本发明涉及纳米颗粒制备及其应用，具体的说是壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒的制备及其作为植物诱抗剂和促生长剂的应用。
背景技术：
：壳寡糖是甲壳素经脱乙酰基后，水解得到的聚合度为2-10的寡糖，其结构为β-(1，4)-2-脱氧-2-氨基葡萄寡糖。壳寡糖是一种有着特殊理化性质和优良生物活性的碱性寡糖。具有诱导植物抗病、抗逆和抑菌等生物活性，已广泛应用于医药、保健食品、化妆品、农业等方面。褐藻酸是从海带、褐藻和裙带菜等海洋植物中提取的一种多糖，其结构为α-(1→4)连接的l-古罗糖醛酸(g)和β-(1→4)连接的d-甘露糖醛酸(m)连接而成的聚糖。褐藻酸具有促进植物生长、抗旱等生物活性。目前，虽然有褐藻酸以及其与离子，如褐藻酸-钙形成的纳米颗粒，作为水凝胶或者应用于医用材料。壳寡糖作为寡糖，水溶性好，有报道采用多聚磷酸钠进行沉淀反应形成纳米颗粒，但目前没有壳寡糖与褐藻酸共同形成的纳米颗粒报道。本专利以壳寡糖与褐藻酸采用简单的工艺制备壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒。结合壳寡糖具有诱导植物诱抗性，褐藻酸具有植物促生长作用，本发明所述的纳米颗粒可同时作为植物诱抗剂和促生长剂，且效果优于壳寡糖和褐藻酸单独使用。技术实现要素：本发明的目的在于提供壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒的制备及其在植物诱抗剂和促生长剂中的应用。为了实现上述目标，本发明采用的技术方案为：壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒的制备方法，其具体步骤为:分别将壳寡糖、褐藻酸溶解于水中，将壳寡糖溶液调ph至中性；将壳寡糖溶液滴加入褐藻酸溶液中进行聚合物沉淀反应，控制搅拌转速、壳寡糖浓度、褐藻酸浓度以及壳寡糖溶液的滴加速度，待反应完毕后，超声，得到稳定的纳米体系；超速离心分离并干燥，即得壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒。所述的壳寡糖分子量为1000-3000da，脱乙酰度大于85％；壳寡糖溶液的浓度为0.1％-10％(g/ml)；褐藻酸溶液的浓度为为0.05-5％(g/ml)；褐藻酸与壳寡糖的质量比为0.4-1∶1,壳寡糖溶液滴加时间为0.5-3小时。所述的转速为100-1000转/分，超声功率为80-180w，超声时间为2-60分钟。所述壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒平均粒径50-500nm，zeta电位20-50mv。所述壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒可作为抗菌剂或植物诱抗剂；或所述壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒可作为植物促生长剂，提高产量。所述壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒作为抗菌剂和植物诱抗剂的浓度为20-200ppm。壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒作为植物促生长剂的浓度为10-100ppm。本发明具有如下优点：1.本发明所采用的原料壳寡糖和褐藻酸为天然来源的寡糖和多糖，原料易得，价格低廉。2.本发明制备纳米颗粒的过程采用水为溶剂，制备工艺简单，易于放大；3.本发明合成纳米颗粒分散性好、稳定性强、不添加交联剂和分散剂。4.本发明所述的壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒具有很好的生物活性，同时具有诱导植物抗性和促进植物生长的活性，具有广泛的应用前景。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步说明：实施例1:壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒制备工艺取0.01g分子量为1000da，脱乙酰度为90％的壳寡糖溶于5ml去离子水中，用氨水调ph至7，在搅拌条件下，滴加入4ml0.25％(w/v)的褐藻酸溶液中，30分钟滴完，搅拌速度为300转/分，反应6小时后，90w功率超声2分钟，12000转/分离心1小时，弃去上清，冷冻干燥即得壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒，其平均粒径在200nm。实施例2:壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒制备工艺取0.02g分子量为1500da，脱乙酰度为85％壳寡糖溶于5ml去离子水中，在搅拌条件下，滴加入4ml0.5％(w/v)的褐藻酸溶液中，30分钟内滴完，搅拌速度为400转/分，反应6小时后，120w功率超声5分钟，12000转/分离心1小时，弃去上清，冷冻干燥即得壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒，其平均粒径在100nm。实施例3:壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒制备工艺取0.05g分子量为3000da，脱乙酰度为95％的壳寡糖溶于5ml去离子水中，在搅拌条件下，滴加入4ml1％(w/v)的褐藻酸溶液中，60分钟内滴完，搅拌速度为500转/分，反应8小时后，150w功率超声30分钟，14000转/分离心1小时，弃去上清，冷冻干燥即得壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒，其平均粒径在300nm。实施例4:壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒制备工艺取0.05g分子量为3000da的壳寡糖溶于5ml去离子水中，在搅拌条件下，滴入4ml0.5％(w/v)的褐藻酸溶液，40分钟内滴完，搅拌速度为600转/分，反应8小时后，180w功率超声10分钟，14000转/分离心1小时，弃去上清，冷冻干燥即得壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒，其平均粒径在270nm。实施例5：壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒水稻纹枯病菌抑制作用用无菌水将壳寡糖配制成1000，500，100，50，25，12.5μɡ/ml的6个系列浓度。用无菌水将褐藻酸配制成5000，2500，1000，500，100，50μɡ/ml的6个系列浓度，另外,用无菌水将实施例1的壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒配制成1000，500，100，50，25，12.5μɡ/ml的6个系列浓度。采用抑制菌丝生长速率法(农药学学报2007,9(4):357-362)测定处理对菌丝生长抑制率，根据不同浓度制剂对菌丝生长抑制率计算ec50值。表1壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对水稻纹枯病菌抑制活性由试验结果可知，壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对水稻纹枯病菌的抑制有协同增效作用，ec50值远远小于褐藻酸ec50值，小于壳寡糖ec50值。实施例6：壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对水稻纹枯病的田间药效试验在辽宁省沈阳市新民区水稻田进行，试验共设置5个处理，采用实施例2所制壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒，(1)50ppm壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒水剂，30g/亩；(2)25ppm壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒水剂，40g/亩；(3)10ppm壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒水分散剂，50g/亩；(4)50ppm壳寡糖水剂，50g/亩；(5)清水对照。每处理3次重复，于水稻纹枯病发病初期第一次施药，后每隔7-10天喷药1次，连续喷药3次，在第三次施药后第7天调查水稻纹枯病发病情况，计算防治效果。表2.壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对水稻纹枯病的防治作用处理药前病情指数(％)药后病情指数(％)平均防效(％)10.921.2849.68cc20.510.5560.91bb31.680.9679.25aa41.331.3861.44bbck2.215.97___寡糖-褐藻酸纳米颗粒对水稻纹枯病的田间药效试验结果表明，10ppm壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒50g/亩的处理防效最高，为79.25％。实施例7：壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对番茄早疫病菌、黄瓜炭疽病菌、小麦赤霉病菌及玉米大斑病菌等病菌抑制作用按照实施例5的方法测定壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对以下九种病菌抑制作用，计算毒理。表3.壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对九种病原菌抑制作用测定结果实施例8：壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对辣椒番茄早疫病田间试验结果按照实施例6的方法，在山东寿光进行壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对辣椒番茄早疫病田间试验，试验结果见表4。表4.壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对番茄早疫病的防效处理发病率(％)药后病情指数(％)平均防效(％)壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒30g/亩8.67.7358.40cc壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒40g/亩3.46.2067.761bb壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒50g/亩2.12.6786.50aa壳寡糖50g/亩5.06.8362.20bbck15.718.3___试验结果表明壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对番茄早疫病有较好的防效，最高防效达86.50％。壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对番茄早疫病的防效有增效作用。实施例9：壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对草莓炭疽病的防治作用按照实施例6的方法，在辽宁大连进行壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对草莓白粉病病田间试验，试验结果见表5。表5.壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对草莓炭疽病的防效处理病情指数(％)平均防效(％)壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒30g/亩1.9777.75壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒40g/亩1.8479.34壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒50g/亩0.8190.80壳寡糖50g/亩1.7288.70ck8.90___试验结果表明壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对草莓炭疽病的很好防效，壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒50g/亩处理防效高于壳寡糖50g/亩处理的防效。实施例10：壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对小麦分蘖数和穗粒数的影响将200mg壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒分散1l水中。实验分为两组，分别为壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒处理的小麦和清水处理空白对照组小麦。进入苗期后开始喷洒稀释为50mg/l浓度的纳米颗粒分散剂，每20天1次，直至小麦返青拔节后统计结果。经统计得到结果显示，经壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒处理的小麦分蘖数和穗粒数明显提高(表6)。表6.壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对小麦分蘖数和穗粒数的影响由结果可见经过壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒处理后，小麦株高增加1.98％，分蘖数增加9.3％。同时小麦穗粒数增加5.3％，不孕不育小穗数减少14.0％，壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒明显促进了小麦的分蘖，增加了小麦产量。实施例11：壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒拌种处理小麦对小麦产量的提高作用本试验采用质量浓度50mg/l的壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒水分散剂。对小麦进行拌种处理。试验对象为西农9871品种的小麦。在小麦成熟期对其成穗数、穗粒数和千粒重进行测量，同时设同品种的对照区，以比较壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒的应用效应。实验发现壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒拌种后的小麦成穗数较空白对照组增加6.1％，穗粒数增加2.02％，而且千粒重和产量分别提高4.46％和8.1％(表7)。表7.壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒拌种处理小麦种后对小麦产量的提高作用实施例12：壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒提高樱桃产量利用红灯、先锋、龙冠三种不同品种的樱桃进行产量实验，将壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒配成25ppm水分散剂，于2015年4月14号雪前喷施，亩施200kg药液，调查3个樱桃品种产量，结果显示壳寡糖-褐藻酸纳米颗具有较好的增产效果，具体结果如下表3所示。表8.使用壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对樱桃产量的影响实施例13：壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒提高苹果产量2015年4月10号，在陕西洛川富县针对苹果进行产量实验，将壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒水分散剂50ppm，喷施苹果树，亩施200kg的药液。调查产量和外观品质，具体结果如表9所示。表9.使用壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒对苹果产量及外观品质的影响处理坐果率(％)单果重(g)果形指数果实着色面积(％)单株产量(kg)对照36.48248.430.81364.920.42处理组46.12279.520.86579.736.54可以看出，使用壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒可以明显提高苹果产量及外观品质。当前第1页12