本发明涉及生物细胞培养技术领域，特别是涉及长春花嫁接小蔓长春花所得嵌合体细胞培养体系建立方法。
背景技术：
微嫁接是一种在试管内将砧木与接穗进行嫁接的技术，它是组培快繁与嫁接技术的结合。研究表明，植物嫁接后接穗与砧木之间存在着一系列复杂的物质与能量的转移交换，包括嫁接初期接合部位激素的变化，共质连通后生物碱、小RNA、开花刺激物质、病毒等。另外，嫁接后形成的嵌合体往往会出现一些介于砧木和接穗之间的中间性状，嵌合体中会出现一些特异的蛋白、多糖和小分子物质，这些变异的性状有时会引起育种人员的青睐。嫁接分为传统的枝条嫁接和微嫁接两种。微嫁接技术是近年发展起来的一种新技术，与传统技术相比具有取材方便、周期短、成功率高等优点，因而被广泛采用。微嫁接亲和性受植物亲缘关系的影响，同种植物间嫁接成功率最高，同一科不同种之间的嫁接也屡有报道，但是不同科之间的远缘嫁接难度很大。长春花与小蔓长春花为夹竹桃科的两种不同的药用植物，它们因分别含有抗癌物质（长春碱、长春新碱、文多灵等）和降压物（长春胺）而备受关注。然而，抗癌、抗压物质在这两植物中的含量太低，从植物中提取的活性成分远不能满足市场的需求。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了提出了一种长春花嫁接小蔓长春花所得嵌合体细胞培养体系的建立方法。本发明将长春花的生长点嫁接到小蔓长春花上后，以所得嵌合体为材料诱导愈伤组织，最后建立起该嵌合体的离体细胞悬浮培养体系，测试结果表明，来源于嵌合体的细胞其抗癌物质（长春碱、长春新碱、文多灵等）均有提高。本发明所采用的技术方案是：长春花嫁接小蔓长春花所得嵌合体细胞培养体系建立方法，以将小蔓长春花过根部切割后保留2-3片叶子为砧木，在无菌条件下将长春花生长点接种于小蔓长春花砧木上，接穗和砧木结合的地方会出现一团愈伤组织，将该愈伤组织进行液体悬浮培养，筛选优良细胞系。本发明将长春花的生长点嫁接到小蔓长春花上后，以所得嵌合体为材料诱导愈伤组织，最后建立起该嵌合体的离体细胞悬浮培养体系，测试结果表明，来源于嵌合体的细胞其抗癌物质（长春碱、长春新碱、文多灵等）均有提高。进一步地,建立方法包括以下步骤：步骤一，将小蔓长春花试管苗在过根部切割，保留2—3片叶子做为砧木；步骤二，在检剖显微镜下剥离长春花无菌苗带两个叶缘基的生长点；步骤三，在无菌条件下将长春花生长点接种于小蔓长春花砧木上；步骤四，将步骤三中得到的嫁接材料接种到生长培养基中，并于25℃下培养3-4周；步骤五，待接穗和砧木结合的地方出现一团愈伤组织，将该愈伤组织进行液体悬浮培养，筛选优良细胞系，并进一步筛选激素配比。本发明的上述步骤的实施，将长春花的生长点嫁接到小蔓长春花上后，以所得嵌合体为材料诱导愈伤组织，最后建立起该嵌合体的离体细胞悬浮培养体系。进一步地,步骤四中生长培养基为，MS+6-BA2.0-3.0mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+GA30.5-1.0mg/L的固体培养基，可以增强上述立体细胞培养体系的建立效果。进一步地,步骤五中液体悬浮培养，所用培养基为：MS+6-BA0.2-0.5mg/L+NAA1.0-2.0mg/L+水解酪蛋白15-20mg/L的液体培养基，可以增强上述立体细胞培养体系的建立效果。进一步地,步骤一中砧木为带根和部分叶的活体苗。进一步地,步骤二中生长点带两个叶缘基。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明将长春花的生长点嫁接到小蔓长春花上后，以所得嵌合体为材料诱导愈伤组织，最后建立起该嵌合体的离体细胞悬浮培养体系，测试结果表明，来源于嵌合体的细胞其抗癌物质（长春碱、长春新碱、文多灵等）均有提高，使得抗癌物质（长春碱、长春新碱、文多灵等）和降压物（长春胺）的提取更为方便和高效。具体实施方式为了加深对本发明的理解，下面结合实施例对本发明进一步说明，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。实施例1本实施例的长春花与小蔓长春花均来自本实验室。本实施例包括如下步骤：步骤一，将小蔓长春花试管苗在过根部切割，保留2片叶子做为砧木；步骤二，在检剖显微镜下剥离长春花无菌苗带一个叶缘基的生长点；步骤三，在无菌条件下将长春花生长点接种于小蔓长春花砧木上；步骤四，将步骤三中得到的嫁接材料接种到生长培养基中，其中生长培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.4mg/L+GA30.9mg/L的固体培养基。并于25℃下培养25天；步骤五，接穗和砧木结合的地方会出现一团较为完整的愈伤组织，将该愈伤组织进行液体悬浮培养，筛选优良细胞系，并进一步筛选激素配比，其中液体悬浮培养所用培养基为：MS+6-BA0.4mg/L+NAA1.8mg/L+水解酪蛋白19mg/L的液体培养基。本实施例分别以20棵小蔓长春花和20棵长春花无菌为材料，嫁接成功率了14棵苗，有11个嫁接材料的接合部位处出现嵌合体愈伤组织，其中春新碱、长春碱、文多灵的含量都有不同程度的提高。但没有从嵌合体愈伤组织中检测到长春胺的存在。以该嵌合体为材料，筛选到一个优良细胞株，其中文多灵的含量是母体植株的两倍。本实验室在后续的实验中将嵌合体愈伤组织进行了分化培养，但并未获得再生植株。另外，本实验室反过来试图将小蔓长春花生长点嫁接到长春花砧木上，但没有获得成功。实施例2本实施例的长春花与小蔓长春花均来自本实验室，其中步骤一中的小蔓长春花试管苗在过根部切割，保留3片叶子做为砧木；本实施例具体步骤一至步骤三同实施例1，步骤四和步骤五参见表格1所示：本实施例分别以20棵小蔓长春花和20棵长春花无菌为材料，嫁接成功率了12棵苗，有9个嫁接材料的接合部位处出现嵌合体愈伤组织，其中春新碱、长春碱、文多灵的含量都有不同程度的提高。但没有从嵌合体愈伤组织中检测到长春胺的存在。以该嵌合体为材料，筛选到一个优良细胞株，其中文多灵的含量是母体植株的两倍。本实验室在后续的实验中将嵌合体愈伤组织进行了分化培养，但并未获得再生植株。另外，本实验室反过来试图将小蔓长春花生长点嫁接到长春花砧木上，但没有获得成功。实施例3与实施例2不同的是，本实施例在步骤四和步骤五使用的培养基为，其中步骤四中的生长培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+GA30.5mg/L的固体培养基，并于25℃下培养26天；步骤五，接穗和砧木结合的地方会出现一团较为完整的愈伤组织，将该愈伤组织进行液体悬浮培养，筛选优良细胞系，并进一步筛选激素配比，其中液体悬浮培养所用培养基为：MS+6-BA0.4mg/L+NAA1.8mg/L+水解酪蛋白19mg/L的液体培养基。本实施例分别以20棵小蔓长春花和20棵长春花无菌为材料，嫁接成功率了13棵苗，有12个嫁接材料的接合部位处出现嵌合体愈伤组织，其中春新碱、长春碱、文多灵的含量都有不同程度的提高。但没有从嵌合体愈伤组织中检测到长春胺的存在。以该嵌合体为材料，筛选到一个优良细胞株，其中文多灵的含量是母体植株的两倍。本实验室在后续的实验中将嵌合体愈伤组织进行了分化培养，但并未获得再生植株。另外，本实验室反过来试图将小蔓长春花生长点嫁接到长春花砧木上，但没有获得成功。上述实施例1至实施例3的试验数据如下表所示：表1实施例1至3的试验数据以及结果列表。本发明的实施例公布的是较佳的实施例，但并不局限于此，本领域的普通技术人员，极易根据上述实施例，领会本发明的精神，并做出不同的引申和变化，但只要不脱离本发明的精神，都在本发明的保护范围内。