堇叶紫金牛快速工厂化生产方法
【专利说明】
一、技术领域
[0001]本发明属于植物组织培养快速繁殖技术领域，具体涉及堇叶紫金牛快速工厂化生产方法
[0002]二、研究背景
[0003]堇叶紫金牛(Ardisia V1lacea)，又名裹堇紫金牛，属紫金牛科紫金牛属，是一种特产于浙江和台湾的珍稀濒危植物。堇叶紫金牛茎皮灰褐色，被微柔毛，叶片略呈莲座状，叶片基部钝圆或微心形，上面微带红色，下面带淡紫色，边缘呈不规则波状浅圆齿，伞形花序单生于叶腋或茎的上部，花冠白色，花期6-7月，植株姿态幽雅，红果艳丽经久，圆滑晶莹，清秀、典雅，红果配紫叶，令人赏心悦目，并且具有较强的耐荫性和耐旱性，可作为庭院地被、林下地被和观叶观果小盆栽类产品，具有极高的市场开发价值。由于堇叶紫金牛为野生资源，且资源量极为有限，常规的繁育方式，无法在最大化保护野生资源的基础上进行工厂化生产，而组培快繁技术体系的建立则能够以较少的野生资源为材料，短时间内来进行大规模的工厂化生产，能够实现该濒危植物的资源保护和种苗繁育，并推动该物种市场化的进程。
三、
【发明内容】
[0004]针对现有技术存在的问题，本发明提供一种堇叶紫金牛的快速工厂化生产方法，提高了生产效率和成活率，降低了生产成本，并且获得的再生苗能够稳定的延续野生资源的优良性状。
[0005]为此，本发明采取如下的技术方案:
[0006]I)将无病虫害的堇叶紫金牛性状优良的单株于3月份开始恢复生长时，将其放到温室内养护，每隔一周叶面喷洒一次0.3%-0.5%的多菌灵溶液，直至5月份左右。待新芽抽出后，剪取其中半木质化的嫩茎，将叶片沿叶柄基部切去，嫩茎切成小段，先用0.5%的新洁尔灭+洗洁精混合溶液搅拌消毒处理lh，倒掉消毒液，在流水下冲洗lh，备用。超净工作台中，处理过备用的小段用无菌水冲洗一下，倒掉无菌水，用70%-75%的酒精溶液消毒60-90s，倒掉酒精后，再用0.1%的升汞溶液消毒5-10min，倒掉消毒液，最后用无菌水反复冲洗
4-5次，备用。无菌水冲洗和消毒处理的过程中，都要不间断地摇动，以保证无菌水和消毒液能够完全与外植体接触，提高消毒效率;将以上消毒处理过的茎段切成2cm左右的小段(每段上有I个休眠的腋芽)，用无菌刀片先把茎段最下端切口褐化的部分切去，迅速将腋芽茎段的芽向上接种到启动培养基上。培养条件为:温度25±2°C，光照时间为10h/d，光照强度为 1500-2000Lx，湿度为60%-65%。启动培养基为:MS+0.15-0.30mg/L氯吡苯脲(CPPU) +
0.10-0.20mg/L 萘乙酸(NAA)+3% 蔗糖+0.7%琼脂，pH 为 5.8-6.0；
[0007]2)启动培养20d以后，休眠的腋芽萌发，将新萌发的嫩芽切下来，接种到不定芽分化(增殖)培养基上。不定芽分化培养基为:MS+0.50-0.80mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.10-0.20mg/L 萘乙酸(NAA)+3% 蔗糖+0.7%琼脂，pH为 5.8-6.0;
[0008]3)增殖培养40d以后，腋芽分化产生大量不定芽，不定芽以芽丛的形式存在。将得到的不定芽丛，轻轻拨散成单个不定芽，将单个不定芽接种到壮苗生根培养基上。壮苗生根培养条件为:温度25±2°C，光照时间为8h/d，光照强度为100Lx，湿度为60%-65%。所述的壮苗生根培养基为:MS+0.10-0.15mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.5-0.8mg/L吲哚丁酸(IBA) +
0.5g/L 活性炭+2 % 蔗糖+0.6 % 琼脂，pH 为 5.8-6.0；
[0009]4)壮苗生根培养20d以后，不定芽逐渐分化为健壮的再生小苗，同时基部产生少量愈伤组织，愈伤组织上部分化出少量不定根。培养40-50d以后，再生小苗的平均株高为4.68cm，平均单株小苗的根系条数为4.28。将生根的组培瓶苗转移到炼苗坑道中的苗床上，自然环境下炼苗10d。移栽前3-4d，将组培瓶的瓶盖松动，但不要完全打开，移栽前l-2d，将组培瓶的瓶盖完全打开，并往组培瓶内灌入少量的无菌水，生根组培苗移栽前，先用镊子将生根苗轻轻地从培养基内夹出来，将根部所带的培养基用清水完全清洗干净，将清洗好的生根苗以3-4株为一丛种入炼苗基质(松鳞，移栽前I周左右，用0.8%高锰酸钾溶液消毒处理)中。最后，用0.3%多菌灵溶液对移栽的生根苗和基质表面进行均匀喷施，以松鳞完全浸湿为宜，然后用塑料薄膜做成封闭的小拱棚，进行保温保湿40d左右。待生根小苗长出新的须状根并恢复健壮生长后，将小拱棚的两端打开，缓慢放风，约I周后，将小拱棚完全打开，使其在自然条件下生长。
[0010]本发明与传统的繁育技术和常规的组培技术相比，能够将组培快繁过程中的壮苗培养和瓶内生根培养两个阶段合二为一，使再生苗在增壮的同时进行瓶内生根，缩短组培苗生产周期的同时减少了组培苗继代的次数，大大节约了生产成本。其中不定芽增殖系数高达12.8，瓶内生根率高达96.7%,炼苗移栽成活率可达到95 %以上，整个快繁周期缩短到只有4.5个月，大大提高了生产效率，并且获得的再生苗能够稳定的延续野生资源的优良性状。
四、【具体实施方式】
[0011]实施案例I
[0012]2014年5月12日，温室内选取生长旺盛，无病虫害，性状表现优良的堇叶紫金牛野生单株，剪取当年新发幼嫩枝条，用剪刀将叶片沿叶柄基部切去，嫩茎切成小段，用清水反复冲洗3-4次，先用0.5 %的新洁尔灭+洗洁精混合溶液搅拌消毒处理30min，倒掉消毒液，在流水下冲洗lh，备用。超净工作台中，处理过备用的小段用无菌水冲洗一下，倒掉无菌水，用70 % -75 %的酒精溶液消毒30s，倒掉酒精后，再用0.1 %的升汞溶液消毒5min，倒掉消毒液，最后用无菌水反复冲洗4-5次，备用。无菌水冲洗和消毒处理的过程中，都要不间断地摇动，以保证无菌水和消毒液能够完全与外植体接触，提高消毒效率；
[0013]将以上消毒处理过的茎段切成2cm左右的小段(每段上有I个休眠的腋芽)，用无菌刀片先把茎段最下端切口褐化的部分切去，迅速将腋芽茎段的芽向上接种到启动培养基上。培养条件为:温度25±2°C，光照时间为10h/d，光照强度为1500-2000LX，湿度为60%-65%。启动培养基为:MS+0.20mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.10mg/L萘乙酸(NAA) +3%蔗糖+0.7%琼脂，PH为5.8-6.0;启动培养28d以后，休眠的腋芽萌发，将新萌发的嫩芽切下来，接种到不定芽分化(增殖)培养基上。不定芽分化培养基为:MS+0.50mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.10mg/L萘乙酸(NAA)+3 %蔗糖+0.7 %琼脂，pH为5.8-6.0；增殖培养45d以后，腋芽分化产生大量不定芽，不定芽以芽丛的形式存在。将得到的不定芽丛，轻轻拨散成单个不定芽，将单个不定芽接种到壮苗生根培养基上。壮苗生根培养条件为:温度25±2°C，光照时间为8h/d，光照强度为lOOOLx，湿度为60%-65%。所述的壮苗生根培养基为:MS+0.10mg/L氯吡苯脲(CPPU) +
0.5mg//L吲哚丁酸(IBA)+0.5g/L活性炭+2%蔗糖+0.6%琼脂，pH为5.8-6.0；壮苗生根培养45d以后，将生根的组培瓶苗转移到炼苗坑道中的苗床上，按照上述
【发明内容】
步骤4)相关的技术操作进行炼苗移栽。
[0014]本实施案例获得的外植体消毒处理污染率为8%，不定芽增殖系数达到11.9，瓶内生根率达到95.8%，整个快繁周期(从增殖培养开始到炼苗移栽结束)为140d。
[0015]实施案例2
[0016]2014年5月28日，温室内选取生长旺盛，无病虫害，性状表现优良的堇叶紫金牛野生单株，剪取当年新发幼嫩枝条，用剪刀将叶片沿叶柄基部切去，嫩茎切成小段，用清水反复冲洗3-4次，先用0.5%的新洁尔灭+洗洁精混合溶液搅拌消毒处理lh，倒掉消毒液，在流水下冲洗lh，备用。超净工作台中，处理过备用的小段用无菌水冲洗一下，倒掉无菌水，用70 % -75 %的酒精溶液消毒60s，倒掉酒精后，再用0.1 %的升汞溶液消毒Smin，倒掉消毒液，最后用无菌水反复冲洗4-5次，备用。无菌水冲洗和消毒处理的过程中，都要不间断地摇动，以保证无菌水和消毒液能够完全与外植体接触，提高消毒效率；
[0017]将以上消毒处理过的茎段切成2cm左右的小段(每段上有I个休眠的腋芽)，用无菌刀片先把茎段最下端切口褐化的部分切去，迅速将腋芽茎段的芽向上接种到启动培养基上。培养条件为:温度25±2°C，光照时间为10h/d，光照强度为1500-2000LX，湿度为60%-65 %。启动培养基为:MS+0.25mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.15mg/L萘乙酸(NAA)+3 %蔗糖+0.7 %琼脂，PH为5.8-6.0;启动培养24d以后，休眠的腋芽萌发，将新萌发的嫩芽切下来，接种到不定芽分化(增殖)培养基上。不定芽分化培养基为:MS+0.70mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.15mg/L萘乙酸(NAA)+3 %蔗糖+0.7 %琼脂，pH为5.8-6.0；增殖培养5 Id以后，腋芽分化产生大量不定芽，不定芽以芽丛的形式存在。将得到的不定芽丛，轻轻拨散成单个不定芽，将单个不定芽接种到壮苗生根培养基上。壮苗生根培养条件为:温度25±2°C，光照时间为8h/d，光照强度为1000LX，湿度为60%-65%。所述的壮苗生根培养基为:MS+0.10mg/L氯吡苯脲(CPPU) +
0.60mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.50g//L活性炭+2 %蔗糖+0.6 %琼脂，pH为5.8-6.0；壮苗生根培养49d以后，将生根的组培瓶苗转移到炼苗坑道中的苗床上，按照上述
【发明内容】
步骤4)相关的技术操作进行炼苗移栽。
[0018]本实施案例获得的外植体消毒处理污染率为8.6%，不定芽增殖系数达到14.1，瓶内生根率达到98.8%，整个快繁周期(从增殖培养开始到炼苗移栽结束)为132d。
[0019]实施案例3
[0020]2014年6月15日，温室内选取生长旺盛，无病虫害，性状表现优良的堇叶紫金牛野生单株，剪取当年新发幼嫩枝条，用剪刀将叶片沿叶柄基部切去，嫩茎切成小段，用清水反复冲洗3-4次，先用0.5%的新洁尔灭+洗洁精混合溶液搅拌消毒处理lh，倒掉消毒液，在流水下冲洗lh，备用。超净工作台中，处理过备用的小段用无菌水冲洗一下，倒掉无菌水，用70 %-75%的酒精溶液消毒90s，倒掉酒精后，再用0.1 %的升汞溶液消毒1min，倒掉消毒液，最后用无菌水反复冲洗4-5次，备用。无菌水冲洗和消毒处理的过程中，都要不间断地摇动，以保证无菌水和消毒液能够完全与外植体接触，提高消毒效率；
[0021 ]将以上消毒处理过的茎段切成2cm左右的小段(每段上有I个休眠的腋芽)，用无菌刀片先把茎段最下端切口褐化的部分切去，迅速将腋芽茎段的芽向上接种到启动培养基上。培养条件为:温度25±2°C，光照时间为10h/d，光照强度为1500-2000LX，湿度为60%-65 %。启动培养基为:MS+0.30mg/L氯吡苯脲(CPPU) +0.20mg/L萘乙酸(NAA) +3 %蔗糖+0.7 %琼脂，PH为5.8-6.0;启动培养20d以后，休眠的腋芽萌发，将新萌发的嫩芽切下来，接种到不定芽分化(增殖)培养基上。不定芽分化培养基为:MS+0.80mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.20mg/L萘乙酸(NAA)+3 %蔗糖+0.7 %琼脂，pH为5.8-6.0；增殖培养55d以后，腋芽分化产生大量不定芽，不定芽以芽丛的形式存在。将得到的不定芽丛，轻轻拨散成单个不定芽，将单个不定芽接种到壮苗生根培养基上。壮苗生根培养条件为:温度25±2°C，光照时间为8h/d，光照强度为lOOOLx，湿度为60%-65%。所述的壮苗生根培养基为:MS+0.15mg/L氯吡苯脲(CPPU) +
0.80mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.50g//L活性炭+2 %蔗糖+0.6 %琼脂，pH为5.8-6.0；壮苗生根培养52d以后，将生根的组培瓶苗转移到炼苗坑道中的苗床上，按照上述
【发明内容】
步骤4)相关的技术操作进行炼苗移栽。
[0022]本实施案例获得的外植体消毒处理污染率为9.3%，不定芽增殖系数达到13.6，瓶内生根率达到99.2%，整个快繁周期(从增殖培养开始到炼苗移栽结束)为137d。
【主权项】
1.堇叶紫金牛快速工厂化生产方法，其特征在于包括以下步骤: 1)选取堇叶紫金牛优良单株带腋芽茎段为外植体，先诱导休眠腋芽快速萌发； 2)诱导腋芽分化不定芽； 3)增殖培养40d以后，腋芽分化产生大量不定芽，不定芽以芽丛的形式存在，将步骤2)得到的不定芽丛，拨散成单个不定芽，将单个不定芽接种到壮苗生根培养基上，培养20d以后，不定芽逐渐分化为健壮的再生小苗，同时基部产生少量愈伤组织，愈伤组织上部分化出少量不定根，所述的壮苗生根培养基为:MS+0.10-0.15mg/L氯吡苯脲CPPU+0.5-0.8mg/L吲哚丁酸IBA+0.5g/L活性炭+2 %蔗糖+0.6 %琼脂，pH为5.8-6.0; 4)对生根的组培苗进行炼苗移栽。2.如权利要求1所述的堇叶紫金牛快速工厂化生产方法，其特征在于步骤I)中:选取无病虫害的堇叶紫金牛性状优良的单株，待新芽抽出后，剪取其中半木质化的嫩茎，将叶片沿叶柄基部切去，嫩茎切成小段，进行消毒，将消毒处理过的茎段切成2cm的小段，每段上有I个休眠的腋芽，用无菌刀片先将茎段最下端切口褐化的部分切去，迅速将腋芽茎段的芽向上接种到启动培养基上，启动培养基为:MS+0.15-0.30mg/L氯吡苯脲CPPU+0.10-0.20mg/L萘乙酸NAA+3%蔗糖+0.7%琼脂，pH为5.8-6.0。3.如权利要求1所述的堇叶紫金牛快速工厂化生产方法，其特征在于步骤I)中培养条件为:温度25 ± 2°C，光照时间为10h/d，光照强度为1500-2000Lx，湿度为60%-65%。4.如权利要求2所述的堇叶紫金牛快速工厂化生产方法，其特征在于步骤I)中的消毒是将嫩茎切成小段后先用0.5%的新洁尔灭+洗洁精混合溶液搅拌消毒处理lh，倒掉消毒液，在流水下冲洗lh，备用，超净工作台中，处理过备用的小段用无菌水冲洗一下，倒掉无菌水，用70%-75%的酒精溶液消毒60-90s，倒掉酒精后，再用0.1 %的升汞溶液消毒5_10min，倒掉消毒液，最后用无菌水反复冲洗4-5次。5.如权利要求1所述的堇叶紫金牛快速工厂化生产方法，其特征在于步骤2)中:启动培养20d以后，休眠的腋芽萌发，将新萌发的嫩芽切下来，接种到不定芽分化培养基上，所述的不定芽分化培养基为:MS+0.50-0.80mg/L氯吡苯脲CPPU+0.10-0.20mg/L萘乙酸NAA+3 %蔗糖+0.7% 琼脂，pH 为 5.8-6.006.如权利要求1所述的堇叶紫金牛快速工厂化生产方法，其特征在于所述步骤3)中壮苗生根培养条件为:温度25 土 2°C，光照时间为8h/d，光照强度为100Lx，湿度为60%-65%。7.如权利要求1所述的堇叶紫金牛快速工厂化生产方法，其特征在于步骤4)中移栽前3-4d，将组培瓶的瓶盖松动，但不要完全打开，移栽前l-2d，将组培瓶的瓶盖完全打开，并往组培瓶内灌入少量的无菌水，生根组培苗移栽前，先用镊子将生根苗轻轻地从培养基内夹出来，将根部所带的培养基用清水完全清洗干净，将清洗好的生根苗以3-4株为一丛种入炼苗基质中，所述炼苗基质为松鳞，最后，用0.3 %多菌灵溶液对移栽的生根苗和基质表面进行均匀喷施，以松鳞完全浸湿为宜，然后用塑料薄膜做成封闭的小拱棚，进行保温保湿40d左右。8.—种堇叶紫金牛快速工厂化生产方法的壮苗生根培养基，其特征在于由以下成分组成:MS+0.10-0.15mg/L氯吡苯脲CPPU+0.5-0.8mg/L吲哚丁酸IBA+0.5g/L活性炭+2% 蔗糖+.0.6% 琼脂，pH 为 5.8-6.0。
【专利摘要】本发明涉及一种堇叶紫金牛快速工厂化生产方法，其特征在于包括以下步骤：1.选取堇叶紫金牛优良单株带腋芽茎段为外植体，先诱导休眠腋芽快速萌发；2.诱导腋芽分化不定芽；3.增殖培养40d以后，腋芽分化产生大量不定芽，将单个不定芽接种到壮苗生根培养基上，培养20d以后，不定芽逐渐分化为健壮的再生小苗，同时基部产生少量愈伤组织，愈伤组织上部分化出少量不定根，所述的壮苗生根培养基为：MS+0.10?0.15mg/L氯吡苯脲CPPU+0.5?0.8mg/L吲哚丁酸IBA+0.5g/L活性炭+2％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8?6.0；4.对生根的组培苗进行炼苗移栽。本发明提高了生产效率和成活率，降低了生产成本，并且获得的再生苗能够稳定的延续野生资源的优良性状。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105706924
【申请号】CN201610068368
【发明人】孙英坤, 沈柏春, 陈林敬, 樊靖, 胡玉春, 王霁
【申请人】杭州市园林绿化股份有限公司