超高密度细胞建库方法与流程

相关申请

本申请要求2014年9月18日提交的美国临时申请第62/052,257号的优先权。若允许的话，前述申请通过提述并入本文用于任何及所有目的。

发明背景

细胞建库(cellbanking)广泛用于维持冷冻的、表征的细胞的贮存品(stocks)，其可经解冻用于若干应用，包括生产治疗相关蛋白。通常，冷冻保存的贮存品维持在低密度(例如约1或2x10⁷个细胞/ml)或者经离心而产生更高密度的等分试样用于储藏。较低密度的贮存品不考虑用于高效接种大体积培养物，而浓缩方法可能伤害细胞，因而降低冷冻贮存品的细胞存活率。出于这些原因，先前的细胞建库方法是相对低效的，并最终不被考虑用于从冷冻贮存品快速生产高密度细胞培养物。因此，对于改进细胞建库方法存在需要。

发明概述

本发明提供用于产生超高密度细胞库的改进的方法。在一些实施方案中，本发明的方法采用改进的灌注细胞培养技术，其允许生成超高密度细胞培养物，所述培养物能以出乎预料的高细胞密度被冷冻保存而不需要任何细胞浓缩步骤，同时维持卓越的细胞存活率以供随后在生产细胞培养中使用。

因此，在一个方面，本发明提供一种用于直接从培养的细胞群生产超高密度冷冻细胞库的方法，该方法包括：在灌注生物反应器中培养细胞以获得浓度为至少1.0x10^8个细胞/ml的超高密度细胞群，其中所述灌注生物反应器偶联至细胞贮留系统；以及向该超高密度细胞群添加冷冻保护剂以产生超高密度冷冻细胞库，其中该超高密度冷冻细胞库具有至少1.0x10^8个细胞/ml的浓度，且其中在培养细胞以及向超高密度细胞群添加冷冻保护剂之间未进行额外的浓缩步骤。

在一些实施方案中，细胞贮留系统包含含有过滤器的交替切向流过滤系统。在一些实施方案中，该过滤器具有至少约0.08m²的表面积。在一些实施方案中，该过滤器具有约0.08m²至约0.3m²,约0.3m²至约0.5m²、约0.5m²至约1.0m²、约0.7m²至约0.8m²、约1.0m²至约2.0m²、约2.0m²至约3.0m²、约3.0m²至约4.0m²或约4.0m²至约5.5m²的表面积。在一些实施方案中，该过滤器具有选自下组的孔径：0.2μm、0.4μm和0.65μm。在其他实施方案中，该过滤器具有选自下组的孔径：0.7μm、1.2μm和7μm。

在一些实施方案中，超高密度细胞群具有选自下组的活细胞密度：约1.0x10^8个细胞/ml、约1.1x10^8个细胞/ml、约1.2x10^8个细胞/ml、约1.3x10^8个细胞/ml、约1.4x10^8个细胞/ml、约1.5x10^8个细胞/ml、约1.6x10^8个细胞/ml、约1.7x10^8个细胞/ml、约1.8x10^8个细胞/ml、约1.9x10^8个细胞/ml和约2.0x10^8个细胞/ml。

在一些实施方案中，冷冻保存包括以约5％至约10％,vol/vol的终浓度向超高密度细胞群添加二甲亚砜(dmso)。在一些实施方案中，冷冻保存包括在适于贮存的容器中于冷冻保存条件下冷冻至少一部分超高密度细胞群。

在一些实施方案中，容器是小瓶。在一些实施方案中，超高密度冷冻细胞库包含约4.5x10^8个细胞/小瓶。

在一些实施方案中，容器是冷冻袋。在一些实施方案中，冷冻袋具有约5至约150ml的容积。在一些实施方案中，超高密度冷冻细胞库具有至少约1.0x10^8个细胞/ml的细胞密度。

在一些实施方案中，灌注生物反应器中的灌注速率是约0.02nl/细胞/天至约0.5nl/细胞/天。在一些实施方案中，灌注生物反应器中的灌注速率是每天0至15个反应器容积。

在一些实施方案中，灌注生物反应器细胞培养物具有约6.8至约7.2的ph。

在一些实施方案中，灌注生物反应器细胞培养物具有至少约30％的溶解氧浓度(do)。

在一些实施方案中，生物反应器是挠性袋生物(flexiblebag)反应器。在一些实施方案中，生物反应器包含内置过滤器。

在一些实施方案中，超高密度冷冻细胞库具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％，或至少约95％的解冻后细胞存活率。

在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞选自下组：cho、cho-dbx11、cho-dg44、cho-s、cho-k1、vero、bhk、hela、cos、mdck、hek-293、nih-3t3、w138、bt483、hs578t、htb2、bt20、t47d、ns0、crl7030、hss78bst细胞、per.c6、sp2/0-agl4，以及杂交瘤细胞。在一些实施方案中，所述细胞是转染的细胞。在一些实施方案中，所述细胞表达治疗性蛋白。

在一些实施方案中：灌注生物反应器包含挠性袋生物反应器；所述过滤器具有至少0.3m²的过滤器表面积以及至少50kda的分子量截留(cutoff)(mwco)尺寸；添加至超高密度细胞群的冷冻保护剂为dmso；且该超高密度冷冻细胞库包含约5％至约10％,vol/voldmso。

在一些实施方案中，培养物的ph和do受自动方法所控制。在一些实施方案中，培养物的ph和do受非自动方法所控制。在一些实施方案中，ph和do通过如下任一项或多项所控制：调节引入培养物的气体混合物、调节生物反应器的摇动速率，或调节生物反应器的摇动角度。在一些实施方案中，生物反应器以8°的摇动角度以15rpm摇动。在一些实施方案中，生物反应器以10°的摇动角度以22rpm摇动。在一些实施方案中，生物反应器以12°的摇动角度以25rpm摇动。

在一些实施方案中，超高密度细胞群在添加冷冻保护剂以及分装之前和过程中被冷却至并维持在约4℃的温度。在一些实施方案中，超高密度细胞群在添加冷冻保护剂以及分装期间被维持在约20℃至约26℃的温度。在一些实施方案中，超高密度细胞群在添加冷冻保护剂与分装期间通过使用冰水浴维持在未受控制的低温(uncontrolledcoldtemperature)。

附图简述

图1：是超高密度细胞冷冻建库的图式。

图2：是显示rcho细胞系1的示例性培养物的活细胞密度(细胞/ml)、灌注速率(rv/天)，以及10x细胞比灌注速率(nl/细胞-天)的图。

图3：是显示rcho细胞系1的培养物的离线ph概况的图。

图4a-c：是系列图，其显示rcho细胞系1的5-ml超-hd细胞库等分式样的解冻后细胞生长概况(a)、解冻后晚期凋亡细胞的百分比(b)，和比生产速率(单位/e9细胞-天)。

图5：是显示rcho细胞系2的示例性培养物的活细胞密度(细胞/ml)、灌注速率(rv/天)，和10x细胞比灌注速率(nl/细胞-天)的图。

图6：是显示rcho细胞系2的培养物的离线ph概况的图。

图7：是显示当以0.5x10^6vc/ml接种在250-ml与3-l摇瓶中时，rcho细胞系2以活细胞密度xv(细胞/ml；实线)与存活率(虚线)为基础的细胞生长的图。

图8：是显示当以1.0x10^6vc/ml接种在250-ml与3-l摇瓶中时，rcho细胞系2以活细胞密度xv(细胞/ml；实线)与存活率(虚线)为基础的细胞生长的图。

图9：是显示当以0.5x10^6vc/ml接种在250-ml与3-l摇瓶中时，rcho细胞系2的培养物中的晚期凋亡与死亡细胞百分比的图。

图10：是显示当以1.0x10^6vc/ml接种在250-ml与3-l摇瓶中时，rcho细胞系2的培养物中的晚期凋亡与死亡细胞百分比的图。

图11：是显示当以0.5x10^6vc/ml接种在250-ml与3-l摇瓶中时，rcho细胞系2的摇瓶培养物中的比生产速率(spr)的图。

图12：是显示当以1.0x10^6vc/ml接种在250-ml与3-l摇瓶中时，rcho细胞系2的摇瓶培养物中的比生产速率(spr)的图。

图13：是显示rcho细胞系2基于活细胞密度xv(细胞/ml；实线)与存活率(虚线)的在wave袋中的细胞生长的图。

图14：是显示rcho细胞系2的培养物中的晚期凋亡与死亡细胞的百分比的图。

图15：是显示rcho细胞系3的示例性培养物中的活细胞密度(细胞/ml)、灌注速率(rv/天)，以及10x细胞比灌注速率(nl/细胞-天)的图。

图16：是显示rcho细胞系3的培养物中的离线ph概况的图。

图17a-c：是系列图，其显示：rcho细胞系3的烧瓶培养物中的(a)细胞生长(实线)与存活率(虚线)；(b)晚期凋亡与死亡细胞的百分比；和(c)比生产率(spr)。

图18：是比较rcho细胞系3的示例性培养物中采用内部培养基(黑色)与cdcho培养基(灰色)的活细胞密度(细胞/ml，实线)与存活率(虚线)的图。

图19：是比较rcho细胞系3的示例性培养物中采用内部培养基(黑色)与cdcho培养基(灰色)的灌注速率(圆形，实线)与细胞比灌注速率(三角形，虚线)的图。

图20：是比较rcho细胞系1的示例性培养物中采用补充有efficientfeedb的cdcho培养基(黑色)与cdcho培养基(灰色)的活细胞密度(细胞/ml，实线)与存活率(虚线)的图。

图21：是比较rcho细胞系1的示例性培养物中采用补充有efficientfeedb的cdcho培养基(黑色)与cdcho培养基(灰色)的灌注速率(圆形，实线)与细胞比灌注速率(三角形，虚线)的图。

图22：是显示rcho细胞系3的示例性培养物中采用20-lwave生物反应器(10-l工作容积，黑色)及10-lwave生物反应器(5-l工作容积，灰色)的活细胞密度(细胞/ml，实线)及存活率(虚线)的图。

发明详述

本发明提供一种超高密度细胞冷冻建库方法，其包括使用连接至非离心细胞贮留装置的灌注培养系统。

i.定义

如本文所用，术语“分批培养”意指一种细胞培养技术，其中用快速进入对数生长期的细胞接种一定量的新鲜培养基且其中培养的生长培养基未被连续去除并更换为新鲜培养基。

如本文所用，术语“补料分批培养”意指一种细胞培养技术，其中最初用细胞接种一定量的新鲜培养基，并且培养终止前在有或没有定期细胞和/或产物收获的情况下，于培养过程期间将额外的培养营养物质送料(连续或不连续渐增)至培养物。

如本文所用，术语“灌注培养”意指一种细胞培养技术，其中用快速进入对数生长期(如上)的细胞接种一定量的新鲜培养基且其中从培养物连续去除生长培养基并更换为新鲜培养基。

如本文所用，术语“生物反应器”应意指用于培养细胞的容器。

在一个实施方案中，该生物反应器是“挠性袋生物反应器”。“挠性袋生物反应器”是一种能够容纳液体培养基以及细胞接种物的无菌腔室，其额外包含连接器、接口、转接器以及挠性管路。在一个实施方案中，该腔室由塑料制成。在一个具体实施方案中，该腔室是由多层叠压的透明塑料制成。在进一步的具体实施方案中，该腔室由多层叠压的透明塑料制成且具有由usp第vi级乙烯乙酸乙烯酯/低密度聚乙烯共聚物制成的流体接触层，而外层由低密度聚乙烯制成。

另外，连接器、接口以及转接器可由任一类塑料制成，塑料包括但不限于：聚乙烯、聚丙烯以及聚碳酸酯，而管路可由任一类塑料构成，所述塑料包括但不限于：热塑性弹性体或硅酮(例如铂硬化(platinum-cured)硅酮)。

适当的挠性袋生物反应器是本领域中普遍可见的，且包括但不限于描述于美国专利no.6,544,788中那些，其在此通过提述以其整体并入本文。

该挠性袋生物反应器可部分填充有培养基然后膨胀至坚硬。之后可放置在摇动台(如gelifesciences的base20/50eht摇动单元)上，该摇动台以预设摇动角度和预设摇动速率前后移动。该摇动运动包括培养基的波浪式运动，促使搅动与氧传输从而改进细胞培养物的性能。所述预设摇动角度可以是至少约4度，例如约4度、5度、6度、7度、8度、9度、10度、11度或12度。另外，所述预设摇动速率可设定为如下的每分钟摇动速率(rpm)：至少约6rpm、例如约6rpm，约7rpm、8rpm、9rpm、10rpm、11rpm、12rpm、13rpm、14rpm、15rpm、16rpm、17rpm、18rpm、19rpm、20rpm、21rpm、22rpm、23rpm、24rpm、25rpm、26rpm、27rpm、28rpm、29rpm、30rpm、31rpm、32rpm、33rpm、34rpm、35rpm、36rpm、37rpm、38rpm、39rpm或40rpm。在一个具体实施方案中，每分钟的摇动速率为约22rpm。

如本文所用，术语“细胞贮留系统”意指所有能够通过使用过滤器将细胞从培养基及其中的废弃产物分开的装置。过滤器可包括膜、陶瓷或金属过滤器，呈任何形状，包括螺形旋绕、管状或片状。过滤器可具有不同表面积。例如，过滤器表面积可以是约0.08m²至约5.5m²，例如约0.08m²、0.09m²、0.1m²、0.2m²、0.3m²、0.4m²、0.5m²、0.6m²、0.7m²、0.77m²、0.8m²、0.9m²、1.0m²、1.1m²、1.2m²、1.3m²、1.4m²、1.5m²、1.6m²、1.7m²、1.8m²、1.9m²、2.0m²、2.1m²、2.2m²、2.3m²、2.4m²、2.5m²、2.6m²、2.7m²、2.8m²、2.9m²、3.0m²、3.1m²、3.2m²、3.3m²、3.4m²、3.5m²、3.6m²、3.7m²、3.8m²、3.9m²、4.0m²、4.1m²、4.2m²、4.3m²、4.4m²、4.5m²、4.6m²、4.7m²、4.8m²、4.9m²、5.0m²、5.1m²、5.2m²、5.3m²、5.4m²或5.5m²。在一些实施方案中，过滤器模块具有约10千道尔顿(kda)至约100kda的分子量截留(mwco)尺寸，例如其是约10kda、20kda、30kda、40kda、50kda、60kda、70kda、80kda、90kda或100kda。在其他实施方案中，过滤器模块具有约0.1μm至约7μm的筛目，例如约0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm、3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm、4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm、4.5μm、4.6μm、4.7μm、4.8μm、4.9μm、5.0μm、5.1μm、5.2μm、5.3μm、5.4μm、5.5μm、5.6μm、5.7μm、5.8μm、5.9μm、6.0μm、6.1μm、6.2μm、6.3μm、6.4μm、6.5μm、6.6μm、6.7μm、6.8μm、6.9μm或7.0μm。

如本文所用，术语“冷冻保存”意指一种方法，通过所述方法通过冷却并储存于零度以下温度来保存易受由时间或由酶活性或化学活性引起的损伤的细胞、组织或任何其他物质。

如本文所用，术语“冷冻建库”意指将细胞与冷冻保护剂(例如伴有或没有羟乙基淀粉(hes)的dmso)混合并在冷冻保存的条件下置于适于储存的容器中的技术。这些容器随后使用本领域已知技术加以冷冻并储存在低温，通常是约-130℃至约-196℃。通过该方法获得的细胞集合为细胞库。

在一个实施方案中，细胞库是超高密度细胞库。如本文所用，术语“超高密度细胞库”应意指以超高密度冷冻的冷冻建库的细胞等分试样，其中密度为至少约1x10^8个活细胞/ml、例如约1x10^8个活细胞/ml、约1.1x10^8个活细胞/ml、约1.2x10^8个活细胞/ml、约1.3x10^8个活细胞/ml、约1.4x10^8个活细胞/ml、约1.5x10^8个活细胞/ml、约1.6x10^8个活细胞/ml、约1.7x10^8个活细胞/ml、约1.8x10^8个活细胞/ml、约1.9x10^8个活细胞/ml、约2x10^8个活细胞/ml、约3x10^8个活细胞/ml、约4x10^8个活细胞/ml或约5x10^8个活细胞/ml。细胞可以根据本领域可用的任何方法并在任何适于储存的容器中于冷冻保存条件下加以冷冻。

在另一个实施方案中，细胞库是主细胞库(mastercellbank)。如本文所用，术语“主细胞库”应意指细胞(例如经充分表征的细胞)的培养物，其自单克隆长成、分装至储存容器(例如在单一操作中分装至容器)中，并且如上述储存在冷冻保存条件下。在一些实施方案中，所述细胞适于稍后用于生产细胞培养物并进一步收获由此生产的治疗相关蛋白。

在另一个实施方案中，该细胞库是工作细胞库。如本文所用，术语“工作细胞库”应意指一种细胞(例如经充分表征的细胞)的培养物，其自单个小瓶的主细胞库长成或自两个汇集小瓶的主细胞库长成、分装至储存容器(例如在单一操作中分装至容器)中，并且如上文所述储存在冷冻保存条件下。在一些实施方案中，所述细胞适于稍后用于生产细胞培养物并进一步收获由此生产的治疗相关蛋白。

在另一个实施方案中，细胞库是微型细胞库。如本文所用，术语“微型库”应意指细胞等分试样，其已依据“冷冻建库”程序(如上文所述)冷冻保存但由比正常用于建立一个细胞库所用更少的样本组成。这类型的库通常用于在建立细胞库(如“主细胞库”)之前优化被考虑用来冷冻保存细胞系的条件。例如，用“微型库”来确定本发明中所述的超高密度细胞建库程序的最佳细胞密度。

如本文所用，术语“适于储存在冷冻保存条件下的容器”包括任一种可在适于细胞在约-130℃至约-196℃储存的条件下使用的容器。这些容器包括但不限于由适于冷冻保存的材料制成的小瓶。这些材料包括聚合物(例如聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯)。此外，表面处理可施用至冷冻保存小瓶的表面，以改进冷冻保存条件(例如亲水性涂层，其降低吸附与变性)。在示例性实施方案中，小瓶可具有超过约0.1ml的容积，例如小瓶可具有约0.1ml、约0.5ml、约0.75ml、约1ml、约1.5ml、约2ml、约2.5ml、约4.5ml、约10ml、约15ml、约20ml、约25ml或约50ml的容积。容器也可以是冷冻袋，其可具有约30ml、约50ml、约100ml、约150ml、约200ml、约300ml、约400ml或约500ml的容积。

如本文所用，术语“冷冻袋”是能够容纳液体培养基的无菌腔室，适于约-130℃至约-196℃的细胞储存，且可额外包含连接器、接口、转接器以及挠性管路。该冷冻袋可由任何适当材料所构成，包括但不限于聚合物，如聚四氟乙烯(ptfe)、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、氟化乙烯丙烯(fep)、聚烯烃及乙烯乙酸乙烯酯(eva)。示例性冷冻袋包括但不限于：冷冻建库袋(saint-gobain)、permalife^tm袋(origenbiomedical)、cryostore冷冻袋(origenbiomedical)freeze-pak^tm生物容器(chartermedical)，以及美国临时申请no.62/037,181(merialltd.，一个sanofi的公司)中公开的袋，其通过提述以其整体并入本文。在一些实施方案中，冷冻袋可维持密封期的细胞建库系统(例如通过使用至少两个无菌可焊导管，其允许袋的“密封系统”填充)。

如本文所用，术语“摇瓶”应意指用作为培养烧瓶的容器，其中在温育期间持续地搅动培养基与细胞培养物。

如本文所用，术语“摇瓶种培养(shakeflaskseedtrain)”应意指一种细胞扩增的方法，其中细胞等分试样首先培养(接种)于摇瓶中并在其中生长。依据细胞的生长速率来培养细胞并且通常在其生长期间分装至较大和/或多个容器，直到生物量达到足以接种生物反应器的水平。

如本文所用，术语“接种密度”应意指接种烧瓶或生物反应器的初始细胞密度。

如本文所用，术语“治疗相关蛋白”应意指任一种可用于创建对疾病或病症的治疗或用于在动物(包括哺乳动物，如小鼠、大鼠、猴、猿及人)中治疗疾病或病症的蛋白。这些蛋白可包括但不限于结合多肽如单克隆抗体、fc融合蛋白、抗凝血剂、血液因子、骨形态生成蛋白、工程化的蛋白骨架、酶、生长因子、激素、干扰素、白细胞介素及溶栓剂。

如本文所用，术语“结合多肽”或“结合多肽”应意指含有至少一个结合位点的多肽(例如抗体)，所述结合位点负责选择性结合至目的靶抗原(例如人抗原)。示例性结合位点包括抗体可变域、受体的配体结合位点或配体的受体结合位点。在一些方面，结合多肽包含多个(例如两个、三个、四个或更多个)结合位点。

如本文所用，术语“抗体”意指这样的装配物(例如完整抗体分子、抗体片段或其变体)，其对目的抗原(例如肿瘤相关抗原)具有显著的已知的特异性免疫反应活性。抗体及免疫球蛋白包含轻链与重链，其间有或没有链间共价键连。在脊椎动物系统中，基础免疫球蛋白结构是得到相对充分了解的。

上位术语“抗体”包含五个不同类型的能够在生物化学上加以区分的抗体。所有五类抗体明显落在本发明范围内，下文讨论大体上是针对igg类的免疫球蛋白分子。关于igg，免疫球蛋白包含两个分子量大约23,000道尔顿的相同轻链，以及两个分子量53,000-70,000的相同重链。四个链通过二硫键以“y”构型连结，其中轻链在“y”开口处起撑托重链并且连续通过可变区。

如本文所用，术语“溶解氧”或“do”是以饱和空气为基准，存在于给定液体(诸如细胞培养基)中的溶解的氧气的百分比。

如本文所用，术语“细胞比灌注速率”(cspr)应意指将细胞培养基送料至细胞培养物的速率，表示为每天每个活细胞添加的培养基体积(ozturk,ss.engineeringchallengesinhighdensityculturesystems.cytotechnology.1996；22:3-16)。

如本文所用，术语“约”应意指某一个定值周围10％的容差范围。因此，当术语“约”用来修饰某个定值时，所指范围应包括该定值的±0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％内的任一数字。

ii.灌注细胞培养

传统细胞培养涉及“分批”培养工艺。在这类的培养中，用快速进入对数生长期的细胞接种一定量的新鲜培养基。随着这些细胞生长并分裂，它们消耗可获得自培养基的营养并且分泌有害废弃产物。随着时间经过，培养物会进入停滞生长期(stationarygrowthphase)，并最终进入衰退期。尽管对“分批”培养工艺的修改可使其随着时间更有效率，但所产生的修改的分批培养方案仍然会导致快速生长与衰退循环。此外，“分批”培养工艺对于达到允许高密度细胞建库所需的细胞密度水平的能力有限。

“补料分批”培养工艺意指在传统“分批”培养技术的基础上进一步改进的细胞培养技术。尽管这种工艺允许更高细胞密度生长，但其允许高密度细胞培养物的高效生长以及因此高效地产生用于高密度细胞建库的细胞的能力仍是有限的。

在优选的实施方案中，本发明采用灌注培养工艺。灌注培养是一种培养细胞的方法，其中用快速进入对数生长期(如上)的细胞接种一定量的新鲜培养基且其中从培养物连续地去除生长培养基并更换成新鲜培养基。以此，培养物持续地接收具有高营养物水平的新鲜培养基，同时去除含有废弃产物与较低营养物水平的培养基。此类培养允许维持细胞对数生长，其中至少每天交换一半的培养物体积且细胞密度可比传统或经改良的分批培养所达到的细胞密度高得多(增加2倍至超过10倍)。在本发明的一个实施方案中，细胞比灌注速率(cspr)可以是约0.02nl细胞^-1天^-1至约0.5nl细胞^-1天^-1，例如其可以是约0.02nl细胞^-1天^-1、0.025nl细胞^-1天^-1、0.05nl细胞^-1天^-1、0.1nl细胞^-1天^-1、0.2nl细胞^-1天^-1、0.3nl细胞^-1天^-1、0.4nl细胞^-1天^-1或0.5nl细胞^-1天^-1。在本发明的另一个实施方案中，灌注速率可以按每天的反应器容积测量且可以是每天0至15个反应器容积，例如其可以是每天约0个反应器容积、每天约0.5个反应器容积、每天约1个反应器容积、每天约2个反应器容积、每天约3个反应器容积、每天约4个反应器容积、每天约5个反应器容积、每天约6个反应器容积、每天约7个反应器容积、每天约8个反应器容积、每天约9个反应器容积、每天约10个反应器容积、每天约11个反应器容积、每天约12个反应器容积、每天约13个反应器容积、每天约14个反应器容积，或每天约15个反应器容积。在一个具体实施方案中，灌注培养可以在生物反应器中以最少一个液浸管(diptube)来进行。

在一些实施方案中，可以调节培养物的ph、温度、溶解氧浓度(do)和渗透压以最大化培养物健康及产量。控制培养物do和ph的一个方法是通过自动反馈控制器。此类的自动控制器使用基于微处理器的计算机进行操作，以监控和调整培养物的ph与do，由此维持最佳的细胞生长条件。但是，这些自动反馈控制系统是昂贵的。因此，在一些实施方案中，可采用非自动方法控制这些参数。在一个示例性方法中，可使用如下任一项来控制选定参数(例如ph或do)：调节培养物上的气体混合物流动、调节摇动速率，或调节培养物的摇动角度。在一些实施方案中，可采用自动反馈控制和非自动控制二者。

在一个实施方案中，二氧化碳气体的起始水平是约10％而氧气的起始水平是约20％，且气流速率为每分钟约0.2升(lpm)。若ph不超过约6.9，则co2设定点可从10％降低至5％。若ph在之后的时间点仍不超过约6.9，则co2设定点可进一步从5％降低至0％。若ph仍不超过约6.9，则可增加灌注速率。若do不超过约45％，则o2设定点应从20％提高至30％。若do在之后的时间点不超过约45％，则o2水平应从30％提高至40％，摇动速度应增加至约25rpm，且摇动角度应改成12°。

i.细胞培养基

本发明方法中可使用适于培养细胞的任一类型的细胞培养基。关于选择适当细胞培养基的指导是本领域已知的并且提供于例如freshney,r.i.cultureofanimalcells(基本技术手册),2000第4版,wiley-liss的第8与9章；以及doyle,a.,griffiths,j.b.,newell,d.g.cell&tissueculture:laboratoryprocedures1993,johnwiley&sons中。这些参考文献各自以整体并入本文。本领域有更多在无动物来源组分并且无蛋白质条件下用于制备并维持细胞培养的方法(包括关于cho细胞的方法)，如国际专利申请no.wo97/05240、no.wo96/26266和no.wo00/11102以及美国专利no.6,100,061、no.6,475,725和8,084,252中所见的那些。前述文件各自通过提述以其整体并入本文。在本发明的一个实施方案中，可使用无动物来源组分(adc)的培养基。常规合成的基本培养基(minimalmedia)可含有无机盐、氨基酸、维生素、糖源和水。在本发明的一个具体实施方案中，可使用的培养基是cd-cho(gibco,invitrogencorp.；无动物来源培养基，其是化学上限定的且不含未知来源的蛋白质、水解产物或组分)。此外，培养基可具有额外组分，包括谷氨酰胺和/或氨甲蝶呤或其他可能有助于生长或附着的因子。在一个具体实施方案中，额外组分可以是glutamax-1或l-谷氨酰胺，其以2mm至约8mm，例如约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm或约8mm添加。

ii.宿主细胞及表达载体

在一些实施方案中，在本发明细胞建库工艺中采用的细胞是带有表达构建体用以表达治疗相关蛋白或其他目的多肽的宿主细胞。依据本文所述方法可使用可用来表达目的多肽(例如结合多肽)的任何细胞。细胞可任选地含有天然存在或重组核酸序列，例如编码目的多肽的表达载体。表达载体可任选地含有适当的转录和翻译控制并且可以使用本领域已知的重组dna技术来构建。表达载体可以通过本领域已知的技术转移至任何宿主细胞，而转化的细胞随后可根据本发明方法进行培养而产生高密度细胞库。此外，高密度细胞库随后可根据本领域已知技术进行解冻并培养，以生产目的编码蛋白，若需要的话，该蛋白可随后进行纯化。

在一些实施方案中，可使用各种宿主表达系统来生产治疗相关蛋白。此外，宿主表达系统可以是哺乳动物细胞系统(例如cho、cho-dbx11、cho-dg44、cho-s、cho-k1、vero、bhk、hela、cos、mdck、hek-293、nih-3t3、w138、bt483、hs578t、htb2、bt20、t47d、ns0、crl7030、hss78bst细胞、per.c6、sp2/0-agl4和杂交瘤细胞)，其带有包含来源于哺乳动物细胞基因组的启动子的重组表达构建体。关于哺乳动物细胞，也可以采用基于病毒的表达系统(参见例如logan等，1984,proc.natl.acad.sci.usa8:355-359,其通过提述以其整体并入本文)。可以通过纳入包括(但不限于)适当转录增强子元件及转录终止子在内的元件来增强表达效率(参见例如bittner等,1987,methodsinenzymol.153:516-544，其通过提述以其整体并入本文)。

在其他实施方案中，可以选择调节插入序列表达或修饰并加工基因产物呈特定所需形式的宿主细胞系。不同宿主细胞对翻译后加工和蛋白及基因产物修饰具有特征和特异性的机制。可选定适当细胞系或宿主系统以确保所表达的多肽(例如结合多肽)的正确修饰和加工。此类细胞包括例如已建立的哺乳动物细胞系及动物细胞，以及昆虫细胞系、真菌细胞与酵母菌细胞。

iii.生物反应器

任何适用于在灌注培养条件下培养细胞的生物反应器均可用于本发明的方法。可使用细胞的等分试样以适当接种密度来接种生物反应器(如细胞小瓶或来自起始培养物的细胞，例如培养至那个密度的摇瓶或摇瓶种培养)。培养物的适当接种密度取决于数个因素，包括所用细胞以及待接种生物反应器的类型。适当的接种密度可以用本领域可用的方法来确定。

在一些实施方案中，生物反应器可以是一次性的，例如生物反应器可以是通过挠性管路方式连接至细胞贮留装置的挠性袋或塑料瓶。设计可包括，但不必然包括入口导管以及出口或接种导管，其被无菌焊接或连结至真核细胞的来源。在一些实施方案中，生物反应器具有至少约1l的容积，例如约1l、2l、5l、10l、20l、50l、75l、85l、100l、150l或400l。在本发明的一个具体实施方案中，生物反应器为10l挠性袋，其经定制而具有一个或两个用以去除培养基或产物的液浸管(diptube)。示例性的一次性生物反应器为细胞袋生物反应器(gehealthcare,pittsburgh,pa)，如20l生物反应器。这些是灌注生物反应器系统，其描述于如下及其他文件中：singh,1999,disposablebioreactorforcellcultureusingwave-inducedagitation,cytotechnology,p.149-158，其通过提述以其并入本文。

生物反应器的工作容积是培养物所占容积。工作容积可以是例如培养物的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更高，但优选不超过约75％。

或者，生物反应器可以是非一次性式。例如，生物反应器可以由不锈钢或玻璃制成。适用于本发明的可供选择的生物反应器包括但不限于：可通过摇动、震荡或搅拌而混合的摇瓶、搅拌槽容器、气升式(airlift)容器和一次性袋。

在一个实施方案中，生物反应器可偶联至细胞贮留系统，包括但不限于内置过滤器、旋转篮、切向流过滤(tff)系统和交替切向流过滤(atf)系统。

iii.细胞贮存

灌注培养取决于从培养物去除营养耗竭且含有废弃产物的培养基，同时将对细胞的损害减至最低的能力。将耗竭培养基与培养细胞分离的细胞贮存起始方法通常会因为例如产生剪切力而损害细胞。这样的细胞损害导致过滤器堵塞和灌注装置故障，这其中许多是培养系统内部的。因此，在一个方面，本发明提供一种利用允许培养基更换的“细胞贮留系统”的方法。

在一个实施方案中，所用的细胞贮留系统的类型是“内置”型过滤器，其中过滤器设置在生物反应器的腔室中并且可在腔室内自由移动。过滤器可与引出腔室的管路之一偶联，从而允许从培养物抽离过滤的培养基。“内置”型过滤器的一个实例可见于美国专利no.6,544,788，其通过提述以其整体并入本文。

在另一个实施方案中，所用细胞贮留系统是切向流过滤系统(tff)。在tff系统中，通过附接至过滤模块与培养容器之间产生贯穿过滤器模块的切向流的管路的泵的方式，从培养容器经过滤模块循环培养基，然后回到培养容器。第二个泵位于过滤器模块的过滤侧并用于控制去除滤液的速率。在此系统中优选使用中空纤维膜过滤器，因为它们易于灭菌且允许维持均匀流动通过过滤器模块。但是，若在此系统中采用中空纤维过滤器，则它们容易堵塞，这是因为单向流造成在腔入口处有颗粒物质聚集。

在一个具体实施方案中，所用细胞贮留系统的类型是交替切向流(atf)系统。在atf型细胞贮留系统中，过滤隔室在一端连接至储存容器而在另一端连接至隔膜泵。泵首先将培养基从容器移动经过过滤元件至泵，然后逆向将培养基从泵经过过滤器送回到容器中，产生双向或交替流。这称为交替切向流(atf)，因为在过滤器模块处有交替切向流，即一个流与过滤器模块的膜表面同方向(与该表面切向)，而有另一个流基本上垂直于那些表面。这种类型的过滤自2000年起出现于文献中，且产生快速、低剪切力、均匀流。atf过滤可以通过本领域已知的方法获得，如美国专利第6,544,424号中所述，其通过提述以其整体并入本文。此外，交替切向流系统可在商业上购自如refinetechnology的制造商，并包括多种模块，如atf2、atf4、atf6、atf8和atf10系统。

在本发明的另一个具体实施方案中，过滤器是管膜过滤器，而另外可以是中空纤维过滤器。

如上文所指，本发明方法允许细胞高效地生长至超高密度。在本发明的一个具体实施方案中，培养物生长到至少约1x10^8个细胞/ml的密度，例如到约1x10^8个细胞/ml、约1.1x10^8个细胞/ml、约1.2x10^8个细胞/ml、约1.3x10^8个细胞/ml、约1.4x10^8个细胞/ml、约1.5x10^8个细胞/ml、约1.6x10^8个细胞/ml、约1.7x10^8个细胞/ml、约1.8x10^8个细胞/ml、约1.9x10^8个细胞/ml或约2x10^8个细胞/ml。培养物生长至这些高浓度允许立即冷冻保存高密度贮存品而不需要通过离心或非离心方法进一步浓缩细胞群。

iv.冷冻保存及细胞建库

冷冻保存意指容易因时间或因酶或化学活性而受损的细胞、组织或任何其他物质通过冷却并储存在零度以下温度而保存的过程。冷冻保存重要细胞系的重要性不可低估，因为(除其他重要益处外)这允许维持这些细胞系而不需要将它们维持在恒定培养，降低污染风险，并且减少遗传漂变风险。

在使用冷冻保存方法时，达到并维持在这些低温且不在冷冻过程期间形成冰而造成额外损伤是至关重要的。本领域的方法习惯使用降低对细胞的冷冻损伤的物质，称为冷冻保护剂。冷冻保护剂可以在冷冻过程之前添加至细胞培养基。在一个具体实施方案中，所用冷冻保护剂可以是如下一项或多项：甘油或二甲亚砜(dmso)。此外，冷冻保护剂可以在有或没有羟乙基淀粉(hes)的存在下添加。在又一个具体实施方案中，dmso可以至少约5％的浓度添加，例如其可以约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％，或以约20％的浓度添加。

随后可以将添加有冷冻保护剂的培养物在冷冻保存条件下分装至适于储存的容器中。在一个实施方案中，此容器可以是由包括(但不限于)聚合物(如聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯)的材料制成的小瓶。在一个具体实施方案中，小瓶可以具有额外的表面处理以改进冷冻保存条件(例如亲水性涂层，其降低吸附与变性)。在示例性实施方案中，小瓶可具有超过约0.1ml的容积，例如小瓶可具有约0.1ml、约0.5ml、约0.75ml、约1ml、约1.5ml、约2ml、约2.5ml、约4.5ml、约10ml、约15ml、约20ml、约25ml，或约50ml的容积。在另一个实施方案中，容器也可以是冷冻袋，其具有超过约30ml的容积，例如冷冻袋可具有约30ml、约50ml、约100ml、约150ml、约200ml、约300ml、约400ml，或约500ml的容积。冷冻袋可由任何适当材料制成，包括但不限于聚合物，如聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、氟化乙烯丙烯(fep)、聚烯烃及乙烯乙酸乙烯酯(eva)。示例性一次性生物反应器包括但不限于：冷冻保存袋、permalife^tm袋(origenbiomedical)、cryostore冷冻袋(origenbiomedical)、freeze-pak^tm生物容器(chartermedical)，以及美国临时申请no.62/037,181(merialltd.,一个sanofi的公司)中公开的袋，其通过提述以其整体并入本文。

这些容器随后用本领域已知的技术及装置进行冷冻，然后储存于低温，通常是约-130℃至约-196℃。在一个实施方案中，所用冷冻技术可以是控制速率及缓慢冷冻(也称为缓慢程控冷冻，或spf)。通过这个方法获得的细胞集合为细胞库。

在一个实施方案中，细胞库可以是，但不限于超高密度细胞库、主细胞库、工作细胞库或微型库。

v.确定细胞存活率

如上所述，本发明方法允许以高密度进行细胞建库，同时维持优良的细胞存活率供后续使用。如本文所用，术语“细胞存活率”可定义为给定样品中的健康细胞的数目或百分比。细胞存活率可以使用本领域任何可用方法在所述超高密度细胞建库方法中的任意时间点处确定。确定细胞存活率的常用方法大多是基于如下原理：活细胞具有完整细胞膜，其排除特定染料，如台盼蓝(一种重氮染料)、伊红或丙啶，而死细胞不会。

在一个实施方案中，台盼蓝可用于将一定量的细胞染色并由此示出具有完整细胞膜(未染色)的细胞的存在以及具有破裂膜的细胞的存在(蓝色)。然后对这些细胞进行计数以确定培养物中的活细胞与死细胞数目，并且表示为百分比来指明培养物的相对健康状况。

在一个具体实施方案中，细胞存活率可以使用已生长至超高密度，但尚未冷冻的培养物(即冷冻前或解冻前培养物)来测定。在一个具体实施方案中，细胞存活率可以使用已冷冻且之后解冻的培养物(即冷冻后或解冻后培养物)来确定。

在一个具体实施方案中，细胞存活率是至少约60％，例如约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％，或约95％。在一些实施方案中，细胞的解冻后存活率是至少约80％，例如是至少约85％、90％，或95％，包括多至100％。

vi.治疗相关蛋白

来源于本发明的超高密度细胞冷冻建库方法的细胞可用于在稍后生产阶段中用于制造蛋白质。例如，根据本发明的方法在生物反应器中增殖并以高密度库等分试样冷冻的细胞可用于生产生物物质，包括治疗相关蛋白。这些生物物质可包括但不限于：病毒(参见例如wo200138362)、结合多肽(如抗体，例如单克隆抗体及其片段，例如fab片段)；fc融合蛋白、抗凝血剂、血液因子、骨形成蛋白、工程化的蛋白骨架、酶、生长因子、激素、干扰素、白细胞介素及溶栓剂。这些生物物质可以使用本领域可用的任何方法来收获。在一个实施方案中，本发明提供生产生物物质的方法，该方法包含：培养能够在适于生产生物物质的条件下表达生物物质的细胞，其中所述细胞获取自使用灌注培养产生的高超密度冷冻细胞库。生物物质可以是(但不限于)蛋白质(例如任何治疗相关蛋白)。

实施例

本发明通过如下实施例来进一步说明，所述实例不应被视为进一步限制。在本申请全文中引用的附图与所有参考文献、专利及公开的专利申请的内容清楚地通过提述以其整体并入本文。

实施例1：通用方法

下列条件对于如下实施例3-6中所述实验是通用的。

ph设定点为7.0±0.1。经由自动反馈控制，通过wavepod控制器将培养物的ph维持在设定点。自动控制器改变至顶部空间的气体中的co2浓度并进一步调节添加的碱(co2/碱控制策略)。若控制器检测到ph低于选定ph设定点，则首先尝试通过降低co2水平来达到设定ph值。若未在指定时间内达到要求的ph水平，则添加碱。在高于选定ph设定点的ph处，增加co2浓度。

do(溶解氧)设定点为≥40％。经由自动反馈控制，通过wavepod控制器将培养物的do维持在设定点。氧浓度自动由21％变成50％(o2浓度控制策略)。手动供应额外纯氧至顶部空间并结合手动调节至摇动条件以维持do≥40％。具体来说，当在线do约为40％，且来自pod控制器的o2浓度从21％增加至>30％时，则将波摇动速度与角度从22rpm/10°增加至25rpm/12°。若podo2又变成>30％，则将波摇动速度与角度从25rpm/12°增加至30rpm/12°，或供应纯o2至顶部空间(优选为后者)。最终，逐渐增加气体中的纯o2体积百分比以提高至顶部空间的总o2。通过调节pod氧气(21％-50％，由pod控制器供应)以及额外纯氧气(100％，由转子流量计(rotameter)控制)之间的体积控制比，手动添加策略导致每天增加约10％。略微增加总气流速率以促使气体转移。

基于测量的细胞密度，通过增加每日灌注速率，培养物的cspr(细胞比灌注速率)维持在几乎恒定。

实施例2：超高密度细胞建库方案的设计及实施

此超高密度细胞冷冻建库方案始于2-ml主细胞库小瓶(工作容积1.5ml)的细胞，呈大约2.0-2.4x10^7个活细胞/ml的密度(正常细胞冷冻保存条件)。随后，使细胞在灌注培养物中生长。在将dmso添加至细胞培养物之后，将该超高密度细胞培养物分装至单独的适于冷冻保存与储存的5-ml小瓶(约4.5ml工作容积)或冷冻袋(约100ml工作容积)中作为超高密度细胞库(至少约10x10^7个细胞/ml)。此方案的示意图显示于图1中。

实施例3：使用rcho1的超高密度细胞培养以及细胞库性能

以下实验使用的参数如下：

1)当xv≥约3×10⁷个活细胞/ml(vc/ml)(在第9天)，则co2降低至0％，随后若需要的话添加碱；

2)wave摇动速度&角度：初始22rpm/10°(自第0天至第8天)；当podo2从21％增加至>30％(在第8天)，则增加至25rpm/12°，且随后增加至30rpm/12°(在第9天)以促进气体转移(供给o2并去除co2)；

3)额外的纯o2(100％)：当podo2>30％且xv≥约6×10⁷vc/ml(在第11天)，则手动供应至顶部空间；

4)总气流速率：自第0天至第10天0.2lpm(升每分钟)，当xv>4×10⁷vc/ml，则在第10天增加至0.4lpm，且随后在第11天增加至约0.5lpm(podo2：纯o2＝3:1，总o2：约62％)；及

5)细胞比灌注速率：初始目标为≥约0.2nl/细胞-天；灌注速率逐步增加至多达12rv/天(注记：rv定义为反应器容积)。最终日的cspr为0.1nl/细胞-天至0.2nl/细胞-天。

6)种培养及生物反应器培养基：具有4mml-谷氨酰胺的cdcho

7)生物反应器：ge定制10-lcellbag灌注生物反应器，其具有两个液浸管；工作容积5l；

8)生物反应器接种物：摇瓶种培养；接种密度：约5×10⁵vc/ml

9)细胞贮留方法：atf4(0.2μm孔径)

10)细胞培养物的温度：37℃

11)冷冻降温(freezedown)：cryomed^tm控制速率冷冻仪

测试了rcho细胞系1的超高密度(uhd)细胞培养以及细胞库性能(冷冻与解冻后)。灌注培养在第12天达到约1.11×10⁸vc/ml的xv，具有高存活率(整个过程>97％)。超高密度灌注培养物的活细胞密度(细胞/ml)、以反应器容积/天计的灌注速率，以及10xcspr(10x细胞比灌注速率，以nl/细胞-天计)显示于图2中。图3显示培养物的离线ph概况。在未浓缩的情况下直接收获培养物，从而在两个dmso维持温度于5-ml小瓶中产生两个uhd库：充分控制的低温，其使用4℃夹套旋转器；以及非控制的(non-controlled)低温，其使用由冰水浴降温的旋转器。图4a-c显示从前述细胞培养条件产生的5mluhd小瓶的冷冻后性能。两种uhd库均具有快速的冷冻后细胞生长，非常高的存活率，与低凋亡率。但是，当与在冰水浴中较被动的温度控制相比时，夹套旋转器中更积极的温度控制会使得建库后恢复与生长略为改善。

实施例4：使用rcho2的超高密度细胞培养及细胞库性能

以下实验使用的参数如下：

1)当xv≥约5×10⁷vc/ml(在第9天)，则co2降低至0％，随后若需要的话添加碱。

2)wave摇动速度&角度：初始22rpm/10°(自第0天至第7天)；若podo2从21％增加至>30％(在第7天)，则增加至25rpm/12°以促使气体转移(供给o2并去除co2)。

3)当podo2>30％且xv≥约3×10⁷vc/ml(在第8天)，则手动额外供应纯o2(100％)至顶部空间。

4)起始总气流速率为0.2lpm(从第0天至第8天)，且当xv≥约3×10⁷vc/ml(podo2：纯o2＝3:1，总o2：约62％)，则在第8天增加至0.4lpm，随后在第9天增加至约0.5lpm(podo2：纯o2＝1:1，总o2：约75％)。

5)细胞比灌注速率：在开始时目标为≥约0.2nl/细胞-天，但灌注速率逐步增加至多达12rv/天。在最终日，0.1nl/细胞-天<cspr<0.2nl/细胞-天。

6)种培养及生物反应器培养基：具有4mml-谷氨酰胺的cdcho

7)生物反应器：ge定制10-lcellbag灌注生物反应器，其具有一个液浸管；工作容积：5l；

8)生物反应器接种物：摇瓶种培养；接种密度：约5×10⁵vc/ml

9)细胞贮留方法：atf4(0.2μm孔径)

10)细胞培养物的温度：37℃

11)冷冻降温：cryomed^tm控制速率冷冻仪

测试了rcho细胞系2的超hd细胞培养及细胞库性能(冷冻与解冻后)。超高密度灌注培养物的活细胞密度(细胞/ml)、以反应器容积/天计的灌注速率，以及10xcspr(10x细胞比灌注速率，以nl/细胞-天计)显示于图5中。图6显示培养物的离线ph概况。收获培养物，以在两个不同dmso维持条件下制成uhd(超高密度)5-ml小瓶和100-mluhd冷冻袋供冷冻保存：1)室温(rt，约22-25℃)；及2)受控制的低温(ct，约5℃，使用4℃夹套旋转器)。

图7与8是显示从前述细胞培养条件产生的uhd小瓶及袋在250-ml与3-l摇瓶中在室温与充分控制的冷维持条件(分别为rt与ct)下的细胞生长(xv；实线)与存活率(虚线)概况的图。这些uhd小瓶和袋恢复良好，其中当以0.5x10^6vc/ml和1.0x10^6vc/ml接种于250-ml与3-l摇瓶中时的冷冻后细胞生长快速、存活率高、凋亡低且生产率相当。就解冻后生长、存活率、凋亡及生产率而言，uhd冷冻袋与冷冻小瓶之间在各自维持条件下没有观察到差异。但是，由4℃夹套旋转器在充分控制低温制成的小瓶和袋与在室温制成的那些相比生长更快、存活率更高且凋亡更低。图9及10分别显示当以0.5x10^6vc/ml及1.0x10^6vc/ml接种时，uhd库的解冻后凋亡概况，而图11和图12显示比生产率(spr，rt-室温；ct-充分控制低温)。

实施例5：在20-lwave生物反应器中使用rcho2的超高密度细胞库性能

以下实验的参数如下：

1)细胞库：在实施例2制备的100mluhd冷冻袋

2)生物反应器培养基：具有4mml-谷氨酰胺的cdcho

3)冷冻后生物反应器：ge20-lcellbag；工作容积：10l。

4)生物反应器接种物：来自解冻的冷冻袋的解冻后培养物；接种密度：约5×10⁵vc/ml。

5)生物反应器温度：37℃，o2:20％，co2:5％，摇动速度&角度：22rpm/8°

将一个100mluhd冷冻袋解冻。将50ml的解冻培养物直接接种至一个具有总计10l工作容积的20-lwave生物反应器(a)中。另外50ml先用冷培养基缓慢稀释以降低因渗透梯度大而引起的可能的细胞损伤，然后接种到具有总计10l工作容积的第二个20-lwave生物反应器(b)中。两个生物反应器在相同条件下操作。将两个生物反应器的等分试样转移至卫星摇瓶(60ml工作容积)用于生长比较。还将生物反应器培养物与具有来自另一解冻的100ml冷冻袋的接种物的摇瓶培养物(60ml/250-ml摇瓶与1.5l/3-l摇瓶)比较。

两种wave培养物在解冻后细胞生长、存活率及凋亡方面的表现非常相当。且两个生物反应器中的培养物不仅与卫星摇瓶中的那些非常相当，还与摇瓶中解冻和生长的那些也非常相当。这些数据提示，可以将一个uhd冷冻袋直接解冻至2x20-lwave生物反应器中而不需要以相当的性能进行冷培养基缓慢稀释至摇瓶，其使得种培养工艺从袋解冻到wave生物反应器扩增是完全封闭的。

图13是证明遵循实施例2中所示前述细胞培养条件在室温产生的rcho细胞系2的uhd冷冻袋在20-lwave袋中的细胞生长(xv；实线)与存活率(虚线)概况的图。

实施例6：使用rcho3的超高密度细胞培养及细胞库性能

以下实验的参数如下：

1)当xv≥约2×10⁷vc/ml(在第8天)，则co2降低至0％，之后若需要的话添加碱；

2)wave摇动速度&角度：初始22rpm/10°(自第0天至第7天)；当podo2从21％增加至>30％，则增加至25rpm/12°(在第7天)以促使气体转移(供给o2并去除co2)；

3)当podo2>30％且xv≥约3×10⁷vc/ml(在第9天)，则手动供应额外纯o2(100％)至顶部空间。

4)总气流速率：起始0.2lpm(自第0天至第9天)，且当xv≥约3×10⁷vc/ml，则在第9天增加至0.4lpm(podo2:纯o2＝3:1，总o2：约62％)，且随后在第10天增加至约0.5lpm(podo2:纯o2＝1:1，总o2：约75％)，在第12天增加至约0.6lpm(podo2:纯o2＝1:2，总o2：约83％)。

5)细胞比灌注速率：在第2天以0.5rv/天开始灌注并逐步增加以维持低cspr为≥0.05nl/细胞-天

6)种培养及生物反应器培养基：具有4mml-谷氨酰胺的cdcho

7)生物反应器：ge定制10-lcellbag灌注生物反应器，其具有一个液浸管：工作容积：5l；

8)生物反应器接种物：摇瓶种培养；接种密度：约5×10⁵vc/ml

9)细胞贮留方法：atf4(0.2μm孔径)

10)细胞培养物的温度：37℃

11)冷冻降温：cryomedtm控制速率冷冻仪

12)建库后评估：摇瓶(两代)及20-lwave(一代)，评估xv、存活率、细胞凋亡、生产率。

13)建库后评估培养基：具有4mml-谷氨酰胺的cdcho

测试rcho细胞系3的超hd细胞培养及细胞库性能(冷冻与解冻后)。超高密度灌注培养物的活细胞密度(细胞/ml)、以反应器容积/天计的灌注速率，以及10xcspr(10x细胞比灌注速率，以nl/细胞-天计)显示于图15中。图16显示培养物的离线ph概况。使用超高密度灌注培养物在两个不同dmso维持条件下制备的uhd(超高密度)5-ml小瓶与100-mluhd袋：1)室温(rt，大约22-25℃)；以及2)受控制的低温(ct，大约5℃，使用4℃夹套旋转器)。

来自uhd小瓶和uhd袋的所有解冻后培养物恢复良好，其生长快速、凋亡低，且生产率相当。在充分控制的冷维持条件下的uhd袋和小瓶是相当的，其中在第一次传代时比在室温进行的那些生长略快且存活率更高(>95％)。uhd袋在摇瓶和wave生物反应器中具有相当的解冻后性能。然后其还提示，一个uhd冷冻袋可直接解冻至2x20-lwave生物反应器中，其会使得种培养工艺从袋解冻到wave生物反应器扩增是完全封闭的。图17a是证明由前述细胞培养条件在室温与充分控制的冷维持条件(分别为rt及ct)下产生的uhd小瓶与袋在250-ml与3-l摇瓶及20-lwave中的细胞生长(xv；实线)与存活率(虚线)概况的图。图17b与c显示解冻后凋亡与比生产率(spr)的概况。

实施例7：在使用rcho3的超高密度灌注培养工艺中减少培养基使用

使用内部开发的培养基，使rcho细胞系3以≥0.025nl/细胞-天的低细胞比灌注速率(cspr)生长。与atf4偶联的10-l定制wavecellbag用于灌注培养。培养物在第11天达到约1.25×10⁸vc/ml的活细胞密度，其中灌注速率高达3个反应器容积/天。在整个生物反应器培养过程的培养物存活率为>97％。当与使用市售培养基的相同培养条件相比时，培养基使用降低至约50％。但是，观察到细胞生长比使用商业cdcho培养基时略为更快。直接收获培养物(且不需要浓缩)，以在5-ml小瓶及100-ml冷冻袋中生成uhd库，其在充分控制的冷dmso维持温度通过使用4℃夹套旋转器来进行。建库后研究证明，小瓶与冷冻袋uhd库在摇瓶中解冻之后恢复良好，生长快速、存活率高(>95％)，且生产率相当。另外，将一个冷冻袋解冻至两个20-lwave生物反应器中且证明细胞生长及存活率与摇瓶相当。图18是比较rcho细胞系3的示例性培养物中使用内部培养基(黑色)和cdcho培养基(灰色)的活细胞密度(细胞/ml，实线)和存活率(虚线)的图。图19是比较rcho细胞系3的示例性培养物中使用内部培养基(黑色)和cdcho培养基(灰色)的灌注速率(圆形，实线)和细胞比灌注速率(三角形，虚线)的图。

实施例8：在使用rcho1的超高密度灌注培养工艺中减少培养基使用

将rcho细胞系1使用补充有efficientfeedb(efb)的商业cdcho培养基培养并以≥0.04nl/细胞-天的低细胞比灌注速率维持。具有内置过滤器的ge10-lwave灌注cellbag用作为灌注培养生物反应器。为供比较，也测试了不具任何营养补充的商业cdcho培养基。没有添加efb的培养物在第13天达到约1.0×10⁸vc/ml的活细胞密度，其灌注速率至高达8个反应器容积/天。通过自第5天至第10天添加10％efb至cdcho培养基中并自第10天至第14天添加20％efb，培养物在第14天达到约1.03×10⁸vc/ml的活细胞密度，其灌注速率高达4个反应器容积/天。因此，在添加efb的情况下，达到相当的uhd灌注细胞培养物，其培养基使用大约降低50％。图20是比较rcho细胞系1的示例性培养物中使用补充有efficientfeedb的cdcho培养基(黑色)与cdcho培养基(灰色)的活细胞密度(细胞/ml，实线)和存活率(虚线)的图。图21是比较rcho细胞系1的示例性培养物中使用补充有efficientfeedb的cdcho培养基(黑色)与cdcho培养基(灰色)的灌注速率(圆，实线)与细胞比灌注速率(三角形，虚线)的图。

实施例9：使用rcho3放大超高密度灌注工艺的规模

将20-lwavecellbag定制化与atf4偶联，以支持10luhd灌注培养。在商业cdcho培养基中测试rcho细胞系3生长。培养物在第14天达到约1.1×10⁸vc/ml的活细胞密度，其灌注速率高达5个反应器容积/天。细胞比灌注速率(cspr)维持在≥0.04nl/细胞-天且存活率为>97％。细胞生长与使用具有5l工作容积的10-lwavecellbag相当。图22说明rcho细胞系3的示例性培养物中使用20-lwave生物反应器(10-l工作容积，黑色)及10-lwave生物反应器(5-l工作容积，灰色)的活细胞密度(细胞/ml，实线)及存活率(虚线)。可以直接收获培养物用于制备约90x100ml冷冻袋。

实施例10：使用rcho2及rcho3的超高密度冷冻袋库在蒸气相液氮储存冷冻仪中储存一年后的评估

针对解冻后性能测试了rcho细胞系2和3的100mluhd冷冻袋(约1.0×10⁸vc/ml，每个冷冻袋100ml)并且与0时间点(当库被冷冻降温并转移至蒸气相液态n2储存过夜时)相比较。观察到细胞在时间点0以及在一年时的解冻后细胞生长、存活率及生产率相当。