱变
[0090]A.用无菌水将孢子悬浮液调节为稀释成16-1O7个/mL。
[0091]B.取1mL菌悬液转移至10mL三角瓶中，加入1mg的NTG,配制成终浓度为1mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0092]C.在30°C下200rpm振荡反应30min, 5000rpm离心1min收集菌体,用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。
[0093]D.适当稀释将孢子浓度调节为13个/mL，取最后稀释度的菌液0.2mL，稀释涂布于纤维素-刚果红平板筛选培养基上。在30°C培养2?3天后挑取透明圈/菌落直径较大的菌株200支。(所述纤维素-刚果红平板筛选培养基组成如下:纤维素粉10g、刚果红0.2g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾lg、氯化钠0.lg、明胶2g、琼脂20g、自来水定容100mL, pH 值 5-6,121°C灭菌 20min)。
[0094]E.复筛:将获得的200株菌分别用无菌牙签接种于斜面培养基，30°C培养至孢子铺满斜面。分别将孢子以无菌水洗下接种于装有50mL复筛培养基的250mL三角瓶中进行发酵，接种量10% (V/V)，30°C、100r/min培养96h，分别测定各菌株的纤维素酶活性。(所述复筛培养基组成如下:纤维素粉50g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾lg、氯化钠0.lg、自来水定容lOOOmL，pH值5_6，121°C灭菌20min)。选取纤维素酶酶活力最高的菌株进行放大实验。
[0095]4)遗传稳定性试验
[0096]将L1-2013-03菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。
[0097]5)放大试验
[0098]①种子培养:将纤维素酶酶活力最高的菌株Aspergillus niger L1-2013-03接入500mL三角瓶中，种子培养基装量100毫升，30°C、150rpm摇床培养72_96h。
[0099]③种子罐培养:将种子液以10% (v/v)接种量接入装有7.5L发酵液的10L发酵罐中，控制pH值恒定为6.0±0.2，培养温度30±0.1 °C，搅拌速度300rpm，通风量(v/V) 1:0.8-1.2，培养时间96h，溶解氧20-30%。所述发酵培养基组成为:纤维素粉10gjt酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾lg、氯化钠0.lg、自来水定容lOOOmL，pH值5_6，121°C灭菌20min。
[0100]发酵结束后，取发酵上清液(粗酶液)进行酶活力检测经测定，菌株Aspergillusniger L1-2013-03的外切β-葡聚糖酶、内切β _葡聚糖酶、β _葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到 620U/mL、1289U/mL、456U/mL 和 732U/mL,分别比出发菌株 Aspergillus nigerL1-2010 提高了 9.21 倍、7.43 倍、8.15 倍和 10.31 倍。
[0101]实施例1
[0102]一种复合生物肥料，由黑曲霉培养物、解磷巨大芽抱杆菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌菌剂组成，复合生物肥料的重量份数组成为黑曲霉培养物20份、解磷巨大芽抱杆菌5份、枯草芽孢杆菌菌剂20份，植物乳杆菌CGMCC N0.940515，聚谷氨酸4。
[0103]所述聚谷氨酸为Y-聚谷氨酸。
[0104]实施例2
[0105]一种复合生物肥料，由黑曲霉培养物、解磷巨大芽抱杆菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌菌剂组成，复合生物肥料的重量份数组成为黑曲霉培养物10份、解磷巨大芽抱杆菌8份、枯草芽孢杆菌菌剂25份，植物乳杆菌CGMCC N0.940510，聚谷氨酸3。
[0106]所述聚谷氨酸为Y-聚谷氨酸。
[0107]实施例3
[0108]一种复合生物肥料，由黑曲霉培养物、解磷巨大芽抱杆菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌菌剂组成，复合生物肥料的重量份数组成为黑曲霉培养物25份、解磷巨大芽抱杆菌3份、枯草芽孢杆菌菌剂25份，植物乳杆菌CGMCC N0.940510，聚谷氨酸5。
[0109]所述聚谷氨酸为Y-聚谷氨酸。
[0110]选择宁夏吴忠地区进行试验；试验旱地种植玉米10亩，分别在种植时使用本发明产品每亩0.2公斤，出苗I个月左右通过锄地松土方式使用发明产品0.7公斤，对照组使用市场销售的类似生物肥料。
[0111]发明产品使用旱地玉米产量达到380公斤，对照组达到280公斤，比对照组节约灌溉用水12% ;该地块在第2年种植春小麦，春小麦产量达到了 300公斤，比对照组单产提高了 22%。且试验田土壤结构良好,无大块和板结。
【权利要求】
1.复合生物肥，由黑曲霉培养物、解磷巨大芽抱杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌菌剂和聚谷氨酸组成，复合生物肥的重量份数组成为黑曲霉培养物10-25份、解磷巨大芽抱杆菌3-8份、枯草芽孢杆菌菌剂5-25份，植物乳杆菌CGMCC N0.940510-25，聚谷氨酸3_5。
2.根据权利要求1所述的一种复合生物肥，所述聚谷氨酸为Y-聚谷氨酸。
3.根据权利要求1-2所述的一种复合生物肥，所述复合生物肥的重量份数组成为黑曲霉培养物20份、解磷巨大芽抱杆菌5份、枯草芽孢杆菌菌剂20份，植物乳杆菌CGMCCN0.940515，聚谷氨酸4。
4.根据权利要求1-2所述的一种复合生物肥，所述复合生物肥的重量份数组成为黑曲霉培养物10份、解磷巨大芽抱杆菌8份、枯草芽孢杆菌菌剂25份，植物乳杆菌CGMCCN0.940510，聚谷氨酸3。
5.根据权利要求1-4所述的一种复合生物肥的制备方法，将黑曲霉培养物、解磷巨大芽抱杆菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌分别进行培养、发酵，然后将发酵产物按比例混合造粒后再与Y-聚谷氨酸混匀即可。
【文档编号】C05F11/08GK104311169SQ201410510451
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】邵素英, 李建树 申请人:邵素英