本发明属于真菌的制种领域，具体涉及一种蛹虫草菌种培育的新技术。
背景技术：
蛹虫草子实体[cordycepsmilitaris]又称北冬虫夏草子实体或子座，简称蛹虫草，子囊菌亚门、麦角菌科、虫草属。近年来人工培养子实体遍及城乡，已成为我国的一个新兴产业。
人工培育蛹虫草已实现规模化生产，但在实践生产中，由于蛹虫草的遗传变异显著，菌种长期的无性繁殖和试管转接后会出现退化，表现为子实体固体培养时菌丝体不转色，或转色后不萌发形成子实体，或产生畸形子实体，对实际生产造成极大危害。但无论是专业人员还是专业公司，在栽培实践中往往出现只长菌丝不长草（子实体）、不转色，或草的产量低、质量差等问题。有效成份含量极少且不稳定，不但难以实现标准化生产，甚至使众多生产者绝收破产。究其原因，主要是菌种退化，菌种不能继代使用。菌种往往只能使用一次，勉强继代使用也不超过两代。众多技术人员为防止菌种退化，用尽了各种传统的制种办法，如组织分离优选部位、孢子分离选优、提纯复壮、引进优种、杂交选优等，但始终阻止不了菌种的快速退化。尽管诸多专家学者发表了不少论文意见，但理论要变成实践意义上的生产力尚需要漫长的时间。蛹虫草菌种的快速退化，已成为该产业发展的瓶颈。对广大生产者来说，菌种快速退化问题亟待解决。故经常需要对菌株进行复壮处理以提高菌种活力。
现行的复壮方法包括：组织分离法和孢子弹射法，但对于蛹虫草这种兼性寄生真菌长期人工培养后会出现回接虫体时侵染力降低，对外界不良条件包括低温、高温或病菌侵染的抵抗力下降等问题，本发明方法通过对柞蚕蛹体感染蛹虫草菌丝体的手段来复壮蛹虫草菌株，提高其抗性和生物转化率。
经过专利文献检索：申请号201210376699.2《仿野生蛹虫草的培植方法》，它是利用活体蚕蛹内寄生的方法培养蛹虫草，与本发明目的不同，其次，该发明通过液体菌种喷洒到经灭菌的活蛹体的表面，故侵染方式不同。申请号201210248399.6《培育蛹虫草抗退化菌种的方法》公开一种通过培养与伴生菌一同生长的蛹虫草菌种，得到优胜的蛹虫草菌种后置于低温、高温、缺氧及杂菌生长的环境培养菌种，经培养后的母种再提纯复壮，得到蛹虫草抗退化菌种的技术，与本发明在实现复壮的方式、方法均不同，且实现过程复杂、有一定的技术难度。申请号200910236325.6《一种简易蛹虫草菌种复壮的方法》，该发明蚕蛹进行高压灭菌处理后进行液体菌种接种，相当于无菌条件下接种，成功率自然高，但蚕蛹内的活性成分经高温高压处理后基本失活，对复壮菌种起不到任何作用，故对该发明方法的实际复壮效果持怀疑态度。
经专利文献检索，没有和本发明重叠的“一种复壮蛹虫草菌种的生产方法”，所以提出本发明方法。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明的目的是提供一种复壮蛹虫草菌种的生产方法，达到提高子实体产量、增强虫草子实体有效成分含量、减少因长期人工培养后出现回接虫体时侵染力降低，对外界不良条件包括低温、高温或病菌侵染的抵抗力下降的问题。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：
（1）挑选鲜活完整健康的滞育期柞蚕蛹作为复壮载体；
（2）活体柞蚕蛹表面灭菌采用超声波处理45s，然后用75%酒精处理3-5min，无菌水反复冲洗3-4次，用无菌滤纸将蛹体表面水分吸干；
（3）使用无菌注射器将蛹虫草液体菌种注射到活体柞蚕蛹的胸腔，注射量为0.2-0.6ml，最佳为0.4ml；
（4）将接种完的蚕蛹放入培养箱避光培养，1-3d控温10℃，3d过后调整温度至15℃，直至蛹体僵化；
（5）蛹体僵化后升温至25℃培养；自然光照射培养，相对湿度75-85%，温度为白天25℃，夜里15℃促使子座生成；
（6）通过上述步骤处理，选择复壮后条形整齐、颜色橙黄或橙红、个体高大粗壮的子实体组织分离。制成pda试管母种，即为复壮母种。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）与常规的将活体蚕蛹经高温高压或者长时间烘烤至无菌下接种复壮的方法相比，本发明方法不破坏蛹体内的活性成分，有提高菌种活性、抗性，起到真实的复壮作用；
（2）为提高注射接种后蛹体僵化出草的成功率，减少坏蛹的数量，本发明采用低温分段控温的培养方法，利用低温下杂菌生长速度慢，虫草菌生长速度快的特性，结合温差刺激，有效提高了蛹体僵化出草的成功率；
（3）传统的复壮蛹虫草方法出草率50-60%，新方法出草率80-85%，出草率提高25%左右；（4）本发明方法简单，可操作性强，本技术领域人员可迅速通过本发明方法实现蛹虫草复壮工作；
（5）本发明方法可利用性广泛，可以作为一种采用活蚕蛹生产蛹虫草的方法；
（6）与原始菌株相比，本发明方法复壮后的菌株，生物转化率提高30-50%。
本发明的效果在于：通过无菌注射器对经表面灭菌处理的活体柞蚕蛹接种蛹虫草菌种，采用低温分段控温进行培养，再进入光照转色培育。由于未对蛹体进行高压灭菌处理，蛹体内的生物活性成分未被破坏，有效的对菌种进行了复壮。具有方法简单、成功率高、复壮后的菌株生物转化率高等优点。
具体实施方式
实施例1：
本实施例一种复壮蛹虫草菌种的生产方法如下实施步骤：
（1）挑选鲜活完整健康的滞育期柞蚕蛹100只；
（2）将蚕蛹放入超声波清洗机中处理45s，完成后捞出；
（3）将捞出的蚕蛹放入75%的酒精中灭菌处理5min，完成后捞出；
（4）用大量无菌水反复清洗蚕蛹4次，然后用无菌滤纸吸干表面水分；
（5）在无菌条件下，使用无菌注射器依次在蛹体胸腔位置注射0.3ml液体菌种；
（6）将接种完的蚕蛹放入培养箱避光培养，1-3d控温10℃，3d过后调整温度至15℃，直至蛹体僵化；
（7）蛹体僵化后升温至25℃培养；自然光照射培养，相对湿度75-85%，温度为白天25℃，夜里15℃促使子座生成；
（8）共出草蛹体数82只，18只未僵化或坏蛹，成功率82%。
（8）选择复壮后条形整齐、颜色橙黄或橙红、个体高大粗壮的子实体组织分离。制成pda试管母种，即为复壮母种。
实施例2：
本实施例一种复壮蛹虫草菌种的生产方法如下实施步骤：
（1）挑选鲜活完整健康的滞育期柞蚕蛹200只；；
（2）将蚕蛹放入超声波清洗机中处理45s，完成后捞出；
（3）将捞出的蚕蛹放入75%的酒精中灭菌处理4min，完成后捞出；
（4）用大量无菌水反复清洗蚕蛹4次，然后用无菌滤纸吸干表面水分；
（5）在无菌条件下，使用无菌注射器依次在蛹体胸腔位置注射0.4ml液体菌种；
（6）将接种完的蚕蛹放入培养箱避光培养，1-3d控温10℃，3d过后调整温度至15℃，直至蛹体僵化；
（7）蛹体僵化后升温至25℃培养；自然光照射培养，相对湿度75-85%，温度为白天25℃，夜里15℃促使子座生成；
（8）共出草蛹体数170只，30只未僵化或坏蛹，成功率85%。
（8）选择复壮后条形整齐、颜色橙黄或橙红、个体高大粗壮的子实体组织分离。制成pda试管母种，即为复壮母种。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。