一种脱除辣椒种子中蚕豆萎蔫病毒2号的方法与流程

文档序号:12304756阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种脱除辣椒种子中蚕豆萎蔫病毒2号的方法,其特征在于通过以下步骤实现:

(1)湿热处理:将辣椒种子浸泡于5倍体积的沸水中,并迅速震荡冷却至40-45 ℃,滤干水溶液;

(2)药剂处理:在滤干水溶液的辣椒种子中加入5倍体积的10%Na3PO4溶液,浸泡40 min;

(3)滤种:药剂处理结束后,过滤种子,滤去10%Na3PO4溶液;

(4)漂洗:用无菌水清洗辣椒种子3-5次,滤干无菌水;

(5)烘干:及时将步骤4中得到的种子放于网架上置于烘箱内,40 ℃处理72 h,防止种子发芽及霉变;

(6)病毒检测:利用TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法对步骤5获得的种子进行病毒检测,并根据PCR扩增曲线Ct值和标准曲线方程即可对辣椒种子中的蚕豆萎蔫病毒2号进行精确定量,计算脱毒率。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的病毒检测具体步骤如下:

(1)提取辣椒种子总RNA:随机选取10粒脱毒处理的种子和10粒未脱毒处理的种子,各为1份,分别在液氮中研磨至粉末,采用植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA,抽提RNA产物加入DEPC-ddH2O溶解,-70 ℃保存备用;

(2)cDNA的合成:以提取的待测辣椒种子总RNA为模板,反转录制备cDNA模板,反转录体系为20 µL包括:RNA模板2 µL,10 mmol/L的dNTPs 2 µL,10 µmol/L的随机引物2  µL,10×RT mix 2 µL,Quant Reverse Transcriptase 2 µL,RNase-free ddH2O 10  µL;反应条件:37 ℃,60 min;

(3)实时荧光定量PCR检测:以合成的cDNA为模板,利用BBWV2特异性引物对:BBWV2-F:5’-TCGTACTGAAGTCCATCTTAAAA-3’;BBWV2-R:5’-CGGAAAAAGGGAGTGTGATT-3’及TaqMan探针:BBWV2-Probe: 5’-TET- AGGTAGCAAAATGAAATCA-BHQ1-3’进行实时荧光定量PCR检测;实时荧光定量PCR检测体系为20 µL:包括2×Master Mix(Probe)10 µL,10 µmol/L的上游引物BBWV2-F 0.6 µL、10 µmol/L的下游引物BBWV2-R 0.6 µL,10 µmol/L的TaqMan探针BBWV2-Probe 0.4 µL,模板1 µL,补足灭菌ddH2O至20 µL;荧光定量PCR检测反应程序为:50 ℃预处理2 min;95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s,58℃退火、延伸1 min,循环40次;58 ℃收集荧光;

(4)带毒量检测:反应结束后记录检测样品的PCR扩增曲线Ct值,通过建立的蚕豆萎蔫病毒2号实时荧光定量PCR反应的标准曲线方程:y=-3.5617x+48.189,x为所测样品中蚕豆萎蔫病毒2号目标基因片段拷贝数的对数,y为Ct值,计算出检测样品中蚕豆萎蔫病毒2号的基因片段拷贝浓度,从而对辣椒种子中蚕豆萎蔫病毒2号含量进行定量检测;

(5)计算种子脱毒率:种子脱毒率(%)=(1-处理后种子的带毒量/未处理种子带毒量)×100。

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