本发明属于作物种质资源学领域，涉及一种模拟大豆种子自然老化的人工老化方法，具体地讲是采用高温低湿无氧的人工老化方法模拟大豆种子自然老化。
背景技术：
大豆(Glycine max(L.)Merr.)在我国人民日常生活和国民经济体系中具有举足轻重的地位，是人类重要的营养和保健食品。大豆籽粒的蛋白质含量为40％左右，约为其他植物的1～6倍，除蛋氨酸和胱氨酸含量较低外，其他人体必需的氨基酸含量都较高。因此，大豆蛋白对谷物蛋白有较好的增补效果，是仅次于动物蛋白的理想食品。大豆不仅是重要的植物蛋白来源，也是重要的油料作物，籽粒中脂肪含量含量在20％左右，其不饱和脂肪酸含量丰富，占脂肪酸总量的80％～88％，其中，亚油酸52％～65％，油酸20％，亚麻酸10％，饱和脂肪酸含量较少，仅占13％左右。大豆不饱和脂肪酸能降低血液中的胆固醇，对高血压和心脑血管等疾病都有很好的辅助疗效。除蛋白质和脂肪外，大豆中还含有β胡萝卜素、核黄素、异黄酮和磷脂等成分，在维持人类的身体健康和植物的抗性等方面起着十分重要的作用。大豆种质资源是大豆新品种选育和生物技术研究的重要物质基础，也是大豆生产持续发展的基本保证。我国是世界保存大豆种质资源数量最多的国家，约35000余份，这些材料是我国大豆遗传研究和作物育种的宝贵财富。
目前，低温种质库是大豆种质资源保存的主要途径。然而，种子在低温种质库中保存并非一劳永逸，随着保存时间的延长，其生活力会不断的下降。当种质库中的种子发芽率降到一定程度，或由于生活力监测及对外供种的消耗使得贮藏样品的数量减少时，需要对库存大豆进行繁殖更新。大豆种子在保存期间和繁殖更新后不可避免受到种子老化及繁殖世代等因素地影响而发生遗传完整性变化。种质遗传完整性是指种质群体的遗传结构得到完全的保持，包括基因型频率分布及等位因频率分布和其原始群体一样，保持不变。维持种质遗传完整性就是种质在贮藏过程中保持最低程度的遗传改变，在繁殖更新过程中要保持子代与亲代具有最大程度的遗传相似性，这是种质安全保存工作的核心课题。在进行种质遗传完整性研究时需要不同生活力的种子作为试验材料。获得不同生活力种子的最佳方法就是保存在低温种质库内经过不同保存年限后而发生自然老化的种质材料，但是自然老化需时较长，在实际研究中难以满足试验材料需求。目前常采用人工老化方法代替自然老化，人工老化可以克服自然老化需时较长的缺点，而被广泛应用于种质遗传完整性研究、种子衰老生物学研究以及种子耐贮性研究。常用的人工老化方法为高温高湿有氧老化法(40℃，100％RH)。
高温高湿有氧老化法(40℃，100％RH)虽然可以模拟自然老化，但也有其弊端和缺点，例如，人工老化处理过程中，由于湿度太大，种子易受微生物侵染而易发生霉烂。而且，最重要地是高温高湿人工老化法与自然老化法相比，能否准确地反映出大豆种子的生活力变化和种质遗传完整性变化以及二者之间的对应关系值得商榷。为此，需要开发更好的人工老化方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种模拟大豆种子自然老化的人工老化方法，通过高温、低湿和无氧的人工老化方法，能最大程度地模拟大豆种子的自然老化，并应用于大豆种质遗传完整性研究、种子衰老生物学研究以及种子耐贮性等研究。本发明可为以上研究提供不同生活力种子试验材料的制备技术与方法。
为此，本发明所采用的技术方案是：一种模拟大豆种子自然老化的人工老化方法，采用高温低湿无氧法，先将大豆种子在相对湿度为44～45％，温度为24～25℃条件下进行种子含水量平衡，种子含水量平衡至7.4％±0.1％，然后无氧条件下在人工老化箱内39～40℃恒温老化处理，处理顺序采用倒序法。
具体步骤如下：
1、种子准备：以播种、田间管理、收获及成熟度一致的大豆种子为试验材料，至少10000粒；
2、种子含水量平衡：将大豆种子放入人工气候箱中进行种子含水量平衡，平衡条件是相对湿度为44～45％，温度为24～25℃，时间为15天，使处理种子的含水量处于7.4％±0.1％，若种子含水量达不到此标准，相同条件下继续平衡；
3、真空密封包装：用真空包装机将种子含水量达到要求后的大豆种子铝箔袋密封包装，并抽真空至-0.1MPa，平均分成若干份处理，每份约1000粒种子。
4、倒序人工老化：每隔2周进行一个处理的人工老化试验，将铝箔袋放置于人工老化箱内恒温老化，温度为39～40℃。由于种子密封于铝箔袋内，因此对湿度无特殊要求。采用倒序法进行，即人工老化时间最长的处理先进行老化，人工老化时间最短的最后进行老化，试验结束时一起取出，避免系统误差。
5、温度再平衡：人工老化结束后在24～25℃下，将所有处理密封平衡2天，以利于之后的发芽试验。
参考GB/T3543.4农作物种子检验规程中的标准条件，将对照与经过不同老化时间的处理进行发芽试验，并统计发芽率。
本发明进一步将通过此种人工老化方法得到的大豆种子与通过高温高湿有氧方法人工老化得到种子以及库存条件下自然老化的种子进行种质遗传完整性分析，并将两种人工老化方法得到的遗传完整性参数与库存条件下自然老化得到的遗传完整性参数分别进行对比分析。通过对比分析得出结论：本发明高温低湿无氧的人工老化方法能最大程度模拟自然老化。需要指出地是两种人工老化方法得到的试验材料必须与自然老化得到的种子是同一个品种，而且其发芽率必须一致，否则没有可比性。
现有研究表明贮藏湿度、贮藏温度和氧气是影响种子寿命的主要环境因素：
1、湿度：种子含水量是影响贮藏种子寿命的最关键因素。当贮藏湿度较高时，种子将会吸湿而使水分增加。当种子中出现自由水时，种子的呼吸强度激增，同时使种子中的酶得以活化，使各种生理过程尤其是物质的分解过程加速进行，种子寿命短。反之，空气相对湿度较低时，种子的含水量较少，种子寿命长。
2、温度：贮藏温度是影响种子寿命的另一个关键因素。在水分得到控制的情况下，贮藏温度越低，正常型种子的寿命就越长。低温状态下，贮藏的种子呼吸作用非常微弱，物质代谢水平特别缓慢，能量消耗极少，细胞内部的衰老变化也降到最低程度，从而能较长时间保持种子生活力不衰而延长种子寿命。相反，若种子贮藏温度较高，呼吸作用强烈，造成营养物质大量消耗，仓虫和微生物活动加强以及脂质的氧化和变质。严重时可引起蛋白质变性和胶体的凝聚，使种子的生活力迅速下降。种子含水量和贮藏温度在影响种子寿命时存在互作效应。种子含水量高，但贮藏温度较低时，种子寿命仍较长；种子含水量高且贮藏温度较高时，种子寿命较短。
3、氧气：氧气会促进种子呼吸作用，加速了种子内部物质的消耗及有害物质的积累，不利于种子的安全贮藏。相反，增加氮气、氦气、氩气和二氧化碳等气体的浓度，降低氧气浓度，不但能有效地抑制仓虫和微生物活动，从而延长种子的寿命。
低温种质库中种子的贮藏条件通常为温度-4～-18℃，相对湿度低于45％，铝箔袋或铝盒无氧保存。低温种质库中的种子处于低温低湿无氧条件下，种子的生命活动维持在最弱的状态下，因此种子的寿命得以延长。高温高湿有氧条件下种子可以迅速老化，发芽率可以在短期内降到0，但是能否最大程度地模拟自然老化值得商榷。高温高湿无氧条件下，呼吸旺盛的种子会被迫转入缺氧呼吸，因而产生大量的二氧化碳和酒精，使种子很快窒息死亡，故不宜采用。
因此，本发明基于影响种子寿命的三大环境因素以及库存种子的自然老化条件，提出利用高温低湿无氧的人工老化方法最大程度地模拟自然老化。本发明提出的人工老化方法与库存种子自然老化条件最大的不同在于温度，前者的温度为40℃，而后者的温度通常为-4～-18℃。大豆种子在高温低湿无氧的环境下的老化速度虽然低于高温高湿有氧人工老化法(40℃，100％RH)，但是老化速度却远高于低温种质库贮藏条件下的自然老化速度。因此，可以大大加速老化速度，在短时间内得到研究所需的试验材料，同时，可以最大程度上地模拟自然老化。
本发明具有如下有益效果：
本发明提出采用高温低湿无氧的一整套人工老化方法，用于模拟大豆种子在库存条件下自然老化过程。通过此种人工老化方法老化的大豆种子，经过遗传完整性检测后与自然老化种子之间的差异远比常规的高温高湿有氧条件下人工老化的种子小得多。因此，本发明人工老化方法优于现有高温高湿有氧人工老化法，且完全可以代替高温高湿有氧人工老化法，用于种质遗传完整性研究时试验材料的制备。
具体实施方式
下面结合具体试验方法对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一模拟大豆育成品种种子自然老化的人工老化方法
1、试验材料：以大豆齐黄27种子为试验材料。
2、试验方法：
(1)分别选取库存条件下(温度为-4℃，相对湿度为45％，种子含水量为7.5％，铝箔袋密封)保存0年、5年、9年和12年的1000粒大豆齐黄27种子作为研究对象，以保存0年的处理为对照。参考GB/T3543.4农作物种子检验规程中的标准条件进行发芽试验，并统计发芽率(表1)。
(2)利用本发明高温低湿无氧方法对大豆齐黄27种子进行人工老化，具体步骤如下：
①种子准备：以播种、田间管理、收获及成熟度一致大豆齐黄27种子(约10000粒)为试验材料。
②种子含水量平衡：将大豆齐黄27种子放入人工气候箱中进行种子含水量平衡，平衡条件是相对湿度为44～45％，温度为24～25℃，时间为15天，使处理种子的含水量处于7.4％±0.1％，若种子含水量达不到此标准，相同条件下继续平衡；
③真空密封包装：用真空包装机将种子含水量达到要求后的大豆种子铝箔袋密封包装，并抽真空至-0.1MPa，平均分成若干份，每份约1000粒种子。
④倒序人工老化：每隔2周进行一个处理的人工老化试验，将铝箔袋放置于人工老化箱内恒温老化，温度为39～40℃，相对湿度没有要求。采用倒序法进行，即人工老化时间最长的处理先进行老化，人工老化时间最短的最后进行老化，试验结束时一起取出。人工老化时间视所需的发芽率梯度而定。以未经老化的处理为对照。
⑤温度再平衡：人工老化结束后在24～25℃下，将所有处理再次平衡2天，以利于之后的发芽试验。
参考GB/T3543.4农作物种子检验规程中的标准条件，将对照与经过不同老化时间的处理进行发芽试验，并统计发芽率(表1)。
(3)利用高温高湿有氧方法对大豆齐黄27种子进行人工老化，具体步骤如下：
①种子准备：将播种、田间管理、收获及成熟度一致大豆齐黄27种子(约10000粒)为试验材料。
②种子含水量平衡：将大豆齐黄27种子放入人工气候箱中进行种子含水量平衡，平衡条件是相对湿度为74～76％，温度为24.5～25.5℃，时间为15天，使处理种子的含水量处于同一水平，12.9～13.1％，若种子含水量达不到此标准，相同条件下继续平衡；
③包装：种子含水量平衡达到要求后，用纱网带包装，平均分成若干份，每份约1000粒种子。
④人工老化：将纱网带放置于人工老化箱内恒温老化，温度为39.5～40.5℃，相对湿度为100％。所有处理同时放入，按处理时间需要每天取出一个处理，以未经老化的处理为对照。
参考GB/T3543.4农作物种子检验规程中的标准条件，将对照与经过不同老化时间的处理进行发芽试验，并统计发芽率(见表1)。
需要指出地是利用高温低湿无氧以及高温高湿有氧的人工老化方法处理的是同一批大豆齐黄27，以此消除系统误差，从而保证实验结果的准确性和可靠性。此外，三种老化方法所得处理的发芽率梯度必须大体一致，否则失去比较的意义。
表1三种老化方法下大豆齐黄27种子的发芽率
(4)将三种老化方法得到的不同生活力处理的大豆齐黄27进行田间繁殖更新，每个处理定植200株，以保证种植密度一致，并进行单株编号，按照编号选取96个单株，采集幼嫩叶片，-80℃下保存备用。
(5)基因组DNA提取：采用SDS法单株提取各个处理的基因组DNA。提取步骤为：
①将大豆幼嫩叶片用镊子放入2.0mL离心管中，每管加入一粒直径5mm的钢珠后，进行下一步操作或-80℃备用；
②将离心管迅速放入液氮中冷却，装入组织研磨仪中将叶片打碎，时间为30s，频率为50Hz，注意动作要迅速，之后取出离心管加入1mL的SDS提取液，提取液事先放入65℃水浴中预热，抑制DNA酶，加速蛋白质变性，促进DNA溶解，然后向离心管中加入10μL的巯基乙醇，抑制酚氧化为醌，充分混匀，也可剧烈震荡；
③将离心管放入65℃水浴中保温1小时，水浴过程中每10分钟摇动一次；
④待样品冷却至室温后，加入1/5体积的5MKAc，冰水混合物中放置30分钟；
⑤12000g离心10分钟后，吸取1000μL上清液加入到另一2.0mL离心管中，在每管中加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇溶液，体积比为25：24：1，充分振动15分钟后，12000g离心15分钟；
⑥吸取800μL上清液加入到另一2.0mL离心管中，加入10μLRNA酶(10mg/μL)溶液，37℃水浴1小时或-4℃过夜；
⑦每管中加入800μL的氯仿/异戊醇溶液，体积比为24：1，充分振动15分钟后，12000g离心15分钟；
⑧吸取600μL上清液加入到另一2.0mL离心管中，每管加入0.6～1.0体积的异丙醇，轻轻混匀后置于-20℃下30分钟，12000g离心10分钟，收集沉淀；
⑨加入1mL75％乙醇冲洗2次后，再用1mL无水乙醇冲洗1次，置于真空离心机中，将DNA吹干至无酒精味，加入100μL1×TE溶解；
⑩样品在4℃备用，多余样品置于-20℃下长期保存。
(6)SSR引物扩增及聚丙烯酰氨凝胶检测：采用40对SSR核心引物(选取自王栋等，SSR标记分析种子老化及繁殖世代对大豆种质遗传完整性的影响，植物遗传资源学报2010，11(2)：192-199。每个连锁群上分布两个位点，如表2所示)，对不同生活力的处理基因组DNA进行PCR扩增，采用6％聚丙烯酰氨凝胶电泳分离扩增产物，功率75W，时间为50min，电泳结束后银染法检测。
表2大豆齐黄27遗传完整性分析40对SSR核心引物
①PCR扩增反应体系为：Premix TaqTM(TaKaRa TaqTM Version2.0)10.0μL，5.0μmol/L Primer pairs(1.0+1.0)μL，20.0ng/μL DNA 5.0μL，ddH2O 3.0μL，总体系为20.0μL。
②PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min；95℃变性45s，47℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。温度降至4℃时取出，4℃冰箱内保存备用。
③银染法检测步骤为：
a、固定：电泳后将平板放入固定液(10％的乙醇和0.5％的冰醋酸)中，轻轻摇动12分钟至指示剂无色；
b、银染：将平板放入银染液(0.2％AgNO3)中，轻轻摇动12分钟；
c、水洗：从银染液中取出平板，用去离子水洗涤10秒；
d、显影：将水洗后的平板放入显影液(1.5％NaOH和0.4％甲醛)中，轻轻摇动，显色至所要的程度；
e、终止显影：将平板放入10％的冰醋酸中，轻摇1～2分钟；
f、冲洗：将平板放入去离子水中，冲洗1分钟；
g、干燥：将冲洗好的平板置于室温下自然干燥。
(7)结果统计及分析：根据检测结果，利用POPGENE version 1.31和Powermarker V3.25等软件对大豆齐黄27通过三种老化方法的各个处理进行遗传结构分析，计算出各个处理的各位点等位基因频率、每位点等位基因数、遗传多样性指数和香农指数，并利用SAS 9.1对各处理与对照之间的各位点等位基因频率进行χ2检验，对每位点等位基因数、遗传多样性指数和香农指数进行显著性t检验。
①等位基因频率差异分析
表3三种老化方法下大豆齐黄27处理间等位基因频率差异分析
从表3可以看出，库存条件下发芽率为81.6％、65.5％和31.2％的处理A-2、A-3和A-4与发芽率为98.3％的对照A-1相比，等位基因频率显著差异和极显著差异的位点个数及其占总位点个数百分比，随着生活力的下降而增加，其中，位点个数分别为1个、5个、7个和0个、1个、3个；占总位点个数百分比分别为2.50％、12.50％、17.50％和0、2.50％、7.50％。利用高温低湿无氧方法人工老化方法的发芽率为82.5％、66.7％和32.3％的处理B-2、B-3和B-4与发芽率为97.1％的对照B-1相比，等位基因频率显著差异和极显著差异的位点个数及其占总位点个数百分比，随着生活力的下降而增加，趋势与自然老化方法一致，其中，位点个数分别为1个、6个、8个和0个、1个、3个；占总位点个数百分比分别为2.50％、15.00％、20.00％和0、2.50％、7.50％，这几项指标与自然老化方法所得数据基本相同。利用高温高湿有氧方法人工老化的发芽率为81.8％、63.9％和35.1％的处理C-2、C-3和C-4与发芽率为97.1％的对照C-1相比，等位基因频率显著差异和极显著差异的位点个数及其占总位点个数百分比，随着生活力的下降而增加，趋势与自然老化方法同样一致，但是位点个数分别为5个、10个、15个和2个、4个、6个；占总位点个数百分比分别为12.50％、25.00％、37.50％和5.00％、10.00％、15.00％，这几项指标与自然老化方法所得数据相比相差较大。因此，高温低湿无氧人工老化方法与高温高湿有氧人工老化方法相比，所得试验结果与自然老化方法具有更高的一致性，完全可以模拟自然老化用于大豆遗传完整性研究。
②群体遗传结构分析
表4三种老化方法下大豆齐黄27群体遗传结构
注：*表示5％水平上显著差异；**表示1％水平上显著差异
从表4中可以看出，经过三种方法老化后，每个发芽率梯度处理的各项遗传多样性参数均低于各自老化方法的对照，而且每种老化方法的时间愈长，生活力水平愈低，其各项遗传多样性参数也愈低。t检验结果显示，库存条件下经过自然老化的处理A-2，其遗传多样性参数A、H和I与自身对照A-1相比略有下降，但差异不显著。处理A-3和A-4的遗传多样性参数A、H和I与A-1相比，下降幅度较大，达到差异显著或极显著水平，表明经过自然老化，发芽率为65.5％和31.2％的处理因自身生活力下降，其群体遗传结构发生显著或极显著变化。经过高温低湿无氧方法老化的处理B-2，其遗传多样性参数A、H和I与自身对照B-1相比也是略有下降，差异不显著。处理B-3和B-4的A、H和I等3项参数与B-1相比，下降幅度较大，达到差异显著或极显著水平，表明经过高温低湿无氧方法老化，发芽率为66.7％和32.3％的处理同样因生活力下降，其群体遗传结构发生显著或极显著变化，这与自然老化的结果极为相似。经过高温高湿有氧方法老化的处理C-2，其遗传多样性参数A、H和I与自身对照C-1相比下降较大，达到差异显著水平。处理C-3和C-4的A、H和I等3项参数与C-1相比，下降幅度更大，已经达到差异极显著水平，表明经过高温高湿有氧方法老化，发芽率为81.8％的处理因生活力下降，其群体遗传结构发生显著变化，发芽率为66.7％和32.3％的处理因生活力下降，其群体遗传结构发生极显著变化。这一变化趋势与自然老化的趋势不一致，自然老化下发芽率为81.6％的处理，其遗传结构未发生显著变化。因此，高温高湿有氧的人工老化方法加速了大豆齐黄27的遗传结构变化，而经过高温低湿无氧的人工老化方法处理的大豆齐黄27，其遗传结构变化与自然老化下的基本一致。
综上所述，等位基因频率差异分析与群体遗传结构分析的结果都表明，高温低湿无氧的人工老化方法所得试验数据与自然老化方法所得试验数据基本一致。而经过高温高湿有氧方法老化处理的群体遗传结构发生变化与自然老化不一致。因此，高温低湿无氧人工老化可以最大程度模拟自然老化，用于大豆种质遗传完整性研究。
实施例二模拟大豆地方品种大黄豆种子自然老化的人工老化方法
1、试验材料：以大豆地方品种大黄豆种子为试验材料。
2、试验方法：同实施例一。
试验结果与实施例一一致，表明高温低湿无氧老化方法与高温高湿有氧老化方法相比，所得试验结果与自然老化方法具有更高的一致性。
说明本发明方法适用于不同的大豆种质材料，且不受时间和地域的限制。
本发明以大豆齐黄27和大豆地方品种大黄豆种子为试验材料，采用高温低湿无氧方法对其进行人工老化，并将此人工老化方法与自然老化及高温高湿有氧的人工老化方法同时进行遗传完整性检测，通过对比分析确定了高温低湿无氧的人工老化方法相对于高温高湿有氧老化法，能最大程度地模拟自然老化。此方法兼顾了模拟自然老化的准确性以及进行种子老化所需的时间，因此可代替高温高湿有氧人工老化法用于大豆种质遗传完整性研究，在较短的时间内提供足够的试验材料，并保证试验的准确性和可靠性。