本发明涉及一种抑制美国白蛾生长发育的杨树化合物及该化合物在美国白蛾防治中的应用。特别涉及豆甾醇在抗虫杨树育种及美国白蛾防治中的应用，属于抗虫杨树辅助育种和美国白蛾防治
技术领域：
。技术背景杨树(populusl)是我国三北防护林、农田林网和四旁绿化建设的主要树种，也是纸浆材、人造板等工业用材的重要原料，在经济建设中起着重要作用。我国杨树栽培面积较广，但是由于环境、气候等诸多因素的影响，杨树人工林栽培面临着严重的虫害问题。美国白蛾是一种重要的国际性检疫害虫，具有食性杂、繁殖量大、适应性强、传播途径广等特点。自1979年首次在我国丹东发现以来，已传至河北、天津、山东等诸多省市，给我国林业生产以及生态安全造成了重大损失和潜在威胁。赵铁珍等人(2004年全国美国白蛾疫区的非经济损失评估[j].林业经济问题，2006，26(4)：321-326)评估美国白蛾造成的全国非经济损失总量合计为140.35亿元。由于杨树的大面积栽培，当前美国白蛾已成为危害我国杨树的重要食叶害虫之一。在美国白蛾的常用防治措施中，化学防治见效快、效率高，但对环境污染较大，不利于可持续发展。生物防治对环境污染小，能有效地保护天敌，发挥持续控灾作用，但杀虫效果较慢，在高虫口密度下使用不能完全达到迅速压低虫口的目的。物理防治简单、实用，但具有费时费力、效率低、不易彻底等缺点。化合物是植物抗虫反应的终端执行者，在抗虫过程中发挥着更为重要的作用。植物抗虫化合物可以抑制昆虫的生长发育甚至毒杀昆虫，从而降低昆虫对寄主的危害。利用植物本身杀虫化合物进行防治，有望实现对靶标害虫杀虫效率高，而对非靶标害虫及环境影响较小的目的。目前，已经报道的针对食叶害虫的杨树抗虫化合物主要有，对舞毒蛾(lymantriadisparl.)生长发育具有抑制作用的绿原酸(chlorogenicacid)，对叶甲发挥抗性作用的凝缩类单宁(condensedtannins)，以及对天幕毛虫(malacosomadisstria)取食具有抑制作用的特里杨苷(tremulacin)等。但是，目前还没有针对美国白蛾的杨树抗虫化合物的报道。由于不同昆虫的生理及取食特性存在差异，对其有效的植物抗虫化合物可能会不同。此外，植物的抗虫化合物种类繁多，结构迥异，有必要开展相关研究，以挖掘更多的杨树抗虫化合物。因此，研究对于美国白蛾具有毒杀或发育抑制作用的杨树化合物，对于美国白蛾的有效控制，以及杨树抗虫品种的培育具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的之一是提供一种对于美国白蛾具有毒杀或发育抑制作用的杨树化合物，以便有效控制美国白蛾的发生。本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：一种抑制美国白蛾生长发育的化合物在制备用于防治美国白蛾的产品中的应用，所述化合物为豆甾醇。优选地，所述豆甾醇作为化学农药主要成份，用于美国白蛾的化学防治。本发明的另一目的是提供一种对于美国白蛾具有毒杀或发育抑制作用的杨树化合物，将其用于杨树抗虫辅助育种，可以缩短育种时间，加快育种速度，提高杨树抗虫育种效率。本发明的上述发明目的是通过以下技术方案达到的：一种抑制美国白蛾生长发育的化合物在杨树抗虫辅助育种中的应用，所述化合物为豆甾醇。本发明的抑制美国白蛾生长发育的化合物是通过以下步骤鉴定的：(1)抗虫性测定首先对杨树品种进行美国白蛾抗虫性测定，筛选出抗虫杨树品种和感虫杨树品种；(2)代谢组学分析将抗虫杨树品种和感虫杨树品种的材料在冷冻条件下进行研磨，分别提取总代谢物，干燥后进行衍生化，并对化合物进行gc-tof/ms测定；(3)差异化合物的鉴定通过解卷积、峰面积提取、质谱比对等步骤，获得抗虫杨树品种和感虫杨树品种中化合物的组成及相对含量，通过单维和多维统计分析，筛选抗虫杨树和感虫杨树之间的差异化合物，并将化合物相对含量与幼虫发育历期进行相关分析，鉴定出与美国白蛾抗性相关性高的化合物为杨树叶片中的豆甾醇。所述步骤(3)之后，还可增加如下步骤：(4)差异化合物的验证利用gc/ms及外标法，对抗虫杨树品种36号杨和50号杨，感虫杨树品种中林2025和南抗杨叶片中的豆甾醇的含量进行测定，验证了代谢组学分析结果，即抗虫材料中豆甾醇的含量明显高于感虫材料，豆甾醇的含量与幼虫发育历期呈正相关。所述步骤(1)中所述的杨树品种为14个，筛选出的抗虫品种为36号杨(populusdeltoidescv.‘2ken8’)和50号杨(p.deltoidescv.‘55/56’)，筛选出的感虫品种为中林2025(p.deltoidescv.‘zhonglin2025’)和南抗杨(p.deltoidescv.‘nankang’)。所述步骤(2)中所述对化合物测定所用方法是gc-tof/ms(gc为agilent6890气相色谱，串联leco公司pegasusiii质谱)。有益效果本发明通过较为全面的分析抗虫和感虫材料的化合物差异，结合相关分析，鉴定出豆甾醇是杨树对美国白蛾抗性的主要化合物之一。人工饲料添加实验发现，豆甾醇对美国白蛾幼虫的发育的确具有明显的抑制作用。该化合物可以作为代谢标记物，用于抗虫杨辅助选择，也可以作为农药成份，用于美国白蛾防治，对于杨树抗虫育种及美国白蛾的有效控制具有重要意义。将豆甾醇辅助选择与常规育种技术有效结合，可以缩短育种时间，加快育种速度，提高杨树抗虫育种效率。下面通过附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。附图说明图1为添加豆甾醇的人工饲料对美国白蛾幼虫发育历期的影响。具体实施方式实施例1与杨树抗美国白蛾性状相关联的化合物的鉴定方法，其步骤如下：(1)抗虫性测定采用扦插的方式将14个生产中广泛栽培的杨树品种(见下表1)种植到同一苗圃中，生长至2年生树苗时进行美国白蛾抗虫性测定。将杨树叶片放置冰盒中，带回昆虫培养间(25±1℃；14小时光照)，装入昆虫培养瓶内(底径＝12cm；高度15cm)。将美国白蛾2龄初幼虫，放入装有杨树叶片的培养瓶中，每瓶放30头。每隔3天换一次新鲜叶片，饲喂美国白蛾至化蛹。期间，统计美国白蛾各龄幼虫体重、幼虫发育历期、化蛹率及死亡率。每个品种设置3次重复。统计结果显示，美国白蛾幼虫死亡率在所测品种之间没有显著差异，但幼虫发育指标、化蛹率及蛹重差异显著(见下表2)。根据美国白蛾的发育指标判断杨树品种对该虫的抗性程度。从中选出较抗美国白蛾的36号杨(populusdeltoidescv.‘2ken8’)和50号杨(p.deltoidescv.‘55/56’)，较感美国白蛾的中林2025(p.deltoidescv.‘zhonglin2025’)和南抗杨(p.deltoidescv.‘nankang’)。表1用于抗虫性测试的杨树品种品种名称拉丁名来源36号杨populusdeltoidescv.‘2ken8’中国林业科学研究院林业研究所保存50号杨p.deltoidescv.‘55/56’中国林业科学研究院林业研究所保存南杨p.deltoidescv.‘nanyang’中国林业科学研究院林业研究所培育中林2025p.deltoidescv.‘zhonglin2025’中国林业科学研究院林业研究所培育丹红杨p.deltoidescv.‘danhong’中国林业科学研究院林业研究所培育全红杨p.deltoidescv.‘quanhong’河南省林业科学研究院培育南抗杨p.deltoidescv.‘nankang3号’中国林业科学研究院林业研究所培育欧洲黑杨populusnigral.中国林业科学研究院林业研究所保存107杨p.×euramericanacv.‘neva’中国林业科学研究院林业研究所保存108杨p.×euramericanacv.‘guariento’中国林业科学研究院林业研究所保存欧美杨2012杨p.×euramericanacv.‘por’中国林业科学研究院林业研究所保存109杨p.deltoides×p.albacv.‘mincio’中国林业科学研究院林业研究所保存森海1号p.deltoides×p.cathayanacv.‘senhai1’中国林业科学研究院林业研究所培育森海2号p.deltoides×p.cathayanacv.‘senhai2’中国林业科学研究院林业研究所培育表2取食不同杨树品种的美国白蛾幼虫发育指标统计注：同列数据中肩标小写字母完全不同的，表示差异显著(p＜0.05)(2)代谢组学分析将较抗美国白蛾的36号杨(populusdeltoidescv.‘2ken8’)和50号杨(p.deltoidescv.‘55/56’)，较感美国白蛾的中林2025(p.deltoidescv.‘zhonglin2025’)和南抗杨(p.deltoidescv.‘nankang’)的叶片100mg在液氮中研磨后，加入2ml提前保存于-20℃的提取混合溶液1(甲醇：氯仿：水＝2.5：1：1(v：v：v))中，并加入10μl的十九烷酸(2mg/ml)和50μl的核糖醇(0.2mg/ml)分别作为脂相和甲醇/水相内标，放置摇床上220rpm充分混合30min，然后11000g/min离心10min，转移上清至干净的10ml离心管中，得第一次上清液；沉淀中加入1ml保存于-20℃的溶液2(甲醇：氯仿＝1：1(v：v))，放置摇床上220rpm充分混合30min，11000g/min离心10min；收集第二次上清液，并与第一次收集的上清液合并，加入500μl灭菌后的去离子水，5000g/min离心3min；然后，分别将上层甲醇/水相溶液和下层氯仿相溶液转移至干净的离心管中；甲醇/水相溶液用真空冷冻干燥仪干燥，氯仿相溶液用氮气吹干；干燥后的样品放-80℃备用，或直接进行衍生化；加入50μl用吡啶溶解的甲氧氨基盐酸盐(20mg/ml)，密封，涡旋，短暂离心；30℃温浴90min；加入80μl硅烷化试剂n-甲基-n-(三甲基硅烷)－三氟乙酰胺(n-methyl-n-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide，mstfa)，37℃温浴30min；衍生化后的样品室温放置2h后，进行gc-tof/ms检测；gc为agilent6890气相色谱，串联leco公司pegasusiii质谱；气相色谱柱为db-5ms(j&wscientific,folsom,ca,usa)，载气为氦气，流速1.5ml/min；氯仿相采用不分流模式，起始柱温为80℃，维持4min，然后以5℃/min速度升到330℃，保持5min；甲醇/水相升温程序为，起始柱温80℃，维持4min，以4℃/min速度到260℃，保持1min，再以20℃/min速度到320℃，保持3min。采用1:10分流比；进样口温度250℃，离子源温度200℃，谱图延迟采集5min，质荷m/z检测范围70～600，每秒钟扫描20张谱图，检测电压1700伏，ei电子轰击能量70ev。(3)差异化合物的筛选利用chromatof软件对质谱数据进行峰平滑去噪、基线校正、峰对齐等前处理，并经解卷积后提取质谱数据；将质谱信息提交到到美国国家标准与技术研究院质谱库﹙nationalinstituteofstandardsandtechnology，nist)代谢物数据库，通过质谱信息比对，鉴定代谢物，获得抗/感品种的代谢物组成及其相对含量；利用simca-p+软件对质谱数据进行模型判别分析，基于pls-da模型筛选出抗虫和感虫品种之间的差异化合物；利用spss17.0软件统计分析，在单维统计水平进一步验证差异化合物；将差异代谢物和抗虫性状幼虫发育历期和幼虫体重进行pearson相关分析，鉴定出豆甾醇是与抗虫性状相关性较高的化合物之一；(4)差异化合物的验证采用外标法对抗虫和感虫品种叶片中豆甾醇含量进行绝对定量；称取购买的豆甾醇标准品1.2mg，加入10ml容量瓶中，摇匀定容至刻度线，制成母液；取适量母液，加乙醇逐级稀释至母液浓度的1/10、1/2、1、5、10倍，配制成豆甾醇的梯度溶液；利用安捷伦气质联用仪(gc–ms，6890n-5973n)进行标准曲线绘制及样品含量测定；气相色谱柱为db-5ms(j&wscientific，folsom，ca，usa)，载气为氦气，流速1.5ml/min；采用1:10分流模式，起始柱温80℃，维持4min，以4℃/min速度到260℃，保持1min，再以20℃/min速度到320℃，保持3min。；进样口温度250℃，离子源温度200℃，谱图延迟采集5min，质荷m/z检测范围70～600，每秒钟扫描20张谱图，检测电压1500伏，ei电子轰击能量70ev；以豆甾醇的峰面积(a)对应的浓度(c)进行线性回归分析；结果表明，标准曲线在考察质量浓度范围(0.0012mg/ml～1.2mg/ml)内呈线性关系，相关系数为0.9992；利用该方法对抗虫和感虫品种叶片中豆甾醇含量进行了测定；分别以所测含量的0.5倍、1倍和1.5倍进行回收率的计算，回收率在80.4％到94.9％之间。在相同条件下，对同一样品进行6次平行测试，结果如下表3所示，36号杨(populusdeltoidescv.‘2ken8’)，50号杨(p.deltoidescv.‘55/56’)，中林2025(p.deltoidescv.‘zhonglin2025’)，南抗杨(p.deltoidescv.‘nankang’)中豆甾醇的平均含量分别为0.35mg/g、0.25mg/g、0.07mg/g和0.03mg/g。抗虫杨树品种中该物质的含量明显高于感虫杨树品种，含量变化趋势与代谢组学一致，与幼虫发育历期呈正相关。表3杨树叶片中豆甾醇含量与美国白蛾抗性指标相关分析注：**在0.01水平上显著相关实施例2豆甾醇化合物在制备用于防治美国白蛾的产品中的应用以乙醇为溶剂，配制豆甾醇溶液，浓度分别为抗虫品种36号杨叶片含量的0.1倍和1倍，即35μg/ml和350μg/ml。制备美国白蛾人工饲料，并倒入养虫杯中。吸取200μl豆甾醇溶液均匀涂布于人工饲料表面，然后置于通风厨中至乙醇挥发干净。每个昆虫饲养杯放置约100头初孵幼虫，然后于昆虫饲养间内进行饲养(25±1℃；14小时光照)。待昆虫生长至3龄初，将饲养杯中的昆虫头数随机缩减至30头，待生长至4龄后分装成每瓶5头。每隔2天换一次加有豆甾醇的人工饲料，饲喂美国白蛾至化蛹。每个浓度设置4次重复。期间统计美国白蛾幼虫发育历期。结果如图1所示，为取食本发明的豆甾醇添加人工饲料对美国白蛾幼虫发育历期的影响。其中，溶剂对照为不含豆甾醇的乙醇，处理1为豆甾醇添加浓度为35μg/ml；处理2为豆甾醇添加浓度为350μg/ml。从图1中对照及不同浓度处理的幼虫发育历期，可以看到，取食处理2(添加浓度为350μg/ml的豆甾醇)与取食溶剂对照的幼虫发育历期的差异达到极显著水平(**表示p＜0.01)。添加1倍浓度的豆甾醇(添加浓度为350μg/ml的豆甾醇)可以显著延长幼虫发育历期。与溶剂对照相比，在1倍浓度添加下，幼虫发育历期延长5.2天。实施例3豆甾醇在抗虫杨树辅助育种中的应用杨树抗虫品种选育过程中，为保证试验的有效性及准确性，抗虫性测试通常基于1年以上树木进行，且测试过程中要观察至少1个昆虫世代，周期长，费时费力。植物中化合物的含量由基因型决定，本研究通过代谢组学分析、相关分析及抗虫性验证，发现杨树叶片中豆甾醇的含量与美国白蛾抗性呈正相关，因此，可以将豆甾醇作为代谢标记物来预测杨树对美国白蛾的抗性水平。利用豆甾醇进行杨树抗虫辅助选择的实施流程为：通过色谱或质谱仪检测选育个体的叶片中豆甾醇的含量，比较不同个体中该物质含量的高低，进而推测其对美国白蛾的相对抗性水平；将豆甾醇作为代谢标记物进行杨树抗虫育种辅助选择，可以允许早期选择，节省培育过程所浪费的人力、物力和财力；而早期选择的实施，还可以允许把更多的群体纳入研究选择的对象之中，实现更广泛和强度更大的选择；此外，对个体进行的抗虫性评价通常具有破坏性，影响个体后期生长发育；而利用豆甾醇进行辅助选择，只需少量叶片，个体还可继续生长，以便育种工作者同时对该育种群体进行其它性状的选择；因此，将豆甾醇辅助选择与常规育种技术有效结合，可以缩短育种时间，加快育种速度，提高杨树抗虫育种效率。本发明通过较为全面的分析抗虫和感虫材料的化合物差异，结合相关分析，鉴定出豆甾醇是杨树对美国白蛾抗性的主要化合物之一。人工饲料添加实验发现，豆甾醇对美国白蛾幼虫的发育的确具有明显的抑制作用。该化合物可以作为代谢标记物，用于抗虫杨辅助选择，也可以作为农药成份，用于美国白蛾防治，对于杨树抗虫育种及美国白蛾的有效控制具有重要意义。当前第1页12