专利名称：一种利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法
技术领域：
本发明涉及一种遗传转化体系的建立方法，尤其涉及一种利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法，属于农业生物技术领域或植物基因工程领域。
背景技术：
枣(Ziziphus jujube Mill)是鼠李科枣属植物，我国是枣树的起源地和栽培中心，种质资源非常丰富。枣是我国第七大果树和第一大干果，耐干旱、耐瘠薄、耐盐碱、适应性强，在果树的发展中起着重要的作用。冬枣是优良的晚熟鲜食枣品种，风味独特，产量高，以其极优的品质，富含人体必需的营养物质而倍受消费者青睐，在果树生产、销售上具有重要价值。冬枣主产于山东沾化和河北的黄骅，山西、河南、北京、陕西、新疆等省区也有规模不等的引种。沾化冬枣是鲜食品质最好的冬枣品种之一，主产于我省渤海湾地区，适合在低度盐地生长。随着市场经济的发展和果树品种结构的调整优化，沾化冬枣以其独特的品种特性，成为许多地区的首选品种，发展十分迅速。
然而，冬枣成熟期集中，贮藏期短，常温下仅能保存6-7天，而且果实偏小、果核大、果皮薄、病害严重。若不能及时攻克这些难题，则会大大限制冬枣的发展，无法扩大栽培及销售地域和大量进入国际市场。由于冬枣花小，去雄困难，落花落果较严重，胚容易退化，目前冬枣育种仅仅限于田间选育优良株系。此外，冬枣贮藏保鲜的研究始于90年代中期，先后从国外引进多套设备进行贮藏保鲜。但常规的速冻储藏、气调储藏、减压储藏、辐射储藏等方法，果实出库后品质不佳，货架期也只有3-5天。看来采用现有的贮藏保鲜和育种方法，很难较好地解决这些难题。
冬枣属于高呼吸强度的非跃变型果实，ABA对其后熟及贮期衰老起着非常重要的作用，影响着枣果后熟过程中各类酶活性和果实贮藏物质的降解速率及硬度，是导致枣果变软衰老的主要因素。因此通过反义基因技术组织特异性的降低ABA合成强度是延长枣果采收期和贮藏保鲜期的重要途径。因而，利用植物基因工程技术是有效解决这些问题的首选，成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统的建立。
由于枣树组织培养植株再生的难度较大，缺少合适的再生体系，与其他果树遗传转化相比进展缓慢，迄今仅有几例相关的研究报道。胡桂兵(2001)研究了4种抗生素对台湾青枣幼嫩茎段和疏松的愈伤组织生长的影响，初步确定进行农杆菌介导的遗传转化中抑菌方法和转化体的筛选方法。何业华等(2003，2004)以根瘤农杆菌介导法将ACC合成酶反义基因转入枣嫩梢段和下胚轴，获得了转基因植株。相对于其它植物的遗传转化研究，枣的转基因工作仍处在探索阶段，对于利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法，经检索还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法。
本发明以冬枣组培苗的茎尖为遗传转化受体，以农杆菌介导法将外源基因导入受体细胞，经选择获得转化细胞及植株。在此基础上，确立了适宜的农杆菌介导的遗传转化的农杆菌浓度、浸染时间、暗培养时间，以及减压处理等参数，有效提高了转化频率，建立起一个高效的基因型制约小的冬枣遗传转化体系。
本发明所述利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法，由以下步骤实现1)茎尖培养及诱导丛生芽再生，2)丛生芽的延伸培养，3)以茎尖为受体在抽真空施加负压下进行遗传转化，4)小苗生根和移栽，5)转基因植株分子检测；其特征在于步骤1)所述茎尖培养及诱导丛生芽再生是指冬枣休眠芽在25-27℃培养箱中水培萌发，萌发的幼枝剪成单芽茎段，70％酒精预杀菌30s，0.1％的升汞消毒8-15min，无菌水冲洗3-4次，然后接种在附加0.5-2mg L-1赤霉素和0.1-1mg L-16-苄基嘌呤的MS诱导培养基上，在温度25-27℃、光照强度3000-4000Lx、光照12h/天条件下培养，35天继代一次；步骤2)所述的丛生芽的延伸培养是指将步骤1)再生的小芽接种在添加有1-3mg L-1赤霉素、0.1-0.5mg L-16-苄基嘌呤和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS延伸培养基上以步骤2)所述条件培养，之后切取冬枣茎尖，备用；步骤3)所述的以茎尖为受体在抽真空施加负压下进行遗传转化是指取2-8mm的冬枣茎尖为受体(茎尖受体指十到几十微米的茎尖分生组织(shoot meristem)和大到几毫米的茎端(shoot tip)，而茎尖分生组织是指顶端生长锥及其邻近的叶原基)，用解剖针均匀划伤茎尖顶端分生组织，同时将带有植物表达载体pCAMBIA1300-als-betA的根瘤农杆菌制成OD600值为0.2-1.2的梯度菌液，然后将划伤茎尖分别浸入梯度菌液中，浸染5-20mins，其间浸染环境附以真空度为0.95×105Pa-0.3×105Pa的负压条件，以提高农杆菌的浸染效率；浸染结束后，用无菌滤纸将茎尖上剩余菌液吸干，转至MS延伸培养基中，在20-21℃温度条件下暗培养2-8天；暗培养结束后，将茎尖用无菌水洗2-3次，然后转至含100mg L-1头孢霉素MS延伸培养基上，抑菌培养7-14天，之后在含0.5-3mg L-1绿磺隆的MS延伸培养基上进行抗性筛选，连续筛选3-5代，每代7-10天；然后转入含有1mg L-1赤霉素和0.5mg L-16-苄基嘌呤的MS延伸培养基上恢复培养；步骤4)所述的小苗生根和移栽是指将步骤3)所述恢复培养后存活的茎尖继续培养，待长至株高为1.5-2cm后，转入Nitsh生根培养基中生根，根生长至1.5-3cm后，移入砂与蛭石体积比为1∶1的基质中继续生长；步骤5)转基因植株分子检测是指利用PCR、Southern blot、RT-PCR方法对转基因植株检测，根据是否有目的基因条带，确定冬枣转基因植株。
在述利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法中所述冬枣是指鼠李科枣属植物晚熟的栽培品种(因在寒露节后成熟而得名，丰产稳产，适应性强，是鲜食优良枣品种)。
其中所述冬枣优选沾化冬枣。
在述利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法中所述带有植物表达载体pCAMBIA1300-als-betA的根瘤农杆菌优选LBA4404或AGLO。
在述利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法中所述升汞灭菌后的单芽茎段接种优选附加0.8-1.5mg L-1赤霉素和0.2-0.8mg L-16-苄基嘌呤的MS诱导培养基。
在述利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法中步骤3)所述农杆菌菌液优选是OD600值为0.4-1.0的梯度菌液，所述浸染时间优选8-10mins，所述暗培养时间优选4-6天。
不同农杆菌菌株其较佳的转化参数有差异。如选用LBA4404时，当菌液浓度OD600值为0.6-0.8，较佳感染时间为8-10mins时，结果显示茎尖在恢复培养中的存活率高，转基因植株比例较高。
在述利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法中步骤3)所述负压条件优选0.8×105Pa-0.5×105Pa。
其中步骤3)所述负压条件最优选0.6×105Pa-0.5×105Pa。
本发明中，培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。
上述的MS基本培养基是指改良MS培养基(KNO31900mgL-1，NH4NO31650mgL-1，CaCl2·2H2O 440mgL-1，MgSO4·7H2O 370mgL-1，KH2PO4·H2O 170mgL-1，FeSO4·7H2O 27.8mgL-1，ZnSO4·7H2O 10mgL-1，MnSO4·4H2O 22.3mgL-1，H3BO310mgL-1，KI 0.83mgL-1，Na2MoO4·2 H2O 0.5mgL-1，CuSO4·5H2O 0.025mgL-1，CoCl2·6H2O 0.025mgL-1，盐酸硫胺素10.0mgL-1，盐酸吡哆醇1.0mgL-1，烟酸1.0mgL-1，甘氨酸2.0mgL-1，肌醇100.0mgL-1，生物素0.05mgL-1，酪蛋白水解物500mgL-1)，蔗糖30gL-1，琼脂粉6.5gL-1，pH5.8-6.0。
上述MS诱导培养基是指添加有0.5-2mgL-1赤霉素(GA3)、0.1-1mgL-16-苄基嘌呤(6-BA)和100-500mgL-1酪蛋白水解物的MS固体培养基；上述MS延伸培养基是指添加有1-3mgL-1赤霉素(GA3)、0.1-0.5mgL-16-苄基嘌呤(6-BA)和100-500mgL-1酪蛋白水解物的MS固体培养基；液体培养基则去掉琼脂粉。
上述Nitsh生根培养基是指添加有0.1-0.5mgL-1吲哚乙酸(IAA)，0.2-1mgL-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固体培养基；上述的农杆菌菌株为分子生物学领域常用菌株，可购自上海坤肯生物化工有限公司，在刘君等(CMO与BADH双基因表达载体构建及在烟草中的表达，中国生物工程杂志，2006，26(8)5-9)和王先艳等(植物表达载体构建和转基因烟草抗除草剂及耐盐性的分析，农业生物技术学报，2003，11(6)554-560)研究中有应用的报道。本发明试验中采用的载体构建根据王先艳等(植物表达载体构建和转基因烟草抗除草剂及耐盐性的分析，农业生物技术学报，2003，11(6)554-560)的报道及美国冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南》(科学出版社，2003)的相关方法进行。
利用本发明建立冬枣遗传转化体系的方法能获得大量的具有很强植株再生能力的冬枣茎尖，再生植株体细胞无性系变异小，转基因植株多数生长发育正常。
本发明的特点在于1)大幅度减少基因型障碍，2)培养的茎尖转化频率较高，3)取材不受季节限制，4)转基因植株绝大多数保持原基因型的优良特性。
图1农杆菌菌液浓度对冬枣茎尖遗传转化率影响的折线图其中a，b，c，d代表农杆菌菌液浓度对冬枣茎尖遗传转化率的差异显著性分析标示，相同字母表示在P＝0.05水平上差异不显著，不同字母表示在P＝0.05水平上差异显著。
图2农杆菌浸染时间对冬枣茎尖遗传转化率影响的折线图其中a，b代表农杆菌菌液浓度对冬枣茎尖遗传转化率的差异显著性分析标示，相同字母表示在P＝0.05水平上差异不显著，不同字母表示在P＝0.05水平上差异显著。
图3冬枣转化植株betA基因的PCR检测图具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明实施例1丛生芽的诱导和继代培养冬枣休眠芽在25-27℃培养箱中水培萌发，萌发的幼枝剪成单芽茎段，70％酒精预杀菌30s，0.1％的升汞消毒12-15min，无菌水冲洗3次，然后接种在附加0.5mgL-1、1mgL-1、2mgL-1赤霉素和0.1mgL-1、0.5mgL-1、1mgL-16-苄基嘌呤的MS诱导培养基上。在温度25-27℃、光照强度3000-4000Lx、光照12h/天条件下培养，35天继代一次；筛选剂浓度的确定将除草剂绿黄隆(沈阳农药厂生产，有效成分25％)水溶液过滤灭菌后，加入(培养基温度低于50℃时)去掉酪蛋白水解物的MS诱导培养基中。绿黄隆浓度分别为0，0.5mgL-1、1mgL-1、1.5mgL-1、2mgL-1、2.5mgL-1、3mgL-17个浓度。将诱导产生的冬枣茎尖接种在含有上述浓度绿黄隆的MS延伸培养基上培养，每10天继代培养一次，连续筛选三代。根据筛选后冬枣茎尖的存活率，确定冬枣遗传转化过程中抗性筛选适宜的绿黄隆浓度为2mgL-1。
农杆菌介导的遗传转化将带有植物表达载体pCAMBIA1300-als-betA的根瘤农杆菌(如LBA4404)取单克隆，接种到含有50mg L-1利福平和50mgL-1卡那霉素的YEP液体培养基(酵母提取物10gL-1，蛋白胨10gL-1，NaCl 5gL-1，pH7.0)中，于28℃，180-190r/min振荡培养。菌液浓度达到1.2(OD600)时以4000rpm离心15min，倒掉上清液，细菌沉淀用液体MS延伸培养基重悬，浸染前向此细菌悬液加入100μm的乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)。
为研究农杆菌菌液浓度对冬枣遗传转化率的影响，将延伸培养基上培养7天的冬枣茎尖作为遗传转化受体，剥去茎端的幼叶，用解剖针均匀划伤茎尖顶端分生组织，同时将带有植物表达载体pCAMBIA1300-als-betA的根瘤农杆菌分别制成OD600值为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2的梯度菌液，然后将划伤茎尖分别浸入不同OD600值菌液中，浸染10min。浸染结束后，用无菌滤纸将茎尖上剩余菌液吸干，转至MS延伸培养基中，在20-21℃温度条件下暗培养4天。暗培养结束后，将茎尖用无菌水洗2-3次，然后转至含100mgL-1头孢霉素MS延伸培养基上，抑菌培养7天，之后在含2mg L-1绿磺隆的MS延伸培养基上进行抗性筛选，连续筛选3代，每代7天；然后转入含有1mgL-1赤霉素和0.3mgL-16-苄基嘌呤的MS延伸培养基上恢复培养(见图1)。
为研究农杆菌浸染时间对冬枣遗传转化率的影响，用OD600值为0.8的农杆菌菌液分别浸染处理好的冬枣茎尖5mins、10mins、15mins、20mins，浸染结束后，用无菌滤纸将茎尖上剩余菌液吸干，转至MS延伸培养基中，在20-21℃温度条件下暗培养4天。暗培养结束后，将茎尖用无菌水洗2-3次，然后转至含100mg L-1头孢霉素MS延伸培养基上，抑菌培养7天，之后在含2mg L-1绿磺隆的MS延伸培养基上进行抗性筛选，连续筛选3代，每代7天；然后转入含有1mg L-1赤霉素和0.3mg L-16-苄基嘌呤的MS延伸培养基上恢复培养(见图2)。
为研究农杆菌浸染后暗培养时间对冬枣遗传转化率的影响，用OD600为0.8的农杆菌菌液浸染处理好的冬枣茎尖10mins，浸染结束后，用无菌滤纸将茎尖上剩余菌液吸干，转至MS延伸培养基中，在20-21℃温度条件分别暗培养2天，4天，6天，暗培养结束后，将茎尖用无菌水洗2-3次，然后转至含100mg L-1头孢霉素延伸培养基上，抑菌培养7天，之后在含2mg L-1绿磺隆的MS延伸培养基上进行抗性筛选，连续筛选3代，每代7天；然后转入含有1mg L-1赤霉素和0.3mg L-16-苄基嘌呤的MS延伸培养基上恢复培养。
为研究农杆菌浸染环境附以的负压条件对冬枣遗传转化率的影响，用OD600值为0.8的农杆菌菌液浸染处理好的冬枣茎尖10mins，在浸染过程中辅以0.95×105Pa，0.5×105Pa，0.3×105Pa的负压处理。浸染结束后，用无菌滤纸将茎尖上剩余菌液吸干，转至MS延伸培养基中，在20-21℃温度条件下暗培养4天；暗培养结束后，将幼芽用无菌水洗2-3次，然后转至含100mg L-1头孢霉素MS延伸培养基上，抑菌培养7天，之后在含2mg L-1绿磺隆的MS延伸培养基上进行抗性筛选，连续筛选3代，每代7天；然后转入含有1mg L-1赤霉素和0.3mg L-16-苄基嘌呤的MS延伸培养基上恢复培养。
上述不同处理恢复培养的冬枣茎尖长至1.5-2cm高后转至生根培养基生根，根生长至1.5-3cm后，移入砂与蛭石体积比为1∶1的基质中继续生长，开始一周用封口膜将容器口封好保持湿度。每隔3天浇适量的1/2MS营养液，环境温度控制在25℃，相对湿度60-70％。上述环境条件下生长15-20天后移至土壤中，室外条件下生长。移栽成活的小苗取幼嫩叶片用于分子生物学检测。经PCR等检测(引物1CGCTACAGGGTAAAC GCTACA AC，引物2CCTCACGGCTGCGAATAAATCC)，较佳的农杆菌菌液浓度为0.8(OD600)，较佳的农杆菌浸染时间为10mins，较佳的农杆菌浸染后暗培养时间为4天，较佳的负压条件为0.5×105Pa，冬枣遗传转化率较高的可达4.3％～5.2％(见图3)。
本发明中转化率为产生转基因植株数/农杆菌感染的茎尖数×100％。
上述的MS基本培养基为改良MS培养基(KNO31900mg L-1，NH4NO31650mg L-1，CaCl2·2H2O 440mg L-1，MgSO4·7H2O 370mg L-1，KH2PO4·H2O 170mg L-1，FeSO4·7H2O 27.8mg L-1，ZnSO4·7H2O 10mg L-1，MnSO4·4H2O 22.3mg L-1，H3BO310mg L-1，KI 0.83mg L-1，Na2MoO4·2 H2O 0.5mg L-1，CuSO4·5H2O 0.025mg L-1，CoCl2·6H2O 0.025mg L-1，盐酸硫胺素10.0mg L-1，盐酸吡哆醇1.0mg L-1，烟酸1.0mg L-1，甘氨酸2.0mg L-1，肌醇100.0mg L-1，生物素0.05mg L-1，酪蛋白水解物500mg L-1)，蔗糖30g L-1，琼脂粉6.5g L-1，pH5.8-6.0。
上述诱导培养基是指添加有1.5mg L-1赤霉素(GA3)、0.5mg L-16-苄基嘌呤(6-BA)和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS固体培养基；液体培养基则去掉琼脂粉。
上述延伸培养基是指添加有2mg L-1赤霉素(GA3)、0.2mg L-16-苄基嘌呤(6-BA)和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS固体培养基；液体培养基则去掉琼脂粉。
上述生根培养基是指添加有0.3mg L-1吲哚乙酸(IAA)，0.2mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固体培养基；实施例2丛生芽的诱导和继代培养冬枣休眠芽在25-27℃培养箱中水培萌发，萌发的幼枝剪成单芽茎段，70％酒精预杀菌30s，0.1％的升汞消毒8-10min，无菌水冲洗4次，然后接种在附加1.5mg L-1GA3和0.2mg L-16-苄基嘌呤的MS诱导培养基上，在温度25-27℃、光照强度3000-4000Lx、光照12h/天条件下培养，35天继代一次；农杆菌介导的遗传转化将带有植物表达载体pCAMBIA1300-als-betA的根瘤农杆菌(如LBA4404)取单克隆，接种到含有50mg L-1利福平和50mg L-1卡那霉素的YEP液体培养基(酵母提取物10g L-1，蛋白胨10g L-1，NaCl 5g L-1，pH7.0)中，于28℃，180-190r/min振荡培养。菌液浓度达到0.8(OD600)时以4000rpm离心15min，倒掉上清液，细菌沉淀用液体MS延伸培养基重悬，浸染前向此细菌悬液加入100μm的乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)。
在继代培养基上培养7天的冬枣幼芽作为浸染用外植体，剥去茎端的幼叶，用解剖针均匀划伤茎尖顶端分生组织。处理后的冬枣茎尖在OD600值为0.8的农杆菌悬浮液中浸染10mins，并附以0.5×105Pa的负压环境。浸染结束后，用无菌滤纸将茎尖上剩余菌液吸干，转至MS延伸培养基中，在20-21℃温度条件下暗培养4天。之后在含有100mg L-1头孢霉素的茎延伸培养基中抑菌7天，然后在含有2mg/L绿黄隆的MS延伸培养基中筛选3代，每代7天。筛选后存活的幼芽进行恢复培养，长至1.5-2cm高后转至生根培养基。生根后，移入砂与蛭石体积比为1∶1的基质中继续生长，开始一周用封口膜将容器口封好保持湿度。每隔3天浇适量的1/2MS营养液，环境温度控制在25℃，相对湿度60-70％。上述环境条件下生长15-20天后移至土壤中，室外条件下生长。移栽成活的小苗取幼嫩叶片用于分子生物学检测。经PCR等分子方法检测(引物1CGCTACAGGGTAAAC GCTACAAC，引物2CCTCACGGCTGCGAATAAATCC)，冬枣遗传转化率为可达5.2％。
实施例3基本方法如实施例2，其中农杆菌菌液浓度为0.2(OD600)，浸染10min，负压条件0.95×105Pa。暗培养4d后在含有100mg L-1头孢霉素的MS延伸培养基中抑菌7天，然后在含有2mg L-1绿黄隆的MS延伸培养基中筛选3代，每代7天。移栽成活的小苗取叶片用于分子生物学检测。经PCR等分子方法检测，冬枣遗传转化率为0.6％左右。
实施例4基本方法如实施例2，其中农杆菌菌液浓度为1.2(OD600)，浸染10mins，负压条件0.80×105Pa。暗培养4d后在含有100mg L-1头孢霉素的MS延伸培养基中抑菌7天，然后在含有2mg L-1绿黄隆的MS延伸培养基中筛选3代，每代7天。移栽成活的小苗取叶片用于分子生物学检测。经PCR等分子方法检测，冬枣遗传转化率为1％左右。
实施例5基本方法如实施例2，其中农杆菌菌液浓度为0.8(OD600)，浸染15mins，负压条件0.85×105Pa。暗培养6d后在含有100mg L-1头孢霉素的MS延伸培养基中抑菌7天，然后在含有2mg L-1绿黄隆的MS延伸培养基中筛选3代，每代7天。移栽成活的小苗取叶片用于分子生物学检测。经PCR等分子方法检测，冬枣遗传转化率为2.2％左右。
实施例6基本方法如实施例2，其中农杆菌菌液浓度为1.2(OD600)，浸染5mins，负压条件0.3×105Pa。暗培养2d后在含有100mg L-1头孢霉素的MS延伸培养基中抑菌7天，然后在含有2mg L-1绿黄隆的MS延伸培养基中筛选3代，每代7天。移栽成活的小苗取叶片用于分子生物学检测。经PCR等分子方法检测，冬枣遗传转化率为2.1％左右。
权利要求
1.一种利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法，由以下步骤实现1)茎尖培养及诱导丛生芽再生，2)丛生芽的延伸培养，3)以茎尖为受体在抽真空施加负压下进行遗传转化，4)小苗生根和移栽，5)转基因植株分子检测；其特征在于步骤1)所述茎尖培养及诱导丛生芽再生是指冬枣休眠芽在25-27℃培养箱中水培萌发，萌发的幼枝剪成单芽茎段，70％酒精预杀菌30s，0.1％的升汞消毒8-15min，无菌水冲洗3-4次后，接种在附加0.5-2mg L-1赤霉素和0.1-1mg L-16-苄基嘌呤的MS诱导培养基上，在温度25-27℃、光照强度3000-4000 Lx、光照12h/天条件下培养，35天继代一次；步骤2)所述的丛生芽的延伸培养是指将步骤1)再生的小芽接种在添加有1-3mg L-1赤霉素、0.1-0.5mg L-16-苄基嘌呤和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS延伸培养基上以步骤2)所述条件培养，之后切取冬枣茎尖，备用；步骤3)所述的以茎尖为受体在抽真空施加负压下进行遗传转化是指取2-8mm的冬枣茎尖为受体，用解剖针均匀划伤茎尖顶端分生组织，同时将带有植物表达载体pCAMBIA1300-als-betA的根瘤农杆菌制成OD600值为0.2-1.2的梯度菌液，然后将划伤茎尖分别浸入梯度菌液中，浸染5-20mins，其间浸染环境附以真空度为0.95×105Pa-0.3×105Pa的负压条件，以提高农杆菌的浸染效率；浸染结束后，用无菌滤纸将茎尖上剩余菌液吸干，转至MS延伸培养基中，在20-21℃温度条件下暗培养2-8天；暗培养结束后，将茎尖用无菌水洗2-3次，然后转至含100mg L-1头孢霉素MS延伸培养基上，抑菌培养7-14天，之后在含0.5-3mg L-1绿磺隆的MS延伸培养基上进行抗性筛选，连续筛选3-5代，每代7-10天；然后转入含有1mg L-1赤霉素和0.3mg L-16-苄基嘌呤的MS延伸培养基上恢复培养；步骤4)所述的小苗生根和移栽是指将步骤3)所述恢复培养后存活的茎尖继续培养，待长至株高为1.5-2cm后，转入Nitsh生根培养基中生根，根生长至1.5-3cm后，移入砂与蛭石体积比为1∶1的基质中继续生长；步骤5)转基因植株分子检测是指利用PCR、Southern blot、RT-PCR方法对转基因植株检测，根据是否有目的基因条带，确定冬枣转基因植株。
2.按照权利要求1所述利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法，其特征在于所述冬枣是指鼠李科枣属植物晚熟的栽培品种。
3.按照权利要求2所述利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法，其特征在于所述冬枣是沾化冬枣。
4.按照权利要求1所述利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法，其特征在于所述带有植物表达载体pCAMBIA1300-als-bet4的根瘤农杆菌是LBA4404或AGL0。
5.如权利要求1所述利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法，其特征在于所述升汞灭菌后的单芽茎段接种在附加0.8-1.5mg L-1赤霉素和0.2-0.8mg L-16-苄基嘌呤的MS诱导培养基上。
6.按照权利要求1所述利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法，其特征在于步骤3)所述农杆菌菌液是OD600值为0.4-1.0的梯度菌液，所述浸染时间为8-10mins，所述暗培养时间为4-6天。
7.按照权利要求1所述利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法，其特征在于步骤3)所述负压条件是0.8×105Pa-0.5×105Pa。
8.按照权利要求7所述利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法，其特征在于步骤3)所述负压条件是0.6×105Pa-0.5×105Pa。
全文摘要
本发明公开一种利用茎尖为受体建立冬枣遗传转化体系的方法，主要步骤包括以冬枣休眠芽水培萌发的幼嫩枝条为材料，离体培养诱导茎尖丛生芽的再生，切取茎尖在延伸培养上生长，以茎尖为受体采用农杆菌介导法在抽真空施加负压下进行遗传转化，获得冬枣转基因植株。本发明方法中，浸染环境附以真空度为0.95×10
文档编号C12N15/82GK101016544SQ200710013249
公开日2007年8月15日 申请日期2007年1月19日 优先权日2007年1月19日
发明者谷晓峰, 张举仁, 杨爱芳, 张可炜, 尹小燕 申请人:山东大学