解冻方法和设备与流程

本发明涉及解冻样品（具体地，包括生物材料的样品）的方法。本发明还涉及用于解冻样品（尤其是包括生物材料的样品）的设备。

背景技术：

冷冻保存是一项广泛采用的技术，其被用以维持生物样品的长期生存能力以便在医学、生物技术和兽医科学中的后续应用。为了在解冻时获得高生存能力，必须在以受控的冷却速率冻结样品之前添加保护性化合物（冷冻保护剂）。冷冻保护剂溶解在样品中的水中并起到防止冰晶形成的作用，冰晶能够通过晶体形成损伤生物细胞材料而且当晶体解冻时也损伤生物细胞材料。用于冷冻保存的样品通常放置在诸如以下各项的专业冷冻容器中：

a)吸管，其是直径为2至4mm且长度高达140mm的薄壁管，且具有0.2ml至0.5ml的容量，

b)螺旋盖冷冻小瓶（cryovial），其为直径更宽（直径为近似12mm）的短管，且具有0.5ml至5.0ml的容量，

c)具有从0.2ml至50ml的容量范围的气密密封的冷冻小瓶（诸如aseptictechnologiescrystal小瓶、cookcellseal小瓶或由westpharmadaikyo供应的那些小瓶），

d)设计成用于更大的体积的冷却保存的柔性袋，其具有从5ml至1000ml的容量，

e)多孔板、矩阵管（matrixtube）和在机器人与高通量筛选中所采用的其他sbs形式。

取决于待冻结的样品的量，所有冷冻容器中的填充体积都能够从几乎空到满之间变化。此外，小瓶容器通常在垂直地竖立时被填充和冻结，从而意指冻结材料/空气界面驻留在小瓶内的高度可根据处理的不同而变化。

在冻结之后，样品通常被存储在低温（常常为液氮的温度（-196°c））下，不过在一些应用中样品能够被存储在更暖的温度下。当需要时，解冻样品，且本领域中通常认为解冻过程应尽可能地快以在不过度加热细胞（这降低它们的生存能力）的情况下确保细胞生存能力。在当前方法中，通常通过以下方法实现解冻：将样品放置在维持在37°c下的水浴中，并且当大致所有冰或含水成分均已熔化时移除样品。尽管已做出一些尝试来使用ir辐射和磁场/电子场向样品传递能量，但样品解冻的大多数方法最终采纳热传导的使用以通过样品容器的壁传递能量。

如上文所论述，通常相信，低速率的解冻对细胞的恢复是有害的。就细胞损伤的机制而言，解冻的最优理论方法是实现从冷冻存储温度到最终产品温度（常常为4°c）的瞬时且均匀的温度上升。然而，在实践中，这在物理上是不可能的。

在实现生物样品中的快速暖化方面的主要根本物理约束与系统的热质量、冷冻材料的熔化焓、容器壁的热导率及样品的液相和固相相关联。在大多数系统中，通过加热容器的壁将能量传递到生物样品。为使加热时间最小化，应使施加热的速率（或功率）最大化。对于理想化的1维稳态跨过壁的热传导而言，能够使用以下公式：

其中p是通过经历加热的横截面面积a所传输的功率，k是壁的热导率，且dt/dx是跨过壁的温度梯度。

在冷冻小瓶的情况下，该等式表明为使通过传导传递至冷冻容器中的功率最大化，仅一个变量（温度梯度）是可直接控制的。冷冻容器壁的热导率、其横截面面积及其厚度（dx）都是由冷冻容器的制造商固定的。为增加施加于冷冻保存的材料的功率，因此必须通过增加容器的外表面温度、减小内表面温度或者这些方法的一些组合来增加跨容器壁的温度梯度（dt）。

当通过一些构件将容器壁维持在固定温度下时，所得的解冻曲线通常包含暖化期间的三个截然不同的阶段。图6中针对在20°c的壁温下10%wt的甘油溶液系统的情况示出了该情况。暖化的三个截然不同的阶段如下：

i.固体热传导：当样品被维持在其玻璃转变温度（对于10%的甘油溶液而言为近似-45°c）下时，系统中不存在自由液体。通过容器壁发生进入冰的固体内的能量传递。在该布置中，冰初始地极冷，且因此dt项是大的。高热功率将流入系统内，且样品将快速暖化。当样品暖化且至容器壁的温度梯度减小时，暖化的速率（被施加于系统的功率）贯穿该体系（regime）指数地衰减。

ii.相变：在该区域中，必须施加能量以不仅加热材料的热质量，而且也驱动从冰到液体的相变。当存在溶质时，将在截然不同的温度范围内发生相变，由此冰分数根据温度而变化。系统从阶段i转变到ii所处的温度取决于冷冻保护剂溶液的组成。在相变阶段开始时，容器保持100%的固态冰，在该阶段结束时，容器保持100%的自由液体，并且在这两个极端之间出现变化的冰分数。当系统暖化时，进入系统中的传入功率衰减，且dt进一步减小。

iii.液体暖化：在材料的熔点之上，发生液体到终端温度的持续暖化。输入功率指数地减小，直到自由液体的温度和容器壁的温度相等。然后施加的功率衰减到零。

稳态1维热传导并不充分描述发生在上述系统内的能量传递，因为其是一阶模型，且其基本上仅适用于相变阶段。在阶段iii中，自由液体、质量传递或对流效应能够容易地在系统内重新分配热能；这能够对到系统的瞬时输入功率产生显著的影响。如果例如冷冻小瓶内存在温度梯度（如图8中所表示的），那么将出现以下情形：容器内的平均流体温度低于直接接触容器的侧壁的流体的温度。

能够被施加于大宗液体的功率与跨容器壁的温度差成正比。如果液体静止且流体内存在大的梯度（如图8的左手侧图像中所示），那么壁附近的流体被暖化，这降低了流体的加热功率。如果流体被良好地混合使得在所有点处流体温度均等于平均流体温度（图8，右手侧图像），那么跨容器壁的温度梯度更高，从而增加施加的功率。产品现在将更快地解冻。

图7指示在图6的相转变阶段（阶段ii）期间发生何事。图7示出冷冻保护剂甘油在0.15nacl中的冰分数图表（但对于诸如二甲基亚砜、丙二醇等其他冷冻保护剂而言存在类似关系）。具有实心圆标记的浅线示出冰分数相对温度，同时具有中空圆标记的深线示出焓相对温度。在图7中所示的示例中，近似80%的冰在-12.5°c至-2.5°c的温度区中熔化，其余20%的冰在-64°c（该溶液的玻璃转变温度）至-12.5°c的温度区中熔化，如由图表上的具有实心圆标记的浅线所示。相信，在解冻期间最具损伤性的温度区与最后80%的冰的解冻相关联，且在图7中所示的示例中，这发生在-12.5°c与-2.5°c之间。另一方面，能够以相对缓慢的加热速率实施最初20%的冰分数的熔化，而不对细胞的生存能力造成任何有害影响。

图5是示出在以下小瓶的不同壁温下解冻这些小瓶所需的解冻时间的图表：填充有3ml的10%dmso并冻结到-100°c的aseptictechnologies6ml小瓶；以及填充有0.5ml的10%dmso并冻结到-100°c的corning小瓶。该图表示出待完成的解冻时间（细小冰粒）根据由水浴施加的外壁温度而变化。从图表中所示的结果清楚可见，通过升高壁条件，可能使解冻产品加快多少。

然而，当解冻生物样品时，考虑到容器内侧的材料的生物性质，在已知过程中通常不将容器的外部温度加热超过37°c，因此不存在损伤内侧的细胞或生物材料的风险（如果其温度超过该温度，则内侧的细胞或生物材料可能受到损伤）。在用于细胞疗法制剂的无菌容纳物的许多包装设计中，包装容器的壁由相对厚实且热导性不良的材料（诸如，环烯烃共聚物（coc））制成。容器的形状也使得在小瓶的内壁与中心之间存在长的路径长度。解冻此类系统的物理学导致相对漫长的解冻期。例如，具有8ml填充量的在37°c水浴中的aseptictechnologies小瓶花费近似10分钟来解冻。就使用当前解冻方法的细胞生存能力而言这远不及最优。

相比于本领域中所公开的解冻方法（这些解冻方法涉及在37°c下解冻样品），本发明人研发了解冻样品的新方法，其中能够更加快速地解冻样品。具体地，发明人已确定，可能将包括样品的容器的外壁加热到37°c之上，同时将内壁温度保持在37°c下或低于37°c。因此，由于所应用的温度增加，能够更快速地解冻样品，同时确保样品的安全的内部温度。这是由于跨容器壁的温度下降所致，所述温度下降确保生物物质将在内表面上经历更低的、安全的峰值温度。

发明人因此研发了解冻样品的方法，其中可能控制跨容器壁的温度下降。在本发明的具体实施例中，能够跨容器壁的不同区域有差异地控制温度下降。

以这种方式，本发明因此通过有针对性地将热施加到容器的外表面上的不同位置来解决对解冻样品的方法的需求，以及也通过精确控制跨容器壁的温度下降以确保生物物质跨整个样品区域经历更低的、安全的峰值温度来解决对实现相对快速解冻的需求。

发明人还研发了可应用于本发明的用于解冻样品（例如，冻结的生物样品）的方法的设备，其中被施加至生物样品材料或其区域的热能够作为目标根据加热时间、样品内的冰分数、冰分数的空间位置或其任何组合而变化。

为进一步减少解冻时间，将认识到的是，样品的搅拌可以是有效的。另外，虽然上述方法能够减少样品的解冻时间，但将认识到的是，当经由跨容器壁施加的功率/热来加热样品材料时，接近壁的材料将比在样品内部（即，距壁的距离最大）中的材料更快地暖化，这降低了系统的加热功率。容器内的样品材料的搅拌能够被用以解决该问题。具体地，材料的搅拌可允许材料的不同部分在不同时间接触容器壁，从而确保产品将更快地解冻，且将防止样品的具体部分吸收过多的具有损伤性的热。

容器的液体成分的有效搅拌取决于众多因素。例如，针对圆筒形孔（well）中的自由流体的简单情况，已知对于有效混合：

其中n是振动频率，幅度为r0，表面张力为σ，孔直径为dw，微板填充体积为vf，且流体密度为ρ。因此，为实现良好的混合，仅有的可外部控制的变量是振荡的幅度r0和频率n。

然而，虽然搅拌能够被用以减少样品的解冻时间，但是过度搅拌样品能够引起由剪切造成的细胞损伤。就此而言，已知针对给定几何构造能够选择的幅度和频率存在下限和上限两者，其中过高的频率和或幅度可导致过度搅拌样品，使得容器的内容物受到过于粗暴的处理，从而导致细胞损伤（例如，由过度剪切造成）。这为这种理想化的情况形成操作窗口，由此为实现有效混合，轨道振荡的选定幅度和频率具有限定的界限，在所述界限内发生良好的混合而无过度剪切，且在所述界限外发生不良的混合或不发生混合，或在另一极端下，导致由剪切造成的过度细胞损伤。在加热完全液相系统的情况下，可能调节该系统从而以参数操作以便实现良好的混合，如在众多加热器/摇动器系统中实现的那样。然而，在从固相到液相的相转变期间，容器内的不同冰分数在系统内呈示不断修改的几何构造。

以上等式展示了几何构造（在微孔示例中，dw）如何对将发生良好混合的条件具有直接影响。通过改变样品的物理搅拌使得针对容器内的自由液体组分的几何构造优化，能够实现自由液体成分的改进的搅拌，从而增加能够被供应到系统的热功率，进而增加解冻速度同时使细胞损伤最小化。就此而言，相比于无搅拌的解冻方法，发明人已确定根据样品的冰分数和容器类型和/或样品体积变化搅拌产品能够使由剪切造成的细胞损伤最小化，同时减少解冻时间。

技术实现要素：

因此，根据本发明的第一方面，提供了一种解冻样品的方法，其中，所述样品被包括在容器内，所述方法包括以下步骤：

a)计算根据以下各项而变化的搅拌程序：i)样品体积和容器类型中的任一者或两者，(ii)样品中的冰分数，和(iii)任选地样品容器的热导率；

b)根据程序搅拌所述样品，以搅拌样品的至少一个区域；以及

c)响应于样品体积和/或所述样品中的冰分数的变化改变应用于样品的至少一个区域的搅拌程序。

步骤b)和c)可重复至少一次、两次、三次、四次、五次或更多次。重复的次数可取决于例如在所述方法开始时的样品体积和样品的温度。此外，重复的次数可取决于用以解冻样品的外部温度。在具体实施例中，响应于样品中变化的冰分数和/或响应于样品体积的任何变化，可连续地改变和/或维持搅拌程序。因此，可同时执行步骤b)和c)，不过在一些实例中也可实施单独的和顺序的步骤。对“连续地”改变或变更搅拌程序的引用意指至少每30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、4秒、3秒、2秒或1秒改变搅拌程序。搅拌的每一次变化之间的间隔可以是固定的，其中例如至少每30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、4秒、3秒、2秒或1秒检查和改变搅拌；或间隔可以在程序的变化之间改变，例如可以可交换地使用至少1秒、2秒、3秒、4秒或5秒中的任一者的间隔。替代性地，取决于样品的物理特性，间隔可以在搅拌的每一次变化之间改变，例如，当样品中存在具体冰分数时可以改变搅拌，例如当样品中冰少于99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%（按体积计）时，或具体地，其中样品中少于99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%的水是冰。

具体地，重复这些步骤或连续地改变搅拌程序，直到样品不包含冰或样品中少于20、15、10或5%的水是冰。替代性地，可重复这些步骤，直到样品达到期望的温度，例如至少2°c、3°c、4°c、5°c、10°c、20°c、30°c或37°c。

因此，发明人发现，待解冻的样品的搅拌的量应根据其体积及其冻结情况或冰分数而变化，以便使对该样品内的生物材料的剪切最小化和/或减少解冻时间。在这方面，在100%的水是冰（或替代性地看待，所述样品不具有液态水）的样品中，搅拌可能不是关键性的且因此可以或可以不实施。当样品为固体（即，不包括自由液体）时，具体地是这样的情况。对于仅包括含水成分的样品而言，当100%的水是冰时，此类样品可为固体。对于包括例如冷冻保护剂连同生物物质的样品而言，当被玻璃化时（即，当处于低于冷冻保护剂的玻璃转变温度的温度时）这些可完全为固体。因此，此时实施的搅拌的量、类型或频率对于可能发生的剪切的程度或对于样品的解冻时间而言并不是关键性的。然而，当样品开始解冻且样品中存在少量液态水（例如，至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%或20%的水未冻结或为液态水，例如1%-20%之间的水是液态水）时，可期望有力的搅拌。当样品的液态水或未冻结分数增加（例如，样品中至少50%、60%、70%、80%或90%的水是液态水）时，可期望减少搅拌的量或频率，且因此更不有力地搅拌样品。通常，以相比于应用于具有至少50%、60%、70%、80%、90%或100%的液态水的样品的频率高至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍或100倍的频率例如通过轨道旋转来搅拌被有力地搅拌的样品。更不有力的搅拌指代相比于被应用于具有少量液态水存在（例如，1%-20%之间的液态水）的样品的搅拌低至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或100倍（fold）的搅拌。

所述方法可包括在步骤a)之前的其他步骤，例如确定容器类型和样品的体积中的一者或两者的步骤。“容器类型”指代所使用的容器的类型，下文进一步论述了其若干示例，例如袋、小瓶等。容器类型可以替代性地或额外地指代所使用的容器的体积。可从制造商或通过测量其可以保持的液体的量来确定该信息。可通过光学技术（在可见波长和诸如ir的其他波长两者中）或通过热量测定来确定样品体积。另外，可实施确定样品容器的热导率的步骤。技术人员将了解能够被用于计算样品容器的热导率的方法，且能够例如将已知量的能量脉冲地输送到样品容器内并确定其如何响应，例如，能够测得壁温升高得多快及温度下降得多快，其中下降越快，热导率越高。

为了实施本发明的方法，可期望使用搅拌装置。在具体实施例中，可将样品（或更具体地，包括样品的容器）放置到包括搅拌装置的样品解冻器皿内。例如，解冻器皿可以是加热的样品板，其具有用于轨道旋转的机构（搅拌装置）。通常，能够控制搅拌（例如，旋转）的频率与幅度两者。

本发明的方法还可包括以下步骤：优选地在搅拌样品的步骤期间或之后，监测样品体积和/或样品中的冰分数。在具体实施例中，所述方法因此包括以下步骤：

a)提供包括样品搅拌装置的样品解冻器皿；

b)将样品引入解冻器皿内；

c)任选地确定容器的热导率；

d)确定容器类型和样品的体积中的一者或两者；

e)计算根据以下各项而变化的搅拌程序：i)所述容器中的样品体积和容器的体积中的任一者或两者，(ii)样品中的冰分数，和(iii)任选地样品容器的热导率；

f)根据程序启用搅拌装置以搅拌样品的至少一个区域；

g)监测样品体积和/或样品中的冰分数；以及

h)响应于样品体积和/或样品的冰分数的变化改变被应用于样品的至少一个区域的搅拌程序。

在该实施例中，步骤c)和d)可按任何顺序执行，且可在步骤a)或步骤b)之前执行。此外，如上文所论述的，步骤f)至h)可重复许多次，例如至少一次、两次、三次、四次或五次，且具体地可连续地实施，直到样品被解冻（即，直到没有冰剩余，或直到少于20%、10%、5%的水是冰，或样品的少于20%、15%、10%或5%是冰）或直到样品达到期望的温度。另外，可在步骤f)期间或之后执行步骤g)。具体地，步骤g)和h)可与步骤f)同时实施。

如本文中所使用的术语“样品”指代任何样品类型，且具体地包含包括生物材料的样品，例如细胞样品。样品可包括诸如以下各项的材料：例如，生物药剂；细胞材料；生物组织；生物器官或其一部分；核酸；或多肽或氨基酸。在一些实施例中，样品可包括食品。

样品还可包括冷冻保护剂，所述冷冻保护剂是用以保护生物材料免受冻结损伤（例如，由于冰晶形成）的物质。冷冻保护剂通常通过增加细胞中的溶质浓度来起作用，且优选地对细胞无毒（或具有极小的毒性）。冷冻保护剂可降低或减小样品内的生物材料的玻璃转变温度，且可允许材料在无冰晶形成的情况下玻璃化。冷冻保护剂还可取代水分子从而与生物分子形成氢键，且因此可代替生物材料中的水分子。

本文中所使用的样品可包括冷冻保护剂的混合物（即，多于一种冷冻保护剂）。

通常的冷冻保护剂包括二醇类（例如，乙二醇、丙二醇和甘油）和二甲基亚砜（dmso）、糖类（例如，海藻糖、蔗糖），且如上文所指示的那样，这些能够孤立地（即，单独地）或组合地使用。

通常，如果样品包括冷冻保护剂，则样品的1%-30%之间可以是冷冻保护剂（例如，1%-20%之间或5%-15%之间）。

在本发明的方法中待解冻的样品通常是“冻结的”。“冻结的”样品通常指代一种样品，样品中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的水呈冰的形式。替代性地看待，冷冻样品可不包含液态水，或少于90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%的水是液态水。

因此，在冻结样品中，可存在一些未冻结材料（液态水）（且因此冻结样品包括部分冻结样品），但通常，未冻结材料或液态水少于样品体积的90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%。

“冻结”材料通常指代已被暴露于足够低的温度下以导致冰晶形成的材料。“冻结”因此指代液态水到冰的相转变。冻结样品将因此包括至少一些固体材料。

“未冻结”材料通常指代不包括冰晶的材料。

如上文所论述的，冻结样品可使其100%的含水成分或水作为冰存在。如果此类冻结样品仅包括含水成分，则当100%的水作为冰存在时，该样品可为固体。然而，在本发明的一个方面中，样品可能额外地包括一种或多种冻结保护剂，所述冻结保护剂通常具有低于冰的熔点的玻璃转变温度。在此类样品中，因此可能的是，当样品存在于冻结保护剂的玻璃转变温度与冰的熔化温度之间的温度下时，虽然100%的水可呈冰的形式，但样品可能不完全为固体，例如具有冰和冻结浓缩溶液的两个相。在低于玻璃转变温度的温度下，包括含水成分与例如冻结保护剂两者的样品将为固体。形成玻璃体的过程在本领域中被称为玻璃化。

冻结样品因此包含包括冻结保护剂的样品，只要上文限定的水的部分作为冰存在，所述样品就处在高于、处于或低于冻结保护剂的玻璃转变温度下。

如本文中所使用的对“水”的引用包括作为液态水的水和作为冰的水两者。

在本发明的具体方面中，解冻方法中所使用的样品可为固体，且可不包括自由液体或未冻结材料，即当存在冻结保护剂时可低于玻璃转变温度，或当样品中仅存在含水成分时可低于冰的熔化温度。

样品内的冰分数是包括在样品中的作为冰存在的水的分数。因此，冰分数是样品中作为冰存在的水的百分比%。样品中水的量是作为液态水与作为冰两者存在的水的总量。

存在本领域中已知的用以确定样品中的冰的量（即，冰分数）的许多方法，且技术人员能够应用任何此类方法以计算本发明的方法中的冰的量。具体地，通过基于热量测定的推算或通过光透射，能够根据直接温度测量结果而变化地确定冰分数。具体地，可针对具体样品根据审查查找表来确定冰分数，其中在一个或每个具体温度下保持的冰分数是预定的。因此，样品温度的测量结果可被用以直接指示在解冻期间保持的冰分数的量。此外，能够针对具体样品基于已被应用于该样品的能量的量以类似的方式从查找表确定冰分数，其中已知具体量的能量用以将样品的温度增加到具体水平，所述具体水平与具体冰分数相关联。

在一些实施例中，所述方法可包括提供样品，例如具有不超过-100°c、-90°c、-80°c、-70°c、-60°c、-50°c或-40°c的初始温度的冷冻保存的样品。样品的温度将在本发明的解冻方法期间增加。

如本文中所使用的术语“解冻（thaw/thawing）”指代将冰转化为液态水的过程。能够将术语“解冻”替代性地称为“熔化”。样品的解冻发生在其熔化温度下或之前，且通常发生在其玻璃转变温度（tg）与其熔化温度（tm）之间。

本发明的方法中所计算的搅拌程序可涉及选择搅拌的具体类型（例如，振动、摇动、搅动、旋转、滚动、挤压、移位、刺戳、折曲等）；在具体的频率和/或幅度（例如，针对小瓶的轨道运动，从0.1mm至10mm，和从0rpm至4000rpm，以及针对袋式容器，线性推动袋厚度（从0mm至20mm，通常从6mm至10mm，具体地8mm）以挤压流体）下；和/或历时具体的时间段，例如从至少10秒、20秒、30秒、40秒或50秒到至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9或10分钟。针对给定样品初始选定的具体搅拌程序将取决于初始提供的样品，即取决于样品中的冰分数和取决于容器类型/体积和/或样品材料的体积（及任选地取决于热导率）。替代性地或额外地，容器（例如，其体积和几何构造）将指定所需的搅拌。具体地，在容器是小瓶或管的情况下，可采取轨道式搅拌，且在容器是袋的情况下，可采取挤压、移位、刺戳和/或折曲。

如先前所论述的，搅拌程序可在样品的解冻的进程中改变。具体地，当样品被冻结时（例如，使其100%的水为冰或不具有液态水），能够使用适合于容器的任何搅拌（例如，类型、频率等）。在样品是固体的情况下，即对于含水样品而言，100%的水作为冰存在，或对于具有冷冻保护剂的样品而言，样品处于或低于玻璃转变温度下，具体地是这种情况。因此此时，不认为所使用的搅拌对样品的剪切和/或解冻时间具有任何有害影响。此时，可能不使用搅拌。当样品开始解冻且冰的量减少时（或替代性地看待，自由液体（例如，液态水）的量增加），增加搅拌频率、幅度或量。因此，例如当样品中存在的液态水的量是水总量的至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%或20%时，可有力地搅拌样品，例如针对管状或小瓶容器而言至少500rpm、1000rpm、2000rpm、3000或4000rpm。然而，当自由液体（水）的水平达到具体水平（例如，至少50%、60%、70%、80%或90%）（或冷冻材料的水平减小到具体水平）时，可期望减小搅拌的量或频率（例如，针对管状或小瓶容器减小到少于1000rpm或500rpm）。此类程序可确保在解冻过程期间减少对生物物质的剪切，同时维持减少的解冻时间以确保细胞生存能力。

因此，如上文所论述的，当样品解冻时，搅拌程序将改变以考虑到变化的冰分数和样品体积。如上文所指示的，可变更搅拌程序的上述变量中的任何一个或多个，例如搅拌的类型、频率、幅度和/或时间。

如本文中所使用的“容器”可以是其中可放置有样品的任何容器。通常，容器将是其中能够放置有样品以冻结样品的容器，且因此通常该容器将能够存在于低温下，例如在-196°c的温度（液氮的温度）下。容器可以是管、小瓶、袋、板、吸管，或能够包括样品的任何其他已知的容器。具体地，容器可以是螺旋盖冷冻小瓶、气密密封的冷冻小瓶、柔性袋、多孔板、矩阵管（matrixtube）或吸管。容器可能够保持任何体积的样品，并且能够采用本发明的本方法而不论容器的体积如何。然而，在本发明的具体实施例中，容器可具有至少50μl、100μl、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml、10ml、50ml、100ml、500ml或1000ml的容量。此外，如上文所指示的，容器可由任何材料制成，不过优选地由能够存在于低温下（例如，-196°c下）的材料制成。容器的壁可以具有任何厚度，例如厚度为0.5mm、1mm、2mm、3mm或4mm。具体地，当容器是袋时，壁厚度可以少于0.5mm，例如少于400μm、300μm、200μm、100μm、50μm、40μm、30μm或20μm。

容器可包括样品的任何体积，且可以或可以不用样品填充到其容量。因此，容器可仅部分填满。在该实例中，样品可包括容器的体积的至少1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。

此外，如上文所指示的，可搅拌样品的“至少一个区域”。因此，在本发明中，可能仅搅拌样品的一部分或一片段（part），并且可以不必须在任何具体搅拌步骤中搅拌整个样品。就此而言，样品的初始搅拌可包括样品的单个区域、样品的多个区域（其可在空间上或根据每个区域的冰分数而分离）或整个样品的搅拌。因此，可在空间上和/或时间上有差异地搅拌样品，且这可根据冰分数和/或样品体积变化而发生改变。就此而言，可在具体搅拌程序中搅拌样品的一个或多个区域，且可在后续搅拌程序中搅拌样品的相同或不同区域，这根据上文所论述的变量确定。因此，在所述方法中，样品的不同区域可在不同时间需要搅拌。在一个实施例中，可在任何具体搅拌程序中搅拌样品的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、200、300、500或1000个离散区域。

具体地，可实施离散区域的搅拌，其中容器是柔性容器（诸如袋），其中能够向袋的离散区域施加压力。如上文所论述的，被应用于样品的至少一个区域的搅拌的变化可包括改变搅拌的频率、幅度或频率与幅度两者。搅拌器装置可包括至少一个搅拌装置，且可存在两个或更多个搅拌装置，这些搅拌装置可围绕和/或沿解冻器皿在空间上分离以便实现器皿的不同区域的有差异的空间搅拌。如上文所指示的，在容器是柔性的情况下，可使用多个搅拌器以在解冻过程期间在相同或不同时间向容器的不同区域施加压力。

在一些实施例中，可用在本发明的方法中的样品解冻器皿还可包括样品加热装置，其中可以在与搅拌步骤相同的时间或与搅拌步骤分开地加热样品。具体地，在计算搅拌程序的步骤可包括计算根据样品的体积和/或容器类型、任选地样品的热导率和冰分数而改变的加热与搅拌程序两者的情况下，搅拌样品的步骤可包括额外地根据加热程序加热样品以加热样品的至少一个区域；并且改变搅拌程序的步骤可包括响应于样品体积和/或样品中的冰分数的变化改变被应用于样品的至少一个区域的加热程序。在样品的解冻期间，样品的加热可连续地改变。

样品的加热可包括加热样品的单个区域、样品的多个区域（其可在空间上分开或根据不同区域中样品冰分数中的差异分开）或整个样品。因此，可在时间上和/或空间上有差异地加热样品，且这可根据样品中的冰分数和样品体积改变。就此而言，可根据具体加热程序处理样品的一个区域，且可在后续加热程序中加热相同或不同的区域。因此，可能需要在不同时间加热样品的不同区域。在一个实施例中，可在任何具体加热程序中加热样品的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个离散区域。

加热装置可包括至少一个加热元件（诸如，在解冻器皿的内壁内或连接到解冻器皿的内壁的热传递装置），且可存在多个加热元件，所述多个加热元件可侧向地围绕器皿或径向地围绕壁在空间上分开，或顺沿器皿壁垂直地分开。可存在呈导电性或电阻性装置的形式的多个热传递装置。可存在嵌在顺沿器皿壁的不同垂直位置处的多个热传递装置，诸如电阻式加热带。加热带可呈环（其可被充分连结）的形式，其可具有起伏的或蜿蜒的轮廓。

如上文所论述的，本发明的本方法能够导致在解冻过程期间对样品（具体地生物样品，例如细胞样品）减少的剪切。在这方面，替代性地看待，本发明还提供一种在样品的搅拌期间减少剪切的方法，所述方法包括：

a)计算根据以下各项而改变的搅拌程序：i)所述容器中的样品体积和容器的类型中的任一者或两者，(ii)样品中的冰分数和(iii)任选地容器的热导率；

b)根据程序搅拌所述样品，以搅拌样品的至少一个区域；以及

c)响应于样品体积和/或样品冰分数的变化改变被应用于样品的至少一个区域的搅拌程序。

在这个方面中，相比于其中不基于样品体积和/或容器类型/体积以及基于冰分数计算和/或变更搅拌的方法（例如，其中将连续搅拌程序应用于样品，即在相同频率下的相同类型的搅拌而不论样品中的冰分数中的变化如何），所述方法具体地将对样品（具体地，细胞样品）的剪切减少至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。

如本文中所使用的，术语“剪切”指代由于搅拌引起的对样品（具体地，对包括在样品内的细胞材料）的任何损伤（具体地，机械损伤）。具体地，剪切指代对细胞的细胞膜的损伤，这可导致或可不导致细胞的裂解。因此，可对细胞样品发生的剪切的量的减少可与发生的细胞膜损伤的减少和/或发生在样品内的细胞裂解的减少（例如，细胞膜损伤和/或细胞裂解的至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的减少）有关。可通过解冻的样品上的直接细胞计数确定细胞剪切的量，或替代性地，可使用标准比色测定监测细胞内成分（诸如，乳酸脱氢酶）的释放。

在优选实施例中，相比于其中不搅拌样品或不基于冰分数和样品体积和/或容器类型/体积搅拌样品的方法，或就以下关于加热的方法而言相比于其中仅容器的外表面暴露于将不预期发生细胞损伤的温度下的方法，本发明的方法可额外地导致解冻时间的减少。具体地，解冻时间可减少至少5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。

如先前所论述的，发明人已确定另一方法，该方法可导致针对样品（具体地，生物样品）的解冻时间的减少。在这方面，发明人已确定可能将包括样品的容器的外壁加热到高于将通常与引起细胞损伤相关联的温度（例如，高于37°c），同时保持内壁温度低于将引起细胞损伤的温度（例如，低于37°c）。以这种方式，可能减少解冻时间，而不将样品暴露于被认为引起细胞损伤的温度。

就此而言，本发明的第二实施例提供一种解冻样品的方法，其中，所述样品被包括在容器内，所述方法包括将所述容器的外壁的至少一个区域加热到等于或高于能够发生细胞损伤的温度的温度，并且其中，容器的内壁处于低于能够发生细胞损伤的温度的温度下。

因此，发明人在这个方面已确定容器的内表面或壁的温度可低于容器的外表面或壁的温度。容器内侧与容器外侧的温度之间的关系可取决于若干因素，包括容器壁的厚度和制造容器壁的材料。此外，容器内的样品的温度和/或体积可影响容器的外壁与内壁之间的温度差。

对“等于或高于能够发生细胞损伤的温度的温度”的引用指代一温度，在该温度下或高于该温度，样品中的细胞的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%在该温度下受到损伤（例如，不可存活和/或具有受损的dna和/或蛋白质）。替代性地看待，相比于处于更低温度下的样品（即，其尚未暴露于等于或高于能够发生细胞损伤的温度的温度下的样品），此类样品可使不可存活的细胞和/或dna受损的细胞增加至少5%、10%、20%、30%、40%或50%。用以测量细胞损伤的方法在本领域中是众所周知的，且包括直接细胞计数和对细胞内成分的释放的监测/测量。

对于生物样品而言，通常，等于或高于该温度能够发生细胞损伤的温度是37°c（例如，38°c），且具有超过37°c的温度或暴露于超过37°c的温度的样品通常将经历一些细胞损伤。然而，等于或高于该温度可发生细胞损伤的温度可根据样品不同而变化。例如，可能有可能在比例如人体组织远为更高的温度下解冻嗜热菌的生物样品。

在一个方面中，可将容器的外壁加热到至少37°c的温度，例如至少40°c、50°c、60°c或70°c。通常，在不引起对容器内的样品造成细胞损伤的情况下，容器壁越厚和/或样品的温度越低，能够被用以加热容器的外表面的温度越高。

对低于、小于能够发生细胞损伤的温度的温度或在能够发生细胞损伤的温度之下的温度的引用指代一温度，在该温度下，样品中的细胞的少于10%、5%、4%、3%、2%或1%在该温度下受到损伤（例如，具有受损的dna、蛋白质和/或不可存活）。具体地，相比于暴露于处于或高于能够发生细胞损伤的温度的温度的样品，所述样品可使存在的受损细胞的量（例如，百分数）减少至少50%、60%、70%、80%或90%。

技术人员将了解的是，在解冻样品的方法期间，外壁被加热所达到的温度可变化。通常，当样品解冻时，将降低温度以防止细胞损伤（即，因为内部样品温度增加）。

此外，在这个方面中，将容器的外壁的至少一个区域加热到等于或高于能够发生细胞损伤的温度的温度。因此，在本发明的方法中，不必在限定的温度下加热整个容器。因此，具体地，可在处于或高于可发生细胞损伤的温度的温度下加热一个或多个区域（例如，至少1、2、3、4、5或6个区域）。在另一方面中，可加热整个容器。在具体实施例中，可期望将对应的内壁区域接触样品的外壁区域加热到处于或高于能够发生细胞损伤的温度的温度，同时对应的内壁区域不接触样品的外壁区域不暴露于处于或高于能够发生细胞损伤的温度的温度（例如，仅暴露于将不发生细胞损伤的温度下）。

关于这个方面，本发明还提供一种解冻包括在容器中的样品的方法，所述方法包括：

加热容器，使得所述容器的对应的内壁区域接触样品的外壁区域被加热到高于对应的内壁区域不接触样品的外壁区域的温度。

因此，根据这个实施例，可能有差异地加热容器，其中相比于对应的内壁不接触样品的外容器壁，可将更高的温度应用于对应的内壁接触样品的外（或外部）容器壁。具体地，在该方法中，容器可仅部分地填充有样品，从而确保存在不接触样品的内壁区域（例如，在容器中的样品上方的内壁区域）。

可使用如下文所描述的本发明的设备实施容器的有差异的加热，例如具有多个在空间上分开的加热元件，或具有用于侧向地或垂直地移动样品容器使得该容器的仅一部分被暴露于由设备中的加热元件产生的热的构件的设备。因此，如下文所论述的，可有可能将容器插入设备中，使得容器的仅一部分在设备中，且容器的一部分在设备外侧。以这种方式，将仅加热设备内的部分（例如优选地，容器的接触样品的部分），从而提供对样品容器的有差异的加热。替代性地，可有可能在本发明的设备内旋转容器，使得仅一个部分被暴露于装置内的加热元件。

具体地，可能有差异地加热样品容器，其中将通常与引起细胞损伤相关联的温度能够被应用于容器的外壁的对应的内壁区域接触样品的一部分，而内壁区域和/或样品并未达到能够发生细胞损伤的温度。

因此，样品的冻结性质（及跨容器壁的温度差）确保样品和/或接触样品的内壁保持处于低于该温度就能够引起对样品的细胞损伤的温度下。当样品仍冻结时，可能的是接触样品的内壁可以处在处于或高于将引起细胞损伤的温度的温度下。在该实例中，样品自身将优选地不达到处于或高于该温度将引起细胞损伤的温度。此外，在具体实施例中，接触样品的内壁可被加热到与不接触样品的内壁相同或类似的温度，尽管增加的温度被应用于其对应的外壁。

因此，本发明可优选地提供一种解冻包括在容器中的样品的方法，所述方法包括加热容器，使得所述容器的对应的内壁区域接触样品的外壁区域被加热到或高于能够发生细胞损伤的温度，同时所述容器的对应的内壁区域不接触样品的外壁区域处于低于该温度能够发生细胞损伤的温度下。在这个实施例中，如先前所论述的，接触样品的内壁区域和不接触样品的内壁区域（例如，在样品上方）可处于相同或类似的温度下。

对外壁（可互换地称为外部壁）的引用指代包括样品的容器的外侧表面。外壁可间接接触样品或不间接接触样品（间接接触意指对应的内壁区域分别接触或不接触样品）。对内壁的引用指代包括样品的容器的内侧表面。内壁可接触样品或不接触样品（例如，样品上方的内壁（例如，在部分填充的容器中）将不接触样品）。

对外壁区域的对应的内壁区域的引用指代在容器的内表面上的处于与容器的外侧表面上的外壁区域相同的位置处的内壁区域。此外，对内壁区域的对应的外壁区域的引用指代在容器的外表面上的处于与容器的内侧表面上的内壁区域相同的位置处的外壁区域。

如该方法中所描述的，接触样品的内壁区域和不接触样品的内壁区域可处于相同或类似的温度下。“类似的”温度可指代至少在10°c、5°c、4°c、3°c、2°c或1°c内的温度。因此，接触样品的内壁表面可处于与不接触样品的内壁表面的温度相差少于10°c（例如，少于5°c、4°c、3°c、2°c或1°c）的温度下。

技术人员将认识到的是，当样品解冻时且因此当样品的温度增加时，可变更被应用于容器的对应的内壁区域接触样品的外壁的热。具体地，当样品解冻时，容器的对应的内壁区域接触样品的外壁被加热所达到的温度可减小。

因此，就此而言，所述方法可包括以下步骤：监测接触样品材料的内壁区域和不接触样品的内壁区域（例如，在样品材料的水平面上方）的温度；以及响应于这两个区域的有差异的温度的变化调整被应用于样品容器的一个或两个外壁区域的热或能量。替代性地或额外地，该步骤可包括监测样品温度以及调整被应用于对应的内壁区域接触样品的外壁区域的热或能量，从而诸如减少所施加的热以便降低接触样品材料的内壁区域的温度。

该步骤还可包括监测样品材料的温度和/或监测冰分数；以及响应于比率的变化调整被施加于样品容器的热或能量。

该步骤可包括响应于以下各项来有差异地加热接触样品材料的内壁区域的在空间上分开的区域：两个内壁区域之间的温度的差异的变化、冰分数的差异、接触样品材料的内壁区域的当前温度或其任何组合。

该步骤可包括使用任何合适的构件监测两个内壁区域的温度和/或监测接触样品材料的内壁的在空间上分开的区域，所述构件可以选自以下各项：

1)一个或多个温度传感器，其嵌在器皿的内壁中或连接到器皿的内壁；

2)一个或多个红外发射传感器，其布置成检测源自器皿的外表面的红外发射；

3)共聚焦技术，其用以聚焦在器皿内侧的温度上；

4)测量容器的外壁的温度，并使用该测量结果连同已输入的功率来计算内壁温度；以及

5)一个或多个红外发射传感器，其布置成检测来自样品材料的空间上分开的部分的红外发射。

该步骤可包括连续地监测两个内壁区域和/或内壁的空间上分开的区域以及所产生的被用以空间上和/或时间上控制器皿和/或样品材料的加热的数据。因此，可在与样品的加热相同的时间实施该步骤。

样品材料可以是如上文针对本发明的第一方面所描述的生物样品材料。

可初始地将容器的对应的内壁区域接触样品的外壁区域加热到等于或高于预期引起对样品造成细胞损伤的温度的温度（例如，加热到至少50°c、60°c或70°c的温度），且可将对应的内壁区域不接触样品的外壁区域加热到20°c与40°c之间的初始温度（诸如，大约37°c）或类似于其的温度（例如，在该温度的至少10°c内，例如在至少5°c、4°c、3°c、2°c或1°c内）。具体地，可将对应的内壁区域接触样品的外壁区域加热到允许内壁温度在20°c至40°c的范围内的温度（具体地，37°c）。然而，当样品包括高的冰分数时（例如，至少60%、70%、80%或90%的样品水是冰，或替代性地看待，少于40%、30%、20%或10%的水是液态水），可能将内壁加热到超过37°c的温度而不引起细胞损伤（即，样品的任何部分的温度均未增加到超过37°c）。然而，如果接触样品的内壁被加热到高于37°c或高于可发生细胞损伤的温度的温度，那么优选的是搅拌样品。

如先前所论述的，本发明的以上方法可通过允许将增加的温度应用于例如容器的外表面上的至少一个区域来减少样品的解冻时间，例如在该温度下或高于该温度将预期发生细胞损伤的温度。因此，替代性地看待，本发明提供一种减少样品的解冻时间的方法，所述方法包括在不在所述样品中引发细胞损伤的情况下，将包括所述样品的容器的外表面的至少一个区域加热到等于或高于该温度能够发生细胞损伤的温度。

“减少”解冻时间可包括相比于其中容器的外表面被加热到低于该温度就能够发生细胞损伤的温度的方法解冻时间减少至少5%、10%、15%、20%、30%、40%或50%。

当样品材料的温度达到限定温度时（诸如-30°c至30°c之间，例如-30°c至20°c之间、-25°c至20°c之间、-20°c至10°c之间、-20°c至5°c之间、-20°c至0°c之间或-20°c至-10°c之间）（或替代性地看待，达到至少-20°c、-10°c、0°c、10°c或20°c或至少30°c的温度），可减少施加于对应的内壁区域接触样品的外壁区域的热或能量。具体地，当样品达到-25°c至0°c的区域内（例如，-20°c至-10°c的区域内）的温度时，可降低温度。当样品材料的温度增加到期望温度时，可继续减少所施加的热或能量。例如，可继续减少被施加到对应的内壁区域接触样品的外壁区域的热或能量，直到样品材料达到37°c。

本发明的第二方面的上述方法还可包括搅拌的步骤，且具体地可与本发明的第一方面的方法相结合。

根据本发明的第三方面，提供一种样品解冻设备，其包括加热器皿，其适于在使用中保持包括样品的容器；以及加热装置，其包括用以在使用中有差异地加热所保持的容器的不同区域的构件，使得容器的对应的内壁区域接触样品的外壁区域的至少一部分被加热到比对应的内壁区域不接触样品的外壁区域的至少一部分更高的温度。

因此，根据上述方法，第三方面的设备能够有差异地加热容器，且可实现恒定的内壁温度（即，对于接触样品的内壁与不接触样品的内壁两者而言）。具体地，设备可允许有差异地加热容器以在不引起细胞损伤的情况下实现能够解冻样品的内壁温度，且具体地，在这方面可能的最高温度。对于生物样品而言，可有差异地加热容器以实现处于或类似于37°c的内壁温度。具体地，装置能够将对应的内壁区域接触样品的外壁区域的至少一部分加热到将预期引起细胞损伤的温度。

如上文所描述的，装置能够将对应的内壁区域接触样品的容器的外壁区域加热到比对应的内壁区域不接触样品的外壁区域更高的温度。对“更高的温度”的引用指代相比于对应的内壁区域不接触样品的外壁区域，对应的内壁区域接触样品的外壁区域的温度的任何增加，例如至少1°c、5°c、10°c、20°c、30°c、40°c、50°c、60°c、70°c、80°c、90°c或100°c的温度增加。在这方面中，可能不加热不与样品接触的外壁区域。

加热器皿可包括器皿壁，加热装置安装在所述器皿壁中或加热装置连接到所述器皿壁。

加热装置可包括在器皿壁上空间上分开的多个加热元件，或可包括单个加热元件。加热元件可包括顺沿器皿壁垂直地分开的加热带、围绕器皿壁水平地分开的加热条或其组合。替代性地或额外地，加热元件可包括弯曲的，或形状可起伏的部分。加热元件可以作为围绕器皿壁的连续或非连续带存在。加热元件可包括电阻式元件。

加热装置可包括辐射加热源，所述辐射加热源布置成向加热器皿应用辐射加热。辐射源可包括红外加热源。用以在空间上有差异地加热所保持的容器的构件可包括器皿壁中的多个闸板（shutter）或窗口，可选择性地启用所述闸板或窗口以实现或防止在具体区域处通过器皿壁传递辐射能量。在装置中使用单个加热元件的情况下，这可以是特别有用的。在采用辐射加热的情况下，可能通过将辐射加热源聚焦或成像（image）于小瓶上来实现容器的空间有差异的加热。此外，能够使用对辐射加热源的光谱控制以实现有差异的加热。

加热装置可包括加热的流体导管，所述加热的流体导管布置成使得能够将加热的流体应用于器皿壁的空间上分开的区域。加热的流体导管可包括嵌在器皿壁内，或可以连接到所述器皿壁的导管。流体导管可包括一系列空间上分开的流体管道，所述流体管道能够选择性地打开或闭合以允许加热的流体流动通过该管道。本发明的加热装置可包括用于移动样品容器以允许有差异地加热样品的构件（例如，用于侧向地或垂直地移动样品容器的构件）。所述构件可包括用于旋转样品容器，例如使得样品容器的仅一部分直接暴露于加热元件或邻近加热元件的构件，或用于在装置中垂直地移动样品容器的构件（例如，以允许容器的仅一部分（例如，包括样品或接触样品）处于装置内）。

加热装置可包括嵌在器皿壁中或安装在器皿壁上的一个或多个温度传感器，或可包括布置成检测来自器皿壁的不同区域和/或容纳在所保持的容器中的样品的红外发射的变化的红外发射传感器。

设备还可包括搅拌装置，所述搅拌装置可以是可打开的，以提供对所保持的样品容器和/或样品容器内的样品材料的时间上和/或空间上有差异的搅拌。搅拌装置可如针对本发明的第一方面或第二方面中的任一者所描述的那样，且可布置成响应于以下各项的变化改变被应用于所述样品容器、样品或其区域的振荡频率和/或幅度：样品冰分数、样品材料或其区域的温度、所保持的容器或其区域的温度，或其任何组合。

所述设备可在本发明的第二方面的方法中使用，以保持针对第二方面所描述的包括样品的容器并如针对第二方面所描述的那样解冻样品。

根据本发明的第四方面，提供一种解冻样品的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在第一时间段内将样品加热到高于其tg的温度，但在该温度下至少70%的样品水是冰；以及

b)在第二时间段内将样品加热到处于或高于样品的熔化温度的温度；

其中，第一时间段长于第二时间段。

根据该方面，发明人已确定在解冻过程期间，就引起细胞损伤（其可影响细胞生存能力）而言，最有害的时段出现在样品中的冰分数的最后部分（例如，冰分数的最后70%）的解冻期间。通常，当样品在处于或高于其tm（例如，处于或高于含水成分（例如，水）的tm）下被加热时，发生这种最终解冻。在初始加热阶段期间，（例如，初始30%的冰的解冻），更不可能发生细胞损伤，且因此能够以相对缓慢的速率实施该初始解冻，而对细胞生存能力没有影响。通常在等于或大于其tg但小于其tm的温度下实施初始解冻。

如本文中所使用的对“tg”的引用指代样品（通常为包括冷冻保护剂的样品）的玻璃体-液体转变或玻璃转变温度。玻璃转变温度是一温度，在该温度下冻结的浓缩基质（例如，包括水、细胞、冷冻保护剂等的样品）凝固成玻璃体。因此，通常，被维持在其玻璃转变温度下的样品将没有自由液体存在，例如，样品体积的少于10%、5%或1%将是自由液体。众所周知的冷冻保护剂的tg在本领域中是已知的，例如dmso的tg是-124°c。

对“tm”的引用指代样品（例如，含水成分，或样品中的冷冻保护剂与含水成分的组合）的熔化温度。制剂（例如，冷冻保护剂与含水成分）的组合的tm可以与单独的任一成分的tm不同（例如，少于单独的任一者）。tm是一温度，在该温度下或高于该温度在样品中实现从固体到液体的相转变。

如先前所论述的，在tg与tm之间的温度下，样品中可存在两个相（具体地，在存在冷冻保护剂的情况下）。因此，可存在冰相，连同冻结浓缩溶液。在tg下，可发生玻璃体的形成。

第一时间段可以是第二时间段的至少两倍长、三倍长、四倍长、五倍长或六倍长，诸如在四倍长与六倍长之间。在一些实施例中，步骤b)包括将样品加热到-5°c与5°c之间、-5°c与3°c之间，或-5°c与2°c之间、-5°c与1°c之间或-3°c与1°c之间。

在一些实施例中，第二时间段在15秒与10分钟之间、20秒与120秒之间、30秒与120秒之间、1分钟与10分钟之间、1分钟与5分钟之间及1分钟与2分钟之间。在一些实施例中，步骤b)包括例如将包括电阻式加热元件的器皿中的冻结的生物样品加热到低于-25°c的温度（诸如，加热到大约-30°c）。

在一些实施例中，第一时间段在5分钟与30分钟之间、5分钟与25分钟之间、5分钟与20分钟之间、5分钟与15分钟之间或10分钟与15分钟之间。

可存在将生物样品维持在0°c与5°c之间的温度（诸如大约4°c）下的另一步骤c)。步骤c)可包括在第三时间段内加热样品，所述第三时间段可短于第二时间段或长于第二时间段，但优选地在5分钟与15分钟之间或在5分钟与10分钟之间。

步骤b)可包括加热样品直到大致所有含水成分均呈液体形式（即，所有冰分数均为液态水），且因此步骤b)可包括加热样品以实现样品的所有含水成分从固体到液体的相变，例如，样品的水的至少70%、80%、90%或95%作为液态水存在，或替代性地看待，直到少于30%、20%、10%或5%的水作为冰存在。

含水成分开始从冻结转变到液体所在的温度将取决于冻结的样品材料的组成（包括样品中的溶剂、溶质等的组分），但在一些实施例中，可执行步骤b)使得所达到的温度不超过-40°c、-35°c、-30°c、-20°c或-15°c。

可执行步骤b)历时足以将所有冻结的含水成分变为液态含水成分的时间段。

可通过逐渐增加样品的温度来执行步骤b)，增加样品的温度通过随时间推移增加被施加至步骤a)中所使用的电阻式加热元件的热或能量实现。

可在步骤a)、b)和c)中的任一者或全部期间搅拌生物样品，并且可执行搅拌使得在所述方法期间的任何时间点改变根据以下各项中的至少一项而改变的搅拌的频率和/或振荡：样品温度、流逝的解冻时间段和样品中的冰分数。

在一些实施例中，所述方法包括在包括珀尔帖元件的器皿中解冻生物样品，取决于维持样品所处的温度，所述珀尔帖元件布置成在步骤a)和b)期间加热样品以及在步骤c)期间或者加热样品或者冷却样品。

本发明的第四方面的方法可与本发明的第一方面或本发明的第二方面的方法结合。本发明的第四方面的方法可包括使用本发明的第三方面的设备，并且，以这种方式可以在执行本发明的第四方面的方法的步骤a)、b)和任选地c)之前将冻结的生物样品提供在容器中并放置在本发明的第三方面的设备中。

在本发明的所有方法中，在解冻之后，可将解冻的样品或大致解冻的样品存储在适当的温度下以及适当的条件中。例如，可期望在后续使用之前将材料存储在低温下（例如，处于或低于10°c、5°c或4°c）。替代性地，针对细胞培养，可能优选在37°c下，例如在培养基中培育细胞或材料。

根据本发明的第五方面，提供一种样品解冻或冷却设备，其包括器皿，所述器皿包括弹性器皿壁并且布置成在使用中保持样品容器，所述弹性器皿壁设有至少一个加热和/或冷却元件，并且其中，所述弹性器皿壁可在第一构型与第二构型之间移动，在所述第一构型中所述弹性器皿壁被偏压至保持的容器上，且在所述第二构型中所述弹性器皿壁被偏压远离保持的容器。

弹性器皿壁可以初始地呈第一构型或第二构型，并且可借助于外部刺激或致动器在构型之间移动。

在一些实施例中，弹性器皿壁初始地呈第一构型且被移动到第二构型以便使得能够将容器插入器皿中，之后壁返回第一构型。在此类实施例中，可使用器皿壁上的吸力或通过施加负压使壁从第一构型移动到第二构型。例如，能够使用真空。然后，在容器上插入之后可以释放壁以移回第一构型，在所述第一构型中器皿壁大致接触容器。

在其他实施例中，弹性器皿壁初始地呈第二构型，且因此可将样品容器插入器皿中。在此类实施例中，可通过在器皿壁的外侧上施加压力使壁移动到第一构型，在一些实施例中，压力可被施加到大致整个器皿壁。

可存在围绕器皿壁在空间上分开的多个加热和/或冷却元件（例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个）。替代性地，可存在单个加热和/或冷却元件。该加热和/或冷却元件或者每个加热和/或冷却元件可嵌在壁内或连接到壁。该加热和/或冷却元件或者每个加热和/或冷却元件可包括围绕器皿壁延伸的带，且每个带可以是大致线性的，或可以是起伏的。带可以是连续的或非连续的。该加热和/或冷却元件或每个加热和/或冷却元件均可以是电阻式加热元件。可通过从冷却散热件的热传导实现冷却。具体地，该冷却元件或每个冷却元件均可以是电阻丝，所述电阻丝可以能够从珀尔帖元件实施冷却（即，降低温度）。可通过加热所述电阻丝控制冷却。

该加热和/或冷却元件或者每个加热和/或冷却元件均可彼此间隔分开，例如以具有围绕器皿壁的均匀分布。设备可以能够有差异地加热和/或冷却样品。就此而言，设备可包括一个或多个闸板或窗口或其他构件，以屏蔽样品容器和/或样品使其不受加热和/或冷却元件中的一个或多个的影响。

器皿可包括外壁和内弹性器皿壁。外壁和内壁可彼此分开，使得其间形成间隙或空隙（airspace）。

弹性器皿壁可由弹性体材料形成，所述弹性体材料可包括例如橡胶、乳胶、硅酮等等。本发明的第五方面的设备可与本发明的第三方面的设备结合。可在本发明的第一、第二和第四方面中的任何方面的方法中使用本发明的第五方面的设备。额外地和/或替代性地，可使用第五方面的设备来冷却（即，降低样品的温度）。冷却或温度的降低指代至少1°c、5°c、10°c或20°c的降低。具体地，设备可以能够冻结样品（即，将未冻结材料转化为冻结材料），例如装置能够被用以冻结液体样品（诸如，饮料）。

在本申请中，术语“含水成分”意指水。

附图说明

为了可以更清楚地理解本发明，现在将参考附图仅以示例的方式描述其实施例，附图中：

图1图示本发明的第三方面和第五方面的样品解冻和/或冷却设备，并且其中生物样品容器位于其上方；

图2a和图2b图示图1的生物样品解冻和/或冷却设备与插入的样品容器的横截面视图；

图3图示本发明的样品解冻设备与插入的冻结生物样品容器的第二实施例；

图4a和图4b图示取自图2a的有方框区域的横截面视图，其示出在不同加热/解冻体系期间跨样品容器壁的热梯度；

图5是图示与冷冻保存的样品的解冻有关的解冻速度相对外壁温度的图表；

图6是图示冷冻保存的样品在恒定温度下的三个截然不同的解冻阶段的图表；

图7图示针对0.15mnacl中的甘油溶液（10%w/w）的平衡状态的冰分数曲线（浅线）和焓曲线（深线）；以及

图8图示在a)内部温度梯度（左手侧图像）和b)液体内的均匀温度分布（右手侧图像）下的液体的内部温度分布。

具体实施方式

图1、图2a和图2b中示出本发明的第三方面和第五方面的样品解冻和/或冷却设备的实施例。设备10包括环绕内加热或冷却器皿14的外器皿12，且这两个器皿由空隙16分开。外器皿12和内加热或冷却器皿14的横截面大致为圆筒形，并与将它们分开的空隙16一起形成嵌套容器。内加热或冷却器皿包括器皿连接边沿22，所述器皿连接边沿连接到外器皿12并密封空隙16。外器皿12由非柔性塑料材料（诸如，聚丙烯、聚苯乙烯等）建构而成。内加热或冷却器皿14包括呈柔性膜的形式的内器皿壁18，所述内器皿壁由弹性材料（诸如，苯乙烯-丁二烯共聚物）建构而成。内器皿壁18包括呈四个加热或冷却带20a-20d的形式的四个加热或冷却装置，它们嵌在器皿壁18内并以起伏或蜿蜒的方式围绕该处延伸。每个加热或冷却带均与邻近的加热或冷却带20a-20d间隔分开。加热带20a-20d包括电阻式加热元件，当被启用时，所述电阻式加热元件向器皿壁18施加热能。

弹性内器皿壁18是柔性的，并且可借由通过空隙16施加的负压或正压移动，所述空隙连接到空气和真空泵（未示出）。

现将参考图1、图2a和图2b描述应用10的使用。呈小瓶2（如图1中所示）的形式的样品容器被插入内加热器皿14中。小瓶2包括保持冻结样品材料8的小瓶壁4，冷结样品材料8由冻结细胞或生物组织物质和冻结冷冻保存剂组成，所述冷冻保存剂包括包含0.15%wtnacl的甘油。样品材料8部分地填充小瓶2，且小瓶壁4用盖6密封。

为了将小瓶2放置于内加热器皿14中，内器皿壁18从第一休止位置（其中器皿壁18具有大致小于小瓶2的直径的直径）被偏压到第二、开放位置（就该位置而言，器皿壁18具有大致大于小瓶2的直径的直径），使得小瓶2能够被插入器皿壁18内。经由在空隙16中施加部分真空实现从第一位置到第二位置的移动，以便使内壁18向外鼓出（bellow）。当小瓶2已被插入器皿壁18内时，释放部分真空，且器皿壁18移回第一休止位置并吻合及邻接小瓶2，如图2a和图2b中所示。膜质内壁18贴附于并吻合小瓶壁4的大区域。在图2a和图2b中所示的实施例中，样品8的大小使得仅包括加热带20c和20d的内壁区域接触与样品8接触的小瓶壁4。内壁18的加热带20a和20b因此在样品8的水平面上方，并在样品8的水平面上方邻接小瓶壁4的区域。

当小瓶2位于内壁18内的正确位置时，按以下方式解冻样品8，所述方式是本发明的第一、第二和第四方面的方法的实施例。

首先，测量样品8的温度，也测量样品8的体积和小瓶4的体积，且根据初始加热程序启用加热元件20a-20d中的每一者。所述初始加热程序将样品8的水平面上方的加热元件20a和20b设定于37°c，同时加热元件20c和20d初始地被设定于70°c。以这种方式，存在于接触小瓶壁4（其相应地接触样品8）的内壁区域18中的加热带20c和20d确保实现相比于样品8的水平面上方的区域，通过内加热器皿14、通过小瓶2的壁4到样品8内的更高的热/能量传递。

在启用初始程序之后，也搅拌设备10，以便搅拌样品8并确保样品在小瓶2内的移动，使得在延长的时间长度内样品8的任何部分都不接触小瓶壁4。

随着初始加热开展，样品8开始解冻，测量样品8中的温度和冰分数，且相应地调整加热程序。

图4b示出由图2a的虚线框界定的放大区域在初始加热程序结束时的温度等温线，如能够在图4b中看到的那样，相比于在样品8的水平面上方的区域中通过器皿壁18和小瓶壁4的热和功率传递，由于在小瓶壁4的接触样品的区域中通过器皿壁18和小瓶壁4至样品8的有差异的功率和热传递，由流动通过壁的热和能量产生温度梯度以在两个区域中维持37°c的内小瓶壁温度。这对于通过传导快速解冻而言可能是最优条件。

图4a示出一情形，其中加热带20b、20c和20d中的每一者均在接触样品8的区域和样品8上方的区域两者中应用跨小瓶壁4的恒定且均匀的热传递，其中加热带20b、20c和20d被设定在37°c下。能够看到的是，在使加热带20b至20d中的每一者均被设定到37°c的情况下，这导致在与图4b中所示的用于快速解冻样品8的相同时间阶段低于最优的内壁18和小瓶壁4温度，因为跨小瓶2的接触样品8的区段的温度梯度导致远为更低的内部小瓶壁温度（在图2a中所示的设置中为10°c）。

另外，如果内壁18被加热到单个固定温度，那么小瓶壁4将在样品8上方达到内壁18温度（其充当散热件）。如果搅拌样品（通常在所有冷冻解冻过程中均需要），那么样品8将接触小瓶壁4的处于外部温度下的区域。如果该外部温度高于37°c，那么这将损伤任何细胞材料。

随着解冻开展，将内壁18的整体温度降低到37°c的最大值是势在必行的，以便不损伤样品8。在闭环控制下，加热程序可通过采用以下方法中的一者实现这样：

a)在解冻之前推定或获知容器内冰的高度；

b)在解冻过程期间监测根据小瓶壁4的温度而改变的加热带20a-20d的施加的功率；以及

c)确定样品8内的冰分数已完全解冻（克服了相变焓），这通常在样品8的总体温度快速上升时发生。

在一些实施例中，样品8将解冻，使得在解冻过程期间的各种时间点，液体含水成分（或解冻的固体成分）内存在冷冻材料的分开的区域。在此类情况下，还将有利的是，使用比施加至小瓶壁4的不接触冻结材料的区域的热/能量更多的热/能量，实现有针对性地加热小瓶壁4的邻接并接触冻结材料的区域。在此类实例中，加热程序能够监测冻结材料的区域的存在，诸如通过测量冰分数并选择性地启用加热带20a-20d中的任一者或全部以增加或减少在小瓶壁4接触样品8的冻结材料的区域处跨内壁18和小瓶壁4施加的热能。

虽然图1、图2a和图2b中所示的实施例利用电阻式加热带20a-20d作为加热元件以物理地接触小瓶壁4并向小瓶壁4传递热，但可使用其他加热元件，例如代替加热带20a-20d经由红外加热元件辐射加热（例如，红外加热）小瓶4，或代替加热带20a-20d使用加热的流体导管来加热小瓶4。在此类实施例中，通过使用关闭闸板（shuttering）、打开窗口（windowing）或辐射加热源的聚焦/成像和/或辐射加热源的光谱控制，或在加热的流体实施例的情况下通过不同流体温度区的关闭闸板（shuttering）或围绕内壁18流动，可实现加热的空间控制（例如，样品8的特定区域的加热）。

虽然图1、图2a和图2b中未示出，但设备10也包括用以监测样品8、小瓶壁4和内壁18的温度的许多部件。这些部件可以是嵌在内壁18内的热传感器或温度传感器，或者嵌在内壁18内并且布置成检测来自小瓶4的表面或来自样品8本身的红外发射的红外传感器。通过使用在内壁18内物理地分开的多个传感器实现前述测量中的任一者的空间分辨率，并且这些也可与加热带20a-20d或等效加热元件组合为单个部件。

当邻近样品8的内壁18的区域和小瓶壁4的区域达到与样品8的水平面上方的小瓶壁4和内壁18的区域相同的温度（即，37°c）时，可将加热带20a-20d设定为维持该温度。替代性地，一旦样品8已完全解冻，就可将加热带20a-20d设定为37°c。

一旦样品8已完全解冻，就可根据需要从设备10移除小瓶2。

图3图示用于在本发明的第一方面或第三方面的方法中的任一者中使用的本发明的解冻设备的第二实施例。所述设备类似于如图1、图2a和图2b中所示的实施例的设备，但包括搅拌构件122a、122b。图3中所示的实施例包括设备110，所述设备包括大体圆形横截面的内器皿113，所述内器皿布置成保持呈小瓶114的形式的样品容器。内器皿113包括四个空间上分开的呈加热带120a、120b、120c和120d的形式的加热元件，它们以与图1、图2a和图2b中所示的实施例类似的方式围绕内器皿113的壁112延伸。加热带120a至120d如针对图1、图2a和图2b中所示的实施例所描述的那样。小瓶114包括小瓶壁116和密封盖118。小瓶包含冻结材料119的样品，且在如图3中所示的实施例中，加热带120a和120b位于样品119的水平面上方，同时加热带120c和120d位于接触邻近样品119的小瓶壁116的内壁112中。如先前所陈述的，内器皿113包括位于器皿112内的呈搅拌器122a和122b的形式的两个搅拌构件。搅拌器122a位于内器皿113的底部，同时搅拌器122b位于内壁112的侧面周围。

现在将参考图3描述设备110的使用。

为优化至样品119中的热功率传递，以一方式解冻样品119，通过所述方式改变根据冰分数（样品119的冻结材料与未冻结材料之比）而改变的内壁112和小瓶壁116的施加的壁温以及施加的搅拌。例如通过基于热量测定的推断、通过光透射或通过搅拌的变化条件的测量，能够获得根据直接温度测量结果而改变的冰分数。

在解冻的开始时，小瓶114被插入内器皿113中，且通过启用搅拌器122a和122b启用样品119的整体搅拌。可根据以上参数中的任一者而改变地控制搅拌的频率和振动，所述参数诸如冰分数、样品119的温度、器皿113的体积、样品119的体积等。另外，通过分开地启用搅拌器122a或122b中的任一者，可实现样品119的不同区域的空间上有差异的搅拌。例如，如果需要搅拌样品119的下部区域同时不搅拌上部区域，则能够关停搅拌器122b，同时在器皿113底部处的搅拌器122a继续搅拌下部区域。同样地，能够有差异地控制搅拌器122a和122b以在相同或不同的时间以不同频率和/或振荡进行搅拌，从而微调样品119的不同区域的搅拌。

在图3中所示的实施例中，在初始搅拌之前，确定样品119和器皿113的以下参数：小瓶114的类型和热导率、样品119的体积、样品119的初始温度和样品119的组分。一旦已确定这些参数，就计算根据以下各项而改变的初始搅拌程序：小瓶114的体积、样品的体积、样品119（其初始地将为100%冻结材料）中的冰分数和小瓶114的热导率。贯穿解冻和搅拌程序监测样品体积和样品冰分数，响应于样品体积和样品冰分数的任何变化，所述解冻和搅拌程序改变以随时间推移向样品119或其区域应用可变搅拌（空间上可变的搅拌或变化的频率和振荡）。

另外，使用加热带120a-120d通过跨内壁112和小瓶壁116的热/能量实现样品119的解冻。通过在近似两分钟的时段内将样品119加热到高于其玻璃转变温度（tg）但低于样品的任何含水成分的熔化温度的温度，实现初始加热。在该实施例中，包括生物材料和甘油/nacl冷冻保护剂的冻结样品119自其冷冻存储温度（其可低于-100°c（当存储在液氮中时为-196°c））暖化到大约-30°c的温度，此时近似20%的冰分数已熔化。这通过利用设定在40°c下的所有加热带120a-120d在近似40°c的温度下快速加热样品119来实现。在该加热时段结束时，减缓冻结样品119的加热，并在近似十五分钟的第二时间段内维持加热，直到样品119达到近似-2°c至-3°c的温度，其中大多数含水成分已发生由固体到液体的相变。一旦样品119完全熔化，重要的就是不过度加热，因此可关断加热带120a-120d，停止搅拌，且如果期望则能够从设备110移除小瓶114。然而，在该实施例中，然后维持加热第三时间段，直到样品119达到大约4°c的温度，此时冻结的生物材料与含水成分两者均得以完全解冻。该第三时间段近似为五分钟到十分钟。在三个解冻阶段和时间段中的每一者期间，根据前文所描述的搅拌程序维持样品119的搅拌。

在针对图1至图4所描述的实施例中，样品119是包括甘油（包含0.15%wt的氯化钠）的冷冻保护剂中的冻结的细胞材料。可使用其他冷冻保护剂，诸如二甲基亚砜（dmso）或丙二醇。在利用甘油/nacl的实施例中，近似80%的冰分数在温度区-12.5°c至-2.5°c中熔化，同时其余20%的冰在温度区-64°c（该冷冻保护剂溶液的tg）至-12.5°c中熔化。在解冻期间最具损伤性的温度区与最后80%的冰分数的解冻相关联，这发生在-12.5°c与-2.5°c之间。因此，能够以相对缓慢的加热速率实施最初20%的冰分数的熔化，而不对细胞生存能力造成任何有害影响。

设备110能够适于包括一种设施，以通过利用珀尔帖元件代替加热带120a-120d从而既在解冻期间加热样品又在解冻后冷却样品来主动地控制解冻后样品温度，以将其温度维持在大约4°c，直到期望移除样品119。

仅借由示例的方式描述以上实施例。在不脱离如所附权利要求中所限定的本发明的范围的情况下，许多变型均是可能的。