本发明涉及种子处理技术领域，具体涉及一种脱除辣椒种子中蚕豆萎蔫病毒2号的方法。
背景技术：
辣椒是我国播种面积第二大的蔬菜作物，年栽培面积约133万hm2。病毒病是危害辣椒生产的重要病害，造成辣椒减产20%-70%，品质变劣，成为制约辣椒产业发展的重要障碍。蚕豆萎蔫病毒（Broad bean wilt virus, BBWV）为世界性流行病毒，其寄主范围极其广泛，可侵染44科186属的328种植物。根据血清型不同，蚕豆萎蔫病毒被区分成两个种，即 BBWV1和BBWV2，在我国所得的分离物主要为BBWV2，BBWV1尚未发现。该病毒最早在澳大利亚发现，我国自1982年首次报道以来，传播地区不断扩大，危害逐步加重，目前在我国各辣椒主产区均有分布。BBWV2可引起辣椒叶片系统性褪绿、畸形、斑驳，花蕾变黄、植株顶枯，茎部坏死及整株萎蔫等症状，严重影响辣椒的产量和品质。BBWV2为种传病毒，种子带毒率可达22.2%，产生的带毒种苗作为初侵染毒源，经介体昆虫二次传播，极易造成病害的快速流行，防治难度大；同时还随种质资源交流远距离传播扩散，对病毒病的发生、传播、危害影响极大。因此对种子进行脱毒和无害化处理，从源头上杜绝病原，是有效控制和预防辣椒病毒病大发生，从而减少经济损失的重要环节。
研究表明，采用干热处理、温汤浸种、辐照、化学药剂等种子处理技术能在一定程度上脱除、钝化种子携带的病毒，有效降低种子带毒率。目前对辣椒种子中的黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）所研发的脱毒处理的研究和应用有见报道，但未见针对辣椒种子中BBWV2的脱毒方法。由于不同病毒的致死温度、致死时间等生物学特性不同，不同植物种子对高温、化学药剂等的耐受性均有较大差异，种子脱毒处理工艺直接影响脱毒效果、种子质量及寿命，操作稍有不慎，会导致种子发芽率和发芽势降低，或失去活力。因此在种子脱毒处理中，如何精确控制钝化病毒的技术指标，做到既能最大限度地保证种子脱毒效果彻底持久，同时又能使种子保持高活力，以降低风险、确保生产安全，是一个亟待解决的难题。建立高效、灵敏的病毒检测方法，制定安全高效的种子脱毒技术指标是解决这一难题的关键。
目前常用的种子脱毒效果的检测方法主要有苗期症状观察、指示植物法、酶联免疫法、免疫电镜法和RT-PCR技术，这些方法虽然能够对脱毒效果进行评价，但存在着稳定性差、只能定性检测、灵敏度有限等缺点，不能对病毒进行精确定量，难以确定种子脱毒处理措施对病毒数量和活性的影响，因此无法精确控制钝化病毒的技术指标，难以避免病毒脱除效果不佳，或种子中的病毒虽被脱除，但种子的品质却严重下降的现象。近年发展起来的TaqMan探针实时荧光PCR技术，与上述检测方法相比，该法具有更加灵敏、简便、高效、稳定和定量化等优点。尤其是其可定量的特点应用于种子脱毒效果的检测中，能够精确掌握脱毒种子中病毒的含量，从而在保证种子高品质的前提下，准确控制钝化病毒的技术指标，做到最大限度地抑制病毒活性。目前尚未见利用TaqMan探针实时荧光PCR技术进行辣椒种子脱毒效果评价的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对辣椒种子中携带的主要病毒蚕豆萎蔫病毒2号（BBWV2），提供一种辣椒种子高效、安全脱毒的方法和一种可对脱毒效果进行评价的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，做到既能最大限度地抑制病毒活性，又不降低种子的发芽和活力，为辣椒病毒病的防治和无毒种苗的繁育提供技术支持。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：针对辣椒种子携带的病毒BBWV2，提供一种辣椒种子脱毒方法，具体步骤如下：
1. 湿热处理：将辣椒种子浸泡于5倍体积的沸水中，并迅速震荡冷却至40-45 ℃，滤干水溶液；
2. 药剂处理：在滤干水溶液的辣椒种子中加入5倍体积的10%Na3PO4溶液，浸泡40 min；
3. 滤种：药剂处理结束后，过滤种子，滤去10%Na3PO4溶液；
4. 漂洗：用无菌水清洗辣椒种子3-5次，滤干无菌水；
5. 烘干：及时将步骤4中得到的种子放于网架上置于烘箱内，40 ℃处理72 h，防止种子发芽及霉变；
6. 病毒检测：利用TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法对步骤5获得的种子进行病毒检测，并根据PCR扩增曲线Ct值和标准曲线方程即可对辣椒种子中的BBWV2进行精确定量，计算脱毒率。具体包括如下步骤：
（1）提取辣椒种子总RNA
随机选取10粒脱毒处理的种子和10粒未脱毒处理的种子，各为1份，分别在液氮中研磨至粉末，采用植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA。抽提RNA产物加入DEPC-ddH2O溶解，-70 ℃保存备用。
（2）cDNA的合成
以提取的待测辣椒种子总RNA为模板，反转录制备cDNA模板。反转录体系为20µL包括：RNA模板2µL，10 mmol/L的dNTPs 2µL，10 µmol/L的随机引物2 µL，10×RT mix 2µL，Quant Reverse Transcriptase 2µL，RNase-free ddH2O 10 µL。反应条件：37 ℃，60 min。
（3）实时荧光定量PCR检测
以合成的cDNA为模板，利用BBWV2特异性引物对：BBWV2-F:5’-TCGTACTGAAGTCCATCTTAAAA-3’；BBWV2-R:5’-CGGAAAAAGGGAGTGTGATT-3’及TaqMan探针：BBWV2-Probe:5’-TET-AGGTAGCAAAATGAAATCA-BHQ1-3’进行实时荧光定量PCR检测。
实时荧光定量PCR检测体系为20µL：包括2×Master Mix（Probe）10µL，10 µmol/L的上游引物BBWV2-F 0.6 µL、10 µmol/L的下游引物BBWV2-R 0.6 µL，10 µmol/L的TaqMan探针BBWV2-Probe 0.4µL，模板1µL，补足灭菌ddH2O至20 µL。荧光定量PCR检测反应程序为：50 ℃预处理2 min；95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，58℃退火、延伸1 min，循环40次；58 ℃收集荧光。
（4）带毒量检测
反应结束后记录检测样品的PCR扩增曲线Ct值，通过建立的BBWV2实时荧光定量PCR反应的标准曲线方程：y=-3.5617x+48.189，x为所测样品中BBWV2目标基因片段拷贝数的对数，y为Ct值。计算出检测样品中BBWV2的基因片段拷贝浓度，从而对辣椒种子中BBWV2含量进行定量检测。
（5）计算种子脱毒率
种子脱毒率（%）=（1-处理后种子的带毒量/未处理种子带毒量）×100。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于。
1、本发明提供的辣椒种子脱毒方法与现有方法相比，本发明解决了既能最大限度地抑制病毒活性，又不降低种子的发芽和活力这一难题。利用本发明提供的方法不仅提高了辣椒种子的发芽率及发芽势，而且对辣椒种子中BBWV2的脱除更为彻底，脱除率达到100%。
2、与传统的田间指示植物检测相比，本发明提供的实时荧光定量PCR检测方法大大缩短了检测时间，传统的方法需要几个月甚至1年的时间才能完成，而本发明只需要几个小时即可完成脱毒效果检测。
3、与目前常用的指示植物法、血清学技术、RT-PCR检测方法相比，本发明提供的实时荧光定量PCR检测方法，不仅灵敏度更高、特异性更强、检测效率更快，而且可以精确掌握脱毒种子中的病毒含量，从而可对钝化病毒的技术指标进行精确控制。
4、本发明提供的辣椒种子脱毒方法不受时间限制、环境的影响，可常年在实验室或基层单位使用，非常实用，可用于脱毒辣椒种子的规模化生产。
附图说明
图1为不同脱毒处理的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测结果。图中曲线1-8分别代表：对照、干热处理、湿热处理、温汤处理、10%Na3PO4处理、干热+湿热处理、干热+10%Na3PO4处理、湿热+10%Na3PO4处理。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。
试验药品：植物总RNA提取试剂盒(RNAprep pure Plant Kit)、反转录试剂盒（TIANscript RT Kit）、三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）、TaqDNA聚合酶、Na3PO4购自北京天根生化科技有限公司；Luminaris Probe qPCR Master Mix购自Thermo公司；BBWV2特异性引物对BBWV2-F/BBWV2-R及TaqMan探针BBWV2-Probe由上海生工生物工程股份有限公司合成。
仪器设备：实时荧光PCR仪（Roche Lightcycle 2.0）。
试验材料：采集于新疆南、北疆加工型辣椒主要生产区，经DAS-ELISA和RT-PCR扩增、测序鉴定为BBWV2感染的辣椒种子样品为阳性材料，健康辣椒种子样品为阴性材料。
本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例1. 几种脱毒方法的脱毒效果比较
本实施例设计七种脱毒方法对辣椒种子进行脱毒处理，以未脱毒辣椒种子作为对照，每种处理的种子量约为300粒饱满带毒辣椒种子。种子脱毒处理后利用TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法对辣椒种子中的BBWV2进行定量检测，比较各脱毒方法的脱毒效果。
1. 脱毒方法设计如下：
（1）干热处理法：将待脱毒处理的辣椒种子置于烘箱内，在70 ℃条件下，热风处理48 h后静置冷却。
（2）湿热处理法：将待脱毒处理的辣椒种子浸泡于5倍体积的沸水中，并迅速震荡冷却至40-45 ℃，滤干水溶液后及时将处理种子放于网架上置于烘箱内，40 ℃处理72 h，防止种子霉变及发芽。
（3）温汤处理法：将待脱毒处理的辣椒种子置于5倍体积的55 ℃温水中浸种40 min；滤干水溶液后及时将处理种子放于网架上置于烘箱内，40 ℃处理72 h，防止种子霉变及发芽。
（4）10%Na3PO4处理法：用10%Na3PO4溶液浸种40 min；药剂处理结束后，滤去10%Na3PO4溶液，用无菌水清洗辣椒种子3-5次；滤干水溶液后及时将处理种子放于网架上置于烘箱内，40 ℃处理72 h，防止种子霉变及发芽。
（5）干热+湿热处理法：先将待脱毒处理的辣椒种子置于烘箱内，在70 ℃条件下，热风处理48 h；之后将种子浸于5倍体积的沸水中，并迅速震荡冷却至40-45 ℃；滤干水溶液后及时将处理种子放于网架上置于烘箱内，40 ℃处理72 h，防止种子霉变及发芽。
（6）干热+10%Na3PO4处理法：先将待脱毒处理的辣椒种子置于烘箱内，在70 ℃条件下，热风处理48 h；之后用10%Na3PO溶液浸种40 min；药剂处理结束后，滤去10%Na3PO4溶液，用无菌水清洗辣椒种子3-5次；滤干水溶液后及时将处理种子放于网架上置于烘箱内，40 ℃处理72 h，防止种子霉变及发芽。
（7）湿热+10%Na3PO4处理法：先将待脱毒处理的辣椒种子浸于5倍体积的沸水中，并迅速震荡冷却至40-45 ℃，滤干水溶液；之后在滤干水溶液辣椒种子中加入5倍体积的10%Na3PO4溶液，浸泡40 min；药剂处理结束后，滤去10%Na3PO4溶液，用无菌水清洗辣椒种子3-5次；滤干水溶液后及时将处理种子放于网架上置于烘箱内，40 ℃处理72 h，防止种子霉变及发芽。
（8）对照：以未脱毒处理的带毒辣椒种子作为对照。
2. 病毒检测：
（1）提取辣椒种子总RNA
随机选取10粒脱毒处理的种子和10粒未脱毒处理的种子，各为1份，分别在液氮中研磨至粉末，采用植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA。抽提RNA产物加入DEPC-ddH2O溶解，-70 ℃保存备用。
（2）cDNA的合成
以提取的待测辣椒种子总RNA为模板，反转录制备cDNA模板。反转录体系为20 µL包括：RNA模板2 µL，10 mmol/L的dNTPs 2 µL，10 µmol/L的随机引物2 µL，10×RT mix 2 µL，Quant Reverse Transcriptase 2 µL，RNase-free ddH2O 10 µL。反应条件：37 ℃，60 min。
（3）实时荧光定量PCR检测
以合成的cDNA为模板，利用BBWV2特异性引物对：BBWV2-F:5’-TCGTACTGAAGTCCATCTTAAAA-3’；BBWV2-R:5’-CGGAAAAAGGGAGTGTGATT-3’及TaqMan探针：BBWV2-Probe: 5’-TET-AGGTAGCAAAATGAAATCA-BHQ1-3’进行实时荧光定量PCR检测。
实时荧光定量PCR检测体系为20 µL：包括2×Master Mix（Probe）10 µL，10 µmol/L的上游引物BBWV2-F 0.6 µL、10 µmol/L的下游引物BBWV2-R 0.6 µL，10 µmol/L的TaqMan探针BBWV2-Probe 0.4 µL，模板1 µL，补足灭菌ddH2O至20 µL。荧光定量PCR检测反应程序为：50 ℃预处理2 min；95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火、延伸1 min，循环40次；60 ℃收集荧光。
（4）定量检测
反应结束后记录各检测样品的PCR扩增曲线Ct值，通过建立的BBWV2实时荧光定量PCR反应的标准曲线方程：y=-3.5617x+48.189，x为所测样品中BBWV2目标基因片段拷贝数的对数，y为Ct值。计算出检测样品中BBWV2的基因片段拷贝浓度，从而对辣椒种子中BBWV2含量进行定量检测。
（5）计算种子脱毒率
种子脱毒率（%）=（1-处理后种子的带毒量/未处理种子带毒量）×100。
3.结果与分析
实时荧光定量PCR检测结果显示（见附图1），经干热+10%Na3PO4法和湿热+10%Na3PO4法处理的辣椒种子中BBWV2检测结果为阴性，其余不同脱毒方法处理的辣椒种子BBWV2检测结果均为阳性。根据各处理的反应Ct值利用BBWV2标准曲线方程对辣椒种子中的病毒含量进行精确定量，进而计算各处理脱毒率，结果（见表1）显示不同脱毒方法处理的种子中所含BBWV2的量较对照都有减少，两种方法组合处理种子的脱毒效果要比用单一方法好，其中干热+10%Na3PO4处理法和湿热+10%Na3PO4处理法的脱毒效果较最为理想，脱毒率均达到100%。
表1 不同脱毒方法对辣椒种子中BBWV2的脱毒效果
实施例2. 几种脱毒方法对辣椒种子发芽率及发芽势的影响
随机选取实施例1中各脱毒处理及未脱毒处理的辣椒种子各150粒，分为3组，用冷水浸泡4 h后采用培养皿滤纸恒温发芽法，在28℃恒温培养箱中进行种子萌发试验，处理后第3天起逐日观察统计发芽情况，记录发芽数，以第7天各脱毒处理的发芽数测定发芽势，于第10天结束发芽试验。发芽率（%）=（发芽的种子数/供试种子数）×100；发芽势（%）=（规定时间内的种子发芽数/供试种子数）×100。
种子萌发试验结果表明（见表2），对照种子的发芽势及发芽率分别为69%和95%，其中对发芽势、发芽率影响最大的是干热+湿热处理法，处理后的辣椒种子的发芽势、发芽率分别下降为40%和73%。但除干热+湿热处理法外，其它脱毒法处理的辣椒种子较对照的发芽势、发芽率均有所提高，其中湿热+10%Na3PO4处理法的发芽势及发芽率最高分别为83%，99%。
表2 不同脱毒方法对辣椒种子发芽率及发芽势的影响
SEQUENCE LISTING
<110> 新疆农业大学
<120> 一种脱除辣椒种子中蚕豆萎蔫病毒2号的方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcgtactgaa gtccatctta aaa 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cggaaaaagg gagtgtgatt 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aggtagcaaa atgaaatca 19