一种葡寡糖复配制剂及其在马铃薯病害防治中的应用的制作方法

本发明涉及马铃薯病害防治领域，特别是涉及到一种防治马铃薯晚疫病的葡寡糖复配制剂及其应用方法。
背景技术：
：马铃薯是世界第四大作物，由于具有产量高、生育期短、适应性强、营养丰富以及用途广泛等特点，已经逐步成为世界性农业资源和多种工业加工原料。我国是马铃薯种植的第一大国，生产面积和产量均占世界约四分之一。据农业部数据显示，2014年我国马铃薯种植面积已达5570千公顷(8355万亩)。马铃薯生长过程中常受到病虫害危害，对产量和质量造成严重影响。马铃薯晚疫病是其主要病害之一，是一种毁灭性病害，该病流行速度快、危害范围广、能够导致马铃薯茎叶死亡和块茎腐烂。目前该病在世界各马铃薯主产区均有发生和流行，其危害性、防治难度及对社会造成的影响，已超过稻瘟病和小麦锈病，成为全球第一大作物病害，据统计，全球每年因晚疫病造成的经济损失(直接损失和药剂花费)高达30-50亿美元。目前，由于主栽马铃薯品种大多不抗晚疫病，种植者主要采用化学方法防治该病害。然而，化学农药的长期使用会造成环境污染、农药残留，还将导致抗药性菌株产生及交互抗性等问题。此外，马铃薯晚疫病的化学防控需要抓住关键时期，然而用药时机很难把握，用药不及时则会导致病害流行，造成严重损失。β-葡寡糖可诱导多种植物产生抗性，目前已报道的植物包括烟草、拟南芥、水稻、葡萄等，但结构不同的β-葡寡糖对不同植物的诱导作用差别很大，如具有分支结构的β-1，3β-1，6葡七糖能诱导大豆产生植保素，而线性的β-1，6-葡寡糖则无此诱导作用。线性β-1，3葡寡糖能诱导烟草和番茄产生抗性，而对欧芹作用不明显。目前，海带来源的β-葡寡糖已被开发为生物农药，并获得了美国环保署的批准登记。然而，生长在我国海域的海带相对于欧洲掌状海带而言，海带淀粉含量较低，仅占干重的0.5-1％，同时较纯的海带淀粉价格昂贵，将其开发为生物农药存在原料和价格的劣势。可德兰多糖为水不溶性葡聚糖，是葡萄糖残基通过β-1,3糖苷键连接而成的线性分子，由agrobacteriumsp.发酵产生，是通过美国fda批准可作为食品添加剂使用的微生物多糖，以其为原料制备低分子量的葡寡糖生物农药与其它来源的葡寡糖相比具有生产周期短，成本低廉的优势。近期研究报道，可德兰寡糖可诱导马铃薯叶片细胞产生防御反应。并且在p.infestans感染前1d采用可德兰寡糖处理马铃薯叶片，2周后叶片损伤比例下降至7.79％±3.03％，而对照叶片损伤面积比例达到15.82％±5.44％，可德兰寡糖处理防效达50％，然而和常规化学药剂药效相比，还存在很大差距，尚不能达到实际田间应用的程度。针对上述马铃薯晚疫病化学防控的技术问题以及可德兰寡糖对马铃薯晚疫病防治的作用与不足，本发明的目的旨在通过将可德兰寡糖与植物源杀菌剂复配，获得可有效防治马铃薯晚疫病的复配制剂，实现马铃薯晚疫病的生物防控，克服现有马铃薯晚疫病化学防控技术的缺陷。目前用于马铃薯晚疫病防治的可德兰寡糖与植物杀菌剂复配制剂的研究和开发应用还未见文献和专利报道。可德兰寡糖和植物源杀菌剂均来源于天然产物，具有安全、环保、低残留等特点，用于马铃薯晚疫病防治，相对于其它手段而言更具有优势。本发明本着绿色环保、预防为主的防治思想，旨在提供一种符合环保要求、可有效防治马铃薯晚疫病的生物防控技术。技术实现要素：：本发明目的是提供一种葡寡糖复配制剂及其在防治马铃薯晚疫病中的应用。为实现上述目的，本发明技术方案如下：本发明所述的葡寡糖复配制剂，由葡寡糖和植物源杀菌剂混合而成的液体制剂。其中葡寡糖在复配制剂中的浓度为250-1000mg/l，植物源杀菌剂在复配制剂中的浓度为500mg-1000mg/l。本发明所述复配制剂中的葡寡糖为酶解制备的可德兰寡糖，平均分子量为500-5000da。本发明所述复配制剂中所含植物源杀菌剂为苦参碱、丁子香酚、苦豆子碱、雷公藤碱中的一种或二种以上。本发明所述复配制剂，可用于防治马铃薯晚疫病，根据防治对象、环境条件、防治方法、防治成本等因素，将含有葡寡糖和植物源杀菌剂与适当的辅料制成农业上可用的任意剂型；优选的剂型是悬浮剂、水分散粒剂。本发明所述复配制剂，防治马铃薯晚疫病具体方法为，种植前用该复配制剂对马铃薯种属进行拌种，用量为1-2l/100kg种薯切块。之后在幼苗期和块茎形成期再喷施2-3次，每次喷施用量为30-50l/亩。本发明具有的优点和有益效果:(1)本发明提供的葡寡糖复配制剂，综合考虑了植物诱导抗性和抑菌两方面的因素。通过葡寡糖处理，诱导马铃薯的抗性；通过杀菌剂处理，抑制微生物生长和繁殖，综合起到了更加理想的防治效果，在已进行的实施例中，效果优于已有的商品化试剂处理效果。(2)本发明提供的复配制剂所使用的可德兰寡糖属于天然产物，所使用的杀菌剂属于植物源来源，用于防治马铃薯晚疫病使用时，对环境无污染，对人体无健康危害。而且和单纯使用杀菌剂相比，所用杀菌剂使用量大幅下降。(3)本发明所提供的复配制剂，在马铃薯种薯播种期、幼苗期、块茎形成期和收获期多次使用。具有施用方法简单，成本低、易于推广应用的优势。与现有技术相比，预防为主，辅以植物源杀菌剂，可从提高植物抗病性和降低病原菌数量两方面入手，获得显著的增效作用，不仅克服了寡糖诱抗剂功能单一的缺陷，同时也大大降低化学农药的使用量，提高施药效果，用药成本降低，减缓抗药性的产生，对于病害的发生可控性强，风险较小，具有良好的开发应用前景。附图说明图1为不同浓度葡寡糖诱导马铃薯悬浮细胞过氧化氢的产程情况统计图；图2为葡寡糖(500mg/l)诱导马铃薯悬浮细胞中碱性葡聚糖酶的表达情况图；图3为葡寡糖(500mg/l)诱导马铃薯悬浮细胞中碱性几丁质酶的表达情况图。具体实施方式下面结合实施实例对本发明作进一步说明：实施例1：葡寡糖复配制剂诱导马铃薯块茎抗晚疫病实验取新鲜健康的马铃薯块茎，清洗后用2％naclo浸泡10min进行表明消毒，之后用无菌水冲洗去除残留的naclo，用无菌刀具切成2.0cm×2.0cm×0.5cm小块，用无菌去离子水清洗3遍，用灭菌的滤纸吸去残留水份。取10mll葡寡糖复配制剂置于灭过菌的9cm表面皿中，把马铃薯小块一端约2mm(诱导端)浸泡其中30min。同时以无菌水处理马铃薯块茎作为对照，每组6个平行。然后用无菌水将块茎表面残余激发子冲洗干净，并用灭菌的滤纸吸干表面残留水份。置于灭过菌铺有滤纸的培养皿中，20度恒温培养箱黑暗保湿培养24h。取致病疫霉孢子囊悬浮液稀释至10倍放大镜下每个视野20-30个孢子囊。取20ul接种于复配制剂处理24h后的马铃薯块茎非诱导端中央。20度恒温培养箱中保湿培养。7d后观察诱抗效果，计算病情指数。病情指数分级标准为：0级：块茎上无菌丝生长；1级：块茎上菌丝体可见，没有出现组织降解；2级：块茎上菌丝体覆盖了块茎面积的一半，没有出现组织降解；3级；菌丝体覆盖了整个块茎，没有或出现轻微的组织降解；4级：菌丝体覆盖了整个块茎，组织降解严重。病情指数＝∑(病级数×该病级块数)/调查总数×最高病级数)×100％诱抗效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％表1.葡寡糖与苦参碱复配制剂具体配方及防治效果表2.葡寡糖与丁子香酚复配制剂具体配方及防治效果表3.葡寡糖与苦豆子碱复配制剂具体配方及防治效果：复配制剂病情指数％诱抗效果％葡寡糖250mg/l苦豆子碱500mg/l24.271.53苦豆子碱750mg/l21.874.35苦豆子碱1000mg/l24.371.41葡寡糖500mg/l苦豆子碱500mg/l21.574.71苦豆子碱750mg/l22.673.41苦豆子碱1000mg/l26.369.06葡寡糖250mg/l58.730.94葡寡糖500mg/l39.253.88苦豆子碱500mg/l49.042.35苦豆子碱750mg/l44.547.65苦豆子碱1000mg/l42.649.88清水对照85.00.00表4.葡寡糖与雷公藤碱复配制剂具体配方及防治效果葡寡糖复配制剂诱导马铃薯块茎抗晚疫病实验结果如表1-4所示，清水对照组的病情指数达85％以上，葡寡糖单独诱导处理马铃薯块茎对疫病的防效约50％，葡寡糖复配制剂诱导处理后，防效均显著增加，最高可达83％，显示复配制剂具有很好的诱导马铃薯块茎抵抗疫病侵染的能力。实施例2.葡寡糖复配制剂诱导马铃薯植株抗致病疫霉用去离子水清洗马铃薯植株(7-8周)叶片表面，自然晾干后采用葡寡糖复配制剂对马铃薯植株叶面进行诱导处理，每种诱导剂处理3株作为平行实验。诱导24后采用浓度为105/ml的p.infestans孢子悬浮液喷洒马铃薯植株。诱抗效果评价采用叶片损伤面积比例计算，每个处理组共计采样30个叶片。采用p.infestans孢子悬浮液感染马铃薯叶片2周后，对叶片损伤面积进行统计，具体结果如下表所示。清水对照组2周后叶片损伤面积比例达到25.31％±3.44％，而在p.infestans感染前1d采用葡寡糖复配制剂处理叶片，2周后叶片损伤比例大幅下降，防效为78％-91％。表5.葡寡糖复配制剂诱导马铃薯植株抗致病疫霉处理叶片损伤面积比例％防效清水对照25.31±3.44—250ppm葡寡糖+750ppm苦参碱4.89±1.1180.68500ppm葡寡糖+750ppm苦参碱3.77±1.6585.10250ppm葡寡糖+750ppm丁子香酚2.83±1.3188.82500ppm葡寡糖+750ppm丁子香酚2.18±1.1791.39250ppm葡寡糖+750ppm苦豆子碱3.34±1.0286.80500ppm葡寡糖+750ppm苦豆子碱3.03±1.2788.03250ppm葡寡糖+750ppm雷公藤碱5.35±2.8878.86500ppm葡寡糖+750ppm雷公藤碱4.01±3.1584.16250ppm葡寡糖13.90±3.0345.08500ppm葡寡糖12.89±2.7549.07750ppm苦参碱19.92±3.2521.30750ppm丁子香酚19.48±2.6423.03750ppm苦豆子碱18.97±3.3725.05750ppm雷公藤碱20.20±2.9120.19实施例3.葡寡糖复配制剂小区防治马铃薯晚疫病实验试验地设在陕西省咸阳市杨凌区，马铃薯品种为中暑9号。马铃薯播种日期为2014年5月，播种密度为3500株/亩，垄距50cm，株距30cm，切块播种。种植时施用高浓度土豆专用肥，所有试验小区栽培条件及管理措施一致。试验设8个复配制剂处理，具体见下表，另设喷施清水的空白对照，75％代森锰锌为阳性对照。每处理3个重复，采用随机区组设计，共30个小区，每个小区面积30m2，总面积900m2。小区间及试验地周围设置0.6m宽的隔离带。种薯处理，播种前将种薯浸入所述处理制剂中30min，堆放在干燥的地方自然晾干，播种前将大于50g的种薯分切为20-30g的薯块，每个薯块均带有芽眼。幼苗处理，待芽眼长出的幼苗长度为5-10cm后，向幼苗及其周围的土壤喷洒所述处理制剂，每10平方米的田地喷洒0.6l制剂；块茎形成期处理，在块茎形成初期(现蕾期)和块茎形成盛期(花期)向植株及其周围的土壤喷洒所述处理制剂，每10平方米的田地喷洒0.6l制剂。最后一次施药后7天进行病情调查，每小区采用5点取样法调查，每点调查3株，每株分别调查植株下部、中部和上部各10片叶，记载病叶分级。分级标准：0级，无任何症状；1级，叶片上有个别病斑3级，1/3叶片有病斑5级，1/3-1/2叶片上有病斑7级，1/2-2/3叶片感病9级，2/3以上叶片感病计算病情指数和病指防效，并对不同处理的防效数据采用sps版软件进行差异性分析。病情指数＝[∑(发病级数×各级代表数值)/(调查总叶数×9)]×100防治效果(％)＝(空白对照区病情指数-药剂处理区病情指数)/空白对照区病情指数×100收获期测产方法：每个小区消除边际效应取不同的地段连续20株测产，重复3次，将薯块分为大薯和小薯2个级别记录，小薯小于100g，大薯大于等于100g，计算产量、增产量和大薯增产率。同时对统计烂薯率表6.葡寡糖复配制剂对马铃薯晚疫病的田间防效处理病情指数％防效％清水对照44.59500ppm葡寡糖+750ppm苦参碱3.4592.26500ppm葡寡糖+750ppm丁子香酚2.8794.46500ppm葡寡糖+750ppm苦豆子碱3.0593.16500ppm葡寡糖+750ppm雷公藤碱3.6891.75500ppm葡寡糖23.7546.74750ppm苦参碱22.5249.50750ppm丁子香酚10.7475.91750ppm苦豆子碱12.1572.75750ppm雷公藤碱13.6469.4175％代森锰锌800倍稀释8.8580.15表7.葡寡糖复配制剂防治马铃薯晚疫病对产量的影响调查结果如表6-7所示，经过田间小区试验表明，葡寡糖复配制剂对由马铃薯晚疫病的防效大于90％，高于生产中常用的防治药剂75％代森锰锌。葡寡糖复配制剂处理后的马铃薯烂薯率大幅下降，产量显著提高。实施例4.葡寡糖诱导马铃薯叶片细胞产生防御响应的效果应用过氧化氢的特异性荧光探针2',7'-二氯二氢荧光素二乙酯，以马铃薯悬浮细胞为实验材料，用荧光酶标仪检测了不同浓度葡寡糖处理后，细胞过氧化氢的含量，测定结果如下图所示，250ppm到1000ppm浓度的葡寡糖都可以显著诱导过氧化氢的产生。同时葡寡糖也可以诱导马铃薯悬浮细胞病程相关蛋白的表达，其中葡聚糖酶在处理后48-96h内显著增加，这些实验结果表明葡寡糖可激活马铃薯悬浮细胞的防御反应。当前第1页12