一种野生稻茎尖的超低温保存及恢复培养方法与流程

本发明涉及一种野生稻茎尖的保存方法，具体的说，涉及一种普通野生稻茎尖的超低温保存方法。同时，本发明还涉及到野生稻茎尖的超低温保存后的恢复培养方法，属于植物细胞工程技术领域。

背景技术：

野生稻资源是稻种资源的重要组成部份, 它保存了栽培水稻没有或已经消失了的基因, 并具有特殊的优良性状及高抗病虫害的特性，其有利基因的发掘和保存，对提高水稻产量和品质具有不可估量的价值。当前迅速恶化的环境和不利的气候条件正在侵蚀着水稻的遗传多样性；人类现代急速扩张的经济活动，导致了野生稻生境丧失及恶化、栖息地急剧减少；此外野生稻又具有柱头外露、异交结实率较高、种子落粒性强的生物学特性。这些因素使野生稻种面临灭绝的危险, 对野生稻遗传多样性的保护刻不容缓。目前，对野生稻的保护措施主要有就地保护和迁地保护，即以种子保存的种质厍、以种茎保存的种质圃。

植物组织与细胞的培养为植物的种质保存开辟了新的途径，组织培养物能迅速大量繁殖, 再生植株可保持原有的遗传特性。而超低温保存（-196℃）下，植物的生物化学活性近乎停止，贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内，避免了田间保存易受自然灾害影响而导致种质变异或毁灭，以及组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险，被认为是植物遗传资源长期保存的最优选择。

关于植物超低温保存的研究，保存技术的多样化与简易化方面不断取得进步，能够保存的植物物种数也在不断地增长，但多数集中在苹果、樱桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及马铃薯、红薯、草莓等经济植物为主的植物遗传资源的超低温保存。水稻的超低温保存自1979年Sala等首先报道水稻悬浮细胞的超低温保存后，相关研究多集中在组织培养物如悬浮细胞系、愈伤组织、原生质体及胚状体上，关于水稻完整器官（如茎尖）冻存的报道仅见章志宏教授等在2000年采用程序降温法对水稻单倍体幼穗离体培养诱导的不定芽进行超低温保存，得到再生植株。野生稻的超低温保存技术相关报道更少且集中于国内，如殷晓辉教授等1996年在普通野生稻、宽叶野生稻以及瘤粒野生稻愈伤组织超低温保存研究中首次获得了冻后再生植株，实验证明了野生稻幼穗离体培养物的超低温保存是稻属资源保存的有效途径。谭光轩教授等采用程序降温法对野生稻幼穗离体培养诱导植株，直接进行超低温保存，避开愈伤组织阶段减少遗传变异的危险，但产生的绿芽一周后白化死亡。

野生稻完整器官的冻存，将是今后研究的重点，但由于野生稻茎尖分生组织体积小、由于野生稻的茎尖组织具有细小、幼嫩的特点，生理状态脆弱，且被外部护叶层层紧密包裹，在茎尖剥取、预培养及玻璃化冻存操作中容易折断及受到伤害，保存中难以成活。同时，在其后的恢复培养中也不易再生或产生白化苗。采用程序降温的冷冻方法对设备要求较高。

技术实现要素：

由于现有技术中存在野生稻茎尖分生组织体积小、生理状态脆弱，保存中难以成活的现象。本发明的目的是提供一种野生稻茎尖的超低温保存方法，同时还提供一种野生稻茎尖超低温保存方法后解冻恢复培养方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种野生稻茎尖的超低温保存方法，包括如下步骤：

取继代3个月以上无菌组培苗，剪去上部植株，留基部约3cm，根部约1cm放入不含激素的MS 培养基。培养5-7天后，基部新萌芽0.5-1cm，将新萌植株切离后，带基部转入含蔗糖0.3molL^-1及脱落酸0.5-5mgL^-1的培养基上培养。培养7-10天后，转入0.7molL^-1及脱落酸0.5-5mgL^-1的培养基上预培养3-7天。然后解剖镜下剥取2-3mm的茎尖，在含有0.4 molL^-1及甘油2moL^-1的MS固体培养基上预培养16小时，其中，含有0.4 molL^-1及甘油2moL^-1的MS固体培养基内不含NH4+，用镊子将预培养后的茎尖在2-4%的无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸，然后整齐放在5mm×20mm金属网状装载条上，每条装载条上5-10个茎尖。再然后将带茎尖的装载条浸入含有0.1-0.3%氯化钙、0.4 molL^-1蔗糖及2moL^-1甘油的MS液体培养基，其中，含有0.1-0.3%氯化钙、0.4 molL^-1蔗糖及2moL^-1甘油的MS液体培养基中不含NH4+，经10-30min固定后，将装载条在无菌滤纸上吸去多余液体。将固定好的带茎尖的装载条放于预处理溶液，所述预处理溶液含有0.4 molL^-1及甘油2moL^-1的MS液体培养基，不含NH4+中于室温下处理20-60min后，转入玻璃化保护剂PVS2中进行2-5小时的冰浴处理，所述PVS2中不含NH4⁺。

将带茎尖的装载条迅速投入液氮中保存。

本发明还提供一种野生稻茎尖超低温保存后的恢复培养方法，包括如下步骤：

超低温保存后的野生稻茎尖解冻时从液氮中取出带茎尖的装载条，立即放入1.2molL-1，不含NH4⁺的1/2MS液体培养基中快速解冻2min，并在培养基中洗涤20min。将带茎尖的装载条在滤纸上吸干后置于不含激素和不含NH4⁺的1/2MS培养基中暗培养1天，然后在解剖镜下将茎尖逐一由装载条剥离，转移到含BA及NAA，不含NH4⁺的培养基上进行暗培养。待茎尖再生后转入含BA及NAA和不含NH4⁺的培养基光照培养。

本发明的有益效果是，野生稻茎尖的超低温保存方法简便易行，稳定可靠，保存后野生稻恢复生长状况良好。同时，通过添加外源激素及逐步提高预培养基中蔗糖浓度两者结合提高茎尖的抗性，通过采用金属网格作为茎尖的载体以减少各步骤中的损伤，并采用液氮直投而非依赖程序降温仪的冷冻步骤，在恢复培养基中对大量元素进行调整使之容易再生，最终得到普通野生稻的再生植株。对其它类型的野生稻及禾本科植物遗传资源的超低温保存来说，具有很好的参考价值。同时还提高茎尖的抗性，减少各步骤中的损伤，并采用液氮直投而非依赖程序降温仪的冷冻步骤，简化操作，建立普通野生稻的超低温保存体系，并为其它类型的野生稻及禾本科植物作了技术储备。

附图说明

图1是本发明中野生稻超低温保存的流程图。

图2是本发明中野生稻超低温保存后恢复培养方法的流程图。

图3是本发明中丛生苗的状态示意图。

图4是本发明中驯化苗的状态示意图。

图5是本发明中包埋过程的状态示意图。

图6是本发明中再生苗的状态示意图。

具体实施方式

为了更清楚地叙述本发明的具体实施方式，下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1野生稻无菌苗的获得

参照图1所示，野生稻无菌苗的诱导和继代培养步骤是：取野生稻的地下茎带萌生芽的茎段，在自来水流水下反复冲洗约1小时后，用70%酒精消毒1 min，0.1%的升汞消毒15 min，无菌水冲洗若干次后，在解剖镜下剥取约2mm的茎尖，接种于含4 mg·L^-1 BA及0.5 mg·L^-1 NAA的MS培养基上诱导丛生芽。培养温度为25±2℃, 光照12 h·d^-1，光照强度36 µmolm^-2 s^-1。诱导出丛生芽后，将丛生芽切离并接种在含2mg·L^-1 BA及0.5 mg·L^-1NAA的MS培养基上继代培养。每3个月继代一次。

实施例2野生稻的梯度预培养

参照图1所示，无菌苗的梯度驯化培养，剥离茎尖和茎尖预培养的步骤是：取实施例1所得的组培苗，剪去上部植株，留基部约3cm，根部约1cm放入不含激素的MS培养基培养7天后，取基部新萌1cm的芽，转入含蔗糖0.3molL^-1及脱落酸5mgL^-1的培养基上培养。7天后，再转入0.7molL^-1及脱落酸5mgL^-1的培养基上预培养5天。解剖镜下剥取2-3mm的茎尖，在含有0.4 molL^-1及甘油2moL^-1，不含NH4⁺的MS固体培养基上预培养16小时。

实施例3野生稻茎尖的装置固定

参照图1和图5所示，茎尖固定到装载条和预处理、玻璃化处理的步骤是：用镊子将按实施例2预培养后的茎尖，在2-4%的无钙离子海藻酸钠溶液中轻蘸，即整齐放在5mm×20mm金属网状装载条上，每条装载条上10个茎尖。将带茎尖的装载条浸入含有0.2%氯化钙、0.4 molL^-1蔗糖及2moL^-1甘油，不含NH4⁺的MS液体培养基中，经20min固定后，将装载条在无菌滤纸上吸去多余液体。

实施例4野生稻的玻璃化处理及冻存

参照图1和图5所示，茎尖的液氮超低温保存的步骤是：取实施例3所得的带茎尖的装载条放于预处理溶液，含有0.4 molL^-1及甘油2moL^-1，不含NH4⁺的MS液体培养基中于室温下处理60min后，转入玻璃化保护剂PVS2，不含NH4⁺中进行5小时的冰浴处理，将带茎尖的装载条迅速投入液氮中保存。

实施例5野生稻的茎尖恢复培养与植株再生

参照图2、图3、图4、图6所示，恢复培养方法的所需步骤是，第一步：急速解冻；第二步：洗涤、吸干；第三步，茎尖恢复培养；第四步，茎尖由装载条剥离；第五步：茎尖再生培养，第六步：组培植株再生。

具体的步骤如下：解冻时从液氮中取出带茎尖的装载条，立即放入1.2molL^-1，不含NH4⁺的1/2MS液体培养基中快速解冻2min，并在培养基中洗涤20min。将带茎尖的装载条在滤纸上吸干后置于不含激素，不含NH4+的1/2MS培养基中暗培养1天，然后在解剖镜下将茎尖逐一由装载条剥离，转移到含BA及NAA，不含NH4⁺的培养基上暗培养。待茎尖再生后转入含BA及NAA，含NH4⁺的培养基光照培养。茎尖恢复培养3d后，在解培镜下观察，即可见到有茎尖再生，继续培养约14～28 天后，部分成活茎尖褐变，部分再生成绿苗，再生率最高可达50%。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为详细，只要本领域的技术人员在查看到本发明的实施例后，不脱离本发明构思的前提下，所做的改变都属于本发明的保护范围。但本文所述的实施例不能理解为对本发明的保护范围限制。