一种海金沙孢子的萌发方法与流程

技术领域本发明涉及一种植物繁殖方法，尤其涉及一种海金沙孢子的萌发方法。

背景技术：
海金沙是常见的蕨类植物，它属于蕨类植物门、薄囊蕨纲、直蕨目、海金沙科、海金沙属，分布于热带和亚热带地区，北至山西及河南南部，西达四川、云南与贵州，全草或者成熟孢子可供药用，味甘淡，性寒，有清热解毒，利水通淋的功效；植株具缠绕习性，是垂直绿化的好材料，其所含成分较为复杂，具有生物活性成分，主要由酚类化合物、黄酮类、生物碱类、甾体及三萜类化合物等。试验表明：海金沙孢子50％的乙醇提取物具有显著的抗雄性激素作用，海金沙醇提物对藤黄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和乙型溶血性链球菌等均有较好的抑菌效果，此外，还发现海金沙具有抗流感病毒、HIV-1病毒、辛德毕斯病毒等的作用。在《嘉祐本草》、《本草正义》、《中国植物志》、《广西中药志》、《湖南药物志》、《常用中草药手册》、《湖南药物志》、《中国植物志》等书中均有记载。可用于治尿路感染、肝炎、肾炎水肿、尿路结石、白浊、白带、痄腮、咽喉肿痛、肠炎、痢疾、带状疱疹、皮肤湿疹等症。海金沙是常用中药，用量极大，而它的原料药均是靠收购野生药材为主。目前由于人为的大量采集和土地过度开发造成了海金沙的资源日见减少。因此开展海金沙的人工种植是保护海金沙种质资源的一种有效措施。在维管植物中，蕨类植物是唯一孢子体和配子体都可以独立生活的类群。多数蕨类植物孢子体产生的孢子可以萌发为能够独立生活的配子体，进而通过受精作用形成新的孢子体。自然条件下，蕨类植物孢子一般通过光照打破休眠，依靠重力作用完成细胞核迁移并建立极性，然后通过两次不对称的细胞分裂分别产生假根和原丝体原始细胞，原丝体原始细胞继续分裂形成配子体。可见，孢子萌发是蕨类植物生活史中的关键环节。“海金沙孢子体快速繁殖体系的建立”【曾智，江巍等.海金沙孢子体快速繁殖体系的建立[J].湖北民族学院学报(自然科学版)，2012，30(3)：335-338】以海金沙孢子叶为材料进行了繁殖研究，得到孢子叶分化为GGB的最佳条件为MS+NAA0.3mg/L+6-BA0.5mg/L，诱导率达90％；GGB增殖分化形成幼苗的最佳条件为MS+6-BA1.5mg/+NaH2PO4200mg/L，增殖系数达7.8；生根培养基最佳条件为1/2MS+NAA0.1mg/L+2％蔗糖，生根率达86.7％或者是1/2MS+IBA0.2mg/L+2％蔗糖生根率为87％；炼苗移栽到珍珠岩：草炭＝2:1的基质中，成活率达87.5％。能在短期内生产出大量海金沙组培苗，为工厂化育苗提供依据。然而上述方法是以海金沙孢子叶为材料的，对如何以孢子为材料，使其快速萌发成为配子体、孢子体并没有给出任何技术启示。CN103999750A公开了一种阴地蕨孢子的繁殖方法，包括以下四个步骤：一、阴地蕨孢子收集、预处理，二、阴地蕨孢子培养基准备、处理，三、孢子播种及管理、四、阴地蕨小苗移栽。本发明由于采用了上述的技术方案，解决以往阴地蕨种苗完全依赖野生资源的局限，以及传统蕨类植物繁殖组织培养投资大、需专业人员等的技术缺陷问题。具有繁殖系数高、成本低、成苗率高、腐烂率低等优点，可以将利用极少的母本材料最大限度的培养成优质小苗，作为母本种植，是目前繁殖阴地蕨的最佳途径之一。然而上述方法并不适用于海金沙孢子的繁殖。有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种海金沙孢子的萌发方法，该方法萌发率高、腐烂率低、成苗率高。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种海金沙孢子的萌发方法，包括如下步骤：1)采种采集海金沙植株孢子，装封并保存在恒温冰箱里备用；2)播种前准备在花盆底部装园土，淋透多菌灵或托布津液体，盖上透明薄膜密封1～2天，然后铺上2～3cm厚、经高温消毒过的泥炭土基质，淋透水；3)播种将步骤1)备用的孢子按0.25g～0.375g/m2的播种密度播种于泥炭土基质表层；4)日常管理盖上玻璃，维持温度在20～30℃、光照强度为2000～3000lx、光照时间为12h/d或覆盖荫蔽度为75％的遮阴网来控制光照强度，并保持土壤湿度在60％～88％、空气湿度为80％～90％的温室中培养；5)壮苗于播种第30天开始进行施肥，每10天施肥1次；6)初次移栽待幼孢子体长出2～3个羽片、植株8～14cm高时移栽到装有育苗基质的营养杯中育苗。孢子萌发是蕨类植物生活史中的关键环节。如何提高孢子的萌发率、降低腐烂率、从而提高成苗率，现有技术并没有给出更多的启示，本发明在对海金沙孢子进行了大量的研究，从最适海金沙孢子萌发温度、水分、基质、荫蔽度、播种密度、移栽时机等进行了大量的研究，得出了本发明的上述萌发方法，本发明方法基质制备简单，操作方法简单易行，解决了海金沙孢子繁殖过程中的技术瓶颈，使其幼孢子体移栽成活率达到90％以上。这一技术的应用将为海金沙孢子大田繁殖提供有力的依据，极具推广价值。本发明所述的萌发方法中，其中，所述的步骤1)为：孢子的采集时间是夏季8～9月，采集带成熟孢子的海金沙植株，然后将其放在薄膜上自然阴干，5～7d后孢子囊裂开，孢子自然散落，将孢子收集起来，用封口袋装封存，装封并保存在5±1℃的恒温冰箱里备用。进一步的，步骤2)中，在花盆内装4/5体积的园土，其表层用手捻细；所述的泥炭土基质为过80目筛并经120℃高温消毒过的泥炭土基质。进一步的，步骤2)中，所述的淋透水为采用雾喷的方式淋透水。上述萌发方法中，步骤3)中，所述的播种为用干净的毛笔粘上孢子粉均匀地播种于泥炭土基质表层。上述萌发方法中，步骤5)中，所述的施肥采用雾喷、薄施的方式施肥。上述萌发方法中，步骤6)中，所述的育苗基质为园土和泥炭土以3:1的质量比组成的混合基质。进一步的，在进行步骤6)所述的移栽时淋透定根水。在播种后，待海金沙配子体形成后，每日揭开覆盖在花盆上的玻璃通风1～2h并喷雾1次。步骤2)中，所述播种的播种时间是秋季9月中旬，在大棚内选用高25cm、直径30cm的花盆育苗。本发明基质制备简单，操作方法简单易行，解决了海金沙孢子繁殖过程中的技术瓶颈，使其幼孢子体移栽成活率达到90％以上。这一技术的应用将为海金沙孢子大田繁殖提供有力的依据，极具推广价值。与现有技术相比，本发明所提供的海金沙孢子的萌发方法具有萌发率高、腐烂率低、成苗率高的优点。具体实施方式以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。实施例1、海金沙孢子的萌发方法1)采种孢子的采集时间是夏季8～9月，采集带成熟孢子的海金沙植株，然后将其放在薄膜上自然阴干，5～7d后孢子囊裂开，孢子自然散落，将孢子收集起来，用封口袋装封存，装封并保存在5±1℃的恒温冰箱里备用；2)播种前准备播种时间是秋季9月中旬，在大棚内选用高25cm、直径30cm的花盆育苗，在盆内装4/5的园土，淋透多菌灵，盖上透明薄膜密封2天，然后铺上2～3cm厚、过80目细筛并经120℃高温消毒过的泥炭土基质，采用雾喷的方式淋透水；3)播种用当年采集的孢子按0.25g/m2播种，播种时用干净的毛笔粘上孢子粉均匀的播种于泥炭土基质表层；4)日常管理盖上玻璃，维持温度在20℃、光照强度为2000lx、光照时间为12h/d，保持土壤湿度在60％，空气湿度为80％的温室中培养；5)壮苗播种第30天开始进行施肥，10天/1次。6)初次移栽待幼孢子体长出2～3个羽片、植株8～14cm高时移栽到营养杯中育苗，育苗基质为园土：泥炭土＝3:1的混合基质，移栽时需淋透定根水。实施例2、海金沙孢子的萌发方法1)采种孢子的采集时间是夏季8～9月，采集带成熟孢子的海金沙植株，然后将其放在薄膜上自然阴干，5～7d后孢子囊裂开，孢子自然散落，将孢子收集起来，用封口袋装封存，装封并保存在5±1℃的恒温冰箱里备用；2)播种前准备播种时间是秋季9月中旬，在大棚内选用高25cm、直径30cm的花盆育苗，在盆内装4/5的园土，淋透托布津液体(按说明书)，盖上透明薄膜密封1天，然后铺上2～3cm厚、过80目细筛并经120℃高温消毒过的泥炭土基质，采用雾喷的方式淋透水；3)播种用当年采集的孢子按0.375g/m2播种，播种时用干净的毛笔粘上孢子粉均匀的播种于泥炭土基质表层；4)日常管理盖上玻璃，维持温度在30℃、光照强度为3000lx、光照时间为12h/d，保持土壤湿度在88％，空气湿度为90％的温室中培养；5)壮苗播种第30天开始进行施肥，10天/1次。6)初次移栽待幼孢子体长出2～3个羽片、植株8～14cm高时移栽到营养杯中育苗，育苗基质为园土：泥炭土＝3:1的混合基质，移栽时需淋透定根水。实施例3、海金沙孢子的萌发方法1)采种孢子的采集时间是夏季8～9月，采集带成熟孢子的海金沙植株，然后将其放在薄膜上自然阴干，5～7d后孢子囊裂开，孢子自然散落，将孢子收集起来，用封口袋装封存，装封并保存在5±1℃的恒温冰箱里备用；2)播种前准备播种时间是秋季9月中旬，在大棚内选用高25cm、直径30cm的花盆育苗，在盆内装4/5的园土，淋透多菌灵，盖上透明薄膜密封1～2天，然后铺上2～3cm厚、过80目细筛并经120℃高温消毒过的泥炭土基质，淋透水；3)播种用当年采集的孢子按0.50g/m2播种，播种时用干净的毛笔粘上孢子粉均匀的播种于泥炭土基质表层；在播种后，待海金沙配子体形成后，每日揭开覆盖在花盆上的玻璃通风2h并喷雾1次。4)日常管理盖上玻璃，覆盖荫蔽度为75％的遮阴网来控制光照强度，保持土壤湿度在75％，空气湿度为85％的温室中培养；5)壮苗播种第30天开始进行施肥，10天/1次。6)初次移栽待幼孢子体长出2～3个羽片、植株8～14cm高时移栽到营养杯中育苗，育苗基质为园土：泥炭土＝3:1的混合基质。实施例4、海金沙孢子的萌发方法1)采种孢子的采集时间是夏季8～9月，采集带成熟孢子的海金沙植株，然后将其放在薄膜上自然阴干，5～7d后孢子囊裂开，孢子自然散落，将孢子收集起来，用封口袋装封存，装封并保存在5±1℃的恒温冰箱里备用；2)播种前准备播种时间是秋季9月中旬，在大棚内选用高25cm、直径30cm的花盆育苗，在盆内装4/5的园土，淋透托布津液体(按说明书)，盖上透明薄膜密封2天，然后铺上2～3cm厚、过80目细筛并经120℃高温消毒过的泥炭土基质，淋透水；3)播种用当年采集的孢子按0.30g/m2播种，播种时用干净的毛笔粘上孢子粉均匀的播种于泥炭土基质表层；在播种后，待海金沙配子体形成后，每日揭开覆盖在花盆上的玻璃通风1h并喷雾1次。4)日常管理盖上玻璃，维持温度在20～30℃、光照强度为2000～3000lx、光照时间为12h/d或覆盖荫蔽度为75％的遮阴网来控制光照强度，保持土壤湿度在60％～88％，空气湿度为80％～90％的温室中培养；5)壮苗播种第30天开始采用雾喷、薄施的方式施全佳福肥，10天/1次。6)初次移栽待幼孢子体长出2～3个羽片、植株8～14cm高时移栽到营养杯中育苗，育苗基质为园土：泥炭土＝3:1的混合基质。试验例1、最适海金沙孢子萌发温度试验采集带成熟孢子的野生海金沙植株，然后将其放在薄膜上自然阴干，5～7d后待孢子囊裂开，孢子自然散落，将薄膜上的孢子收集起来，用封口袋装封存并保存在5℃的恒温冰箱里备用；温度实验设置为恒温，每个处理重复3次；周期性光照为3000lx；时间为12h/d人工培养箱中分别为20℃、25℃、30℃、35℃，给予恒温周期性光照和恒温全黑8个处理。试验时先在培养皿中铺上两层滤纸，并用蒸馏水浸润滤纸，再将海金沙的孢子均匀地撒在滤纸上，然后放入相应的人工培养箱中，定期利用显微镜观测。结果至第30天测萌发率可知在30℃恒温周期性光照时第8天就开始萌发，发芽率达76.7％；恒温25℃周期性光照条件下第13天开始萌发，发芽率为68.2％；恒温20℃周期性光照条件下第20天开始萌发，发芽率为19.6％；恒温35℃周期性光照条件下第15天开始萌发，发芽率仅为1.5％；在恒温、全黑条件下最好的一组是30℃，也须20天才见其孢子萌发。可见海金沙孢子在相同温度条件下，恒温周期性光照条件下孢子萌发均优于恒温全黑条件下的孢子萌发。可见孢子萌发过程中仍须一定强度的光照。可见海金沙孢子最适合在30℃恒温周期性光照条件下萌发。试验例2、最适海金沙孢子萌发水分试验采集带成熟孢子的野生海金沙植株，然后将其放在薄膜上自然阴干，5～7d后当孢子囊裂开，孢子自然散落，将薄膜上的孢子收集起来，用封口袋装封存并保存在5℃的恒温冰箱里备用；水分试验在周期性光照为3000lx、时间12h/d。温度为30℃的恒温培养箱中培养，利用培养皿将孢子分别播于含水比例为40％、52％、64％、76％、88％、100％的育苗基质：园土＝1:3的配方基质中进行播种。结果当配方基质含水量为88％时，孢子在第12天就开始于基质表面显绿，在21天配子体大量出现，在第50天时第1株幼孢子体苗出现，90天有20％配子体发育成孢子体；基质含水比例在64％～76％之间的孢子萌发情况以含水率76％较好，在22天配子体大量出现，在第80以后天时第1株幼孢子体苗出现，但90天仅有3％配子体发育成孢子体。可见最适合海金沙生长的配方基质含水比例是88％。试验例3、最适海金沙孢子萌发基质试验采集带成熟孢子的野生海金沙植株，然后将其放在薄膜上自然阴干，5～7d后当孢子囊裂开，孢子自然散落，将薄膜上的孢子收集起来，用封口袋装封存并保存在5℃的恒温冰箱里备用；基质处理试验9月播种，在大棚内选用高25cm、直径30cm的花盆育苗；选取高温消毒泥炭土、高温消毒园土、未消毒泥炭土、未消毒园土、未消毒新鲜苔藓等5种不同的基质作为发芽基质。各基质均在表层铺上2～3cm本基质过80目的细基质；铺新鲜苔藓的试验组用园土装盆，表层种上一层新鲜苔藓(不用过筛)。淋透水，然后播种，播种密度为0.5g/㎡。盖上消毒过的玻璃，保持湿度。结果见下表1所示。表1、不同基质中海金沙孢子萌发的情况从上述结果可以看出，在自然温度，玻璃房内不同的土壤中物理性质对海金沙孢子萌发具有显著的影响。在经过90天的繁育后测其各组数据。从上表中可知海金沙孢子在高温消毒过泥炭土基质上播种生长得最好，单位面积中配子体和孢子体最多,可达47.72株/cm2，其中孢子体转化率高达64.2％，单株综合植株生长情况(以单株重比较)最好。试验例4、最适海金沙孢子萌发荫蔽度试验采集带成熟孢子的野生海金沙植株，然后将其放在薄膜上自然阴干，5～7d后当孢子囊裂开，孢子自然散落，将薄膜上的孢子收集起来，用封口袋装封存并保存在5℃的恒温冰箱里备用；荫蔽度试验9月播种，在大棚内用高25cm、直径30cm的花盆育苗。花盆下部装入园土，铺入上部2～3cm过80目筛园土，经高温消毒过的泥炭土。淋透托布津(按说明)覆膜一晚。利用不同密度的遮阴网，分别设置为90％、75％、50％、全光照4种荫蔽度处理。淋透水，然后播种，播种密度为0.5g/㎡，重复3次。再盖上消毒过得玻璃，保持湿度；结果见下表2所示。表2、不同荫蔽度中海金沙孢子萌发情况表由上述结果可以看出：相同自然条件下，经过90天萌发，孢子在荫蔽度为90％时每盆得孢子体数最多；荫蔽度为75％时，单株综合植株生长情况最好。可见孢子在萌芽初期对光照强度需求不大，但发育成优质的孢子体幼苗时对光照还是有一定的需求。试验例5、最适海金沙孢子萌发播种密度试验采集带成熟孢子的野生海金沙植株，然后将其放在薄膜上自然阴干，5～7d后当孢子囊裂开，孢子自然散落，将薄膜上的孢子收集起来，用封口袋装封存并保存在5℃的恒温冰箱里备用；不同播种密度试验9月播种，在花盆下部装入园土，盖上消毒过的玻璃，将其置于大棚内，淋透托布津覆膜一晚。然后上部铺入2～3cm厚的过80目筛的经高温消毒过的泥炭土，淋透水，使其湿度保持在64％～88％，的播种密度播种于上述泥炭土中，盖上消毒过的玻璃，再覆盖荫蔽度为75％的遮阴网，第二天分别按0.0625g/m2、0.125g/m2、0.250g/m2、0.375g/m2、0.500g/m2、1.0/m25种播种密度播种。结果见下表3所示。表3、不同播种密度海金沙孢子萌发情况从上述结果可以看出，1.0g/m230天后霉变严重，几乎全覆灭。其中，播种密度为0.5g/m2得到的孢子体最多3.22株/cm2，但植株综合生长情况却最差单株重0.011g。其次，播种密度为0.375g/m2得到的孢子体1.45株/cm2，但综合植株生长情况却最好，单株重为0.036g。可见，播种密度为0.5g/m2时，海金沙孢子萌发为孢子体的最多，而孢子播种密度为0.375g/m2时单株植株综合生长情况却最好。0.25g/m2单株植株综合生长情况与0.375g/m2相近，因此需得到健壮海金沙幼苗时，可按0.25～0.375/m2来播种繁育。试验例6、最适海金沙孢子萌发施肥试验采集带成熟孢子的野生海金沙植株，然后将其放在薄膜上自然阴干，5～7d后当孢子囊裂开，孢子自然散落，将薄膜上的孢子收集起来，用封口袋装封存并保存在5℃的恒温冰箱里备用；不同肥料试验9月播种，在花盆下部装入园土，盖上消毒过的玻璃，将其置于大棚内，淋透托布津覆膜一晚。然后上部铺入2～3cm厚的过80目筛的经高温消毒过的泥炭土，淋透水，使其湿度保持在64％～88％，的播种密度播种于上述泥炭土中，盖上消毒过的玻璃，再覆盖荫蔽度为75％的遮阴网，按0.5g/㎡播种，于播种第30天开始施肥，10天/1次。分别施作全佳福0.05％、海威施0.05％、复合肥0.05％、ck4种施肥(水施肥)处理。结果结果见下表4。表4、不同施肥海金沙孢子萌发情况不同的肥料对海金沙幼苗具有不同的影响(见表4)。从育苗第30天开始施肥，每10天施肥1次。2个月后测孢子体生长情况。从各施肥组生长情况来看：孢子体最多的是不施肥的对照组(ck)10.72株/cm2，其它得孢子体多少依次为施全佳福9.22株/cm2＞施海威施8.22株/cm2＞施复合肥6.28株/cm2。但从单株综合生长情况来看施肥的比不施肥的要好很多，其它单株重顺序依次为施海威施＞全佳福＞复合肥＞不施肥的对照组施。试验例7、最适海金沙孢子移栽试验采集带成熟孢子的野生海金沙植株，然后将其放在薄膜上自然阴干，5～7d后当孢子囊裂开，孢子自然散落，将薄膜上的孢子收集起来，用封口袋装封存并保存在5±1℃的恒温冰箱里备用；不同大小幼苗移栽试验在玻璃房用高12cm、直径8cm的花盆育苗，分别按配子体(原叶体)和孢子体(1叶、3叶、株高1～2cm、株高2～4cm、株高4～8cm、株高8～14cm)7种处理，重复3次。在播种90天测数据，每小组测30株，研究海金沙幼苗在植株多大条件下移栽的成活率最高。播种在花盆下部装入园土，盖上消毒过的玻璃，将其置于大棚内，淋透托布津覆膜一晚。然后上部铺入2～3cm厚的过80目筛的经高温消毒过的泥炭土，淋透水，使其湿度保持在64％～88％，然后将经培养箱培养后的孢子按0.25～0.375g/m2的播种密度播种于上述泥炭土中，盖上消毒过的玻璃，再覆盖荫蔽度为75％的遮阴网，于播种第30天开始对其施海威施肥，10天/1次。移栽90天后长成8～14cm的孢子体，将其移栽至以质量比为3:1的园土和泥炭土组成的基质中。结果结果见下表5所示：表5、海金沙不同大小幼苗移栽情况从上述结果可以看出，在玻璃房内自然条件下，不同大小的海金沙幼苗移栽后对其后期生长情况具有不同的影响。移栽4个月后测孢子体生长情况(见表5)。从各组生长情况来看：移栽成活率最高的为孢子体8-14cm组，其成活率可达100％；1-2cm、3叶2-4cm、4-8cm这3小组成活率相差不大，均能达到92％以上；1叶组的移栽成活率也可达66.67％；配子体组的移栽成活率最差51.85％。从单株综合生长情况来看也是孢子体8-14cm组＞孢子体4-8cm＞孢子体3叶2-4cm＞孢子体1叶＞1叶＞配子体。可见海金沙移栽成活率与单株综合生长情况成正比，移栽选苗需达到一定大小对其移栽后海金沙成活与生长影响比较大。