一种利用实验室人工饲养蜜蜂幼虫评价农药对蜜蜂幼虫毒性的方法与流程

本发明属于生态毒性测试领域，涉及了一种评价农药对蜜蜂幼虫毒性的方法，更具体的涉及了一种利用实验室人工饲养蜜蜂幼虫评价农药对蜜蜂幼虫毒性的方法。

背景技术：

蜜蜂以其授粉高效性、采集专一性和种群社会性等优势在许多农作物授粉中发挥着重要作用，是自然界授粉昆虫中种类最多、数量最大的类群。然而，农药的滥用不仅对采集蜂的采集行为和健康产生严重影响，受农药污染的蜂蜜、花粉以及巢脾中蓄积的农药还将对蜜蜂幼虫的生长发育产生影响，严重危害时，导致蜜蜂幼虫大量死亡。蜂群中幼虫的数量越少，发展壮群的可能性越小，其采集能力越差，生产蜂产品和传粉的能力无法发挥，将给养蜂业及农业带来沉重的打击。

目前为评价农药对蜜蜂幼虫毒性，科技工作者开展了蜂巢内农药对蜜蜂幼虫的影响研究，然而蜜蜂是典型的真社会性昆虫，具有明确而细致的劳动分工，蜂群中的幼虫食物由专职哺育蜂来提供，而人工对幼虫进行操作，幼虫往往会被工蜂遗弃，自然蜂群中添加杀虫剂易存储于巢脾上影响蜂群繁殖，同时外界蜜源冲淡杀虫剂剂量，存在重复性差、试验结果说服力低等缺点。如果能够像开展农药对蜜蜂急性毒性研究一样，将幼虫饲养在实验室内进行，可人为控制幼虫食物成分，排除哺育蜂以及外界蜜源的影响。因此，需加大科研的力度，探索可行的技术，建立有效的、简便的、重复性高的室内方法。

为建立室内农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法，人工饲养蜜蜂幼虫的技术是必不可少的一项工程。过去的养蜂和研究实践中，已形成了一些饲养技术。但需操作者具有良好的操作经验，需每天进行幼虫的转移，这一过程往往费时费力，如开展试验需批量的蜜蜂幼虫时，大大增加试验成本，并减缓试验进程，同时还会对受试幼虫造成一定的伤害，影响后期试验结果的准确性。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种利用实验室人工饲养蜜蜂幼虫评价农药对蜜蜂幼虫毒性的方法，具有重要的科学意义。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

本发明技术方案之一：一种利用实验室人工饲养蜜蜂幼虫评价农药对蜜蜂幼虫毒性的方法，包括如下步骤：

(1)蜜蜂幼虫的准备：向含有蜂群的蜂箱内插入空蜂脾，将产卵期内的蜂王固定在所述空蜂脾上进行产卵，20～28小时后将蜂王放出至含有蜂卵的蜂脾外，该含有蜂卵的蜂脾继续留在蜂箱内，直到其中的蜂卵孵化成蜜蜂幼虫；

(2)蜜蜂幼虫的实验室饲养：从蜂箱内取出所插入的蜂脾，挑取所述蜜蜂幼虫用基础口粮进行适应性饲养3天，于第4天进行健康检查，选取健康幼虫；

(3)受试农药的添加：将步骤(2)选取的健康幼虫分成对照组幼虫和处理组幼虫并继续饲养3天，其中处理组幼虫用受试饲料饲养，所述受试饲料含有各浓度的受试农药和基础日粮；

(4)化蛹及观察：将步骤(3)中饲养3天后的即将进入蛹化期的幼虫转移至化蛹板的板孔中准备化蛹，观察幼虫在板孔中完成排便、吐丝、化蛹和羽化的过程，统计各幼虫的存活、化蛹或/和羽化情况。

本发明技术方案之二：一种实验室人工饲养蜜蜂幼虫的方法，包括如下步骤：

(1)蜜蜂幼虫的准备：向含有蜂群的蜂箱内插入空蜂脾，将产卵期内的蜂王固定在所述空蜂脾上进行产卵，20～28小时后将蜂王放出至含有蜂卵的蜂脾外，该含有蜂卵的蜂脾继续留在蜂箱内，直到其中的蜂卵孵化成蜜蜂幼虫；

(2)蜜蜂幼虫的实验室饲养：从蜂箱内取出所插入的蜂脾，挑取所述蜜蜂幼虫用基础口粮进行适应性饲养3天，于第4天进行健康检查，选取健康幼虫继续饲养3天；

(3)化蛹及观察：将步骤(2)中继续饲养3天后的即将进入蛹化期的幼虫转移至化蛹板的板孔中准备化蛹，观察幼虫在板孔中完成排便、吐丝、化蛹和羽化的过程，统计各幼虫的存活、化蛹或/和羽化情况。

本发明技术方案之三：所述的实验室人工饲养蜜蜂幼虫的方法在评价农药对蜜蜂幼虫毒性方面的用途。

本发明还公开一种具体方案，一种利用实验室人工饲养蜜蜂幼虫评价农药对蜜蜂幼虫毒性的方法，其包括如下步骤：

(1)蜜蜂幼虫的准备：向含有蜂群的蜂箱内插入1张空蜂脾，用隔王板将产卵期内的蜂王固定在所述空蜂脾上进行产卵，20～28小时后去掉隔王板将蜂王放出至插入的蜂脾外，该含有蜂卵的蜂脾继续留在蜂箱内，直到其中的蜂卵孵化成蜜蜂幼虫；

(2)蜜蜂幼虫的实验室饲养：从蜂箱内取出所插入的蜂脾，挑取所述蜜蜂幼虫置于装有蜜蜂幼虫基础日粮的孔板上，放入培养箱内饲养，待幼虫即将进入蛹化期时，将幼虫转移至化蛹板中准备化蛹，此后不再移动虫体，直至蜜蜂幼虫发育完全。该过程中可进一步添加受试农药；

(3)受试农药的准备：受试农药用蒸馏水或/和对蜜蜂幼虫无毒性的有机溶剂溶解后，配制成一个或多个不同浓度处理组，并配制对应溶剂对照组；

(4)受试农药的添加：步骤(2)中幼虫经3天饲养，于第4天进行健康检查，剔除异常、生病、受伤的幼虫，分配到各处理组中。将含受试农药的各浓度处理组以及溶剂对照组分别添加到基础日粮中制成受试饲料，利用该受试饲料饲喂各处理组的蜜蜂幼虫，连续饲喂3天，随后进入蛹化期，不再喂食，同步骤(2)待幼虫即将进入蛹化期时，将幼虫转移至化蛹板的板孔中准备化蛹，观察幼虫在孔中完成排便、吐丝、化蛹和羽化的过程，统计各幼虫的存活、化蛹及羽化情况。

优选的，其中蜜蜂幼虫的准备的步骤中：所述蜂群为四周内未用药的、健康的、已知来源和生理状态的蜂群；产卵期内的蜂王在所述空蜂脾上进行产卵的时间优选为24小时。

优选的，蜜蜂幼虫的准备步骤中的蜂卵孵化期为2～4天，一般为3天。

优选的，其中蜜蜂幼虫的实验室饲养步骤中：所挑取的蜜蜂幼虫为1日龄后期幼虫，其体色为白色。相较于其他日龄的幼虫，挑选1日龄后期幼虫能够在实验室人工饲养的条件下获得良好的生长，将幼虫的存活率提高到90％以上，使更多幼虫能够成功进入蛹化期。

优选的，所述基础日粮的质量组成为：新鲜蜂王浆50±5％，无菌水37±2％，葡萄糖6±1％，果糖6±1％，酵母提取物1±0.5％；基础日粮的优选质量组成为：新鲜蜂王浆50％，无菌水37％，葡萄糖6％，果糖6％，酵母提取物1％。更优选的，基础日粮现配现用，饲喂前须在培养箱内预热。例如饲喂前须在培养箱内预热30分钟。本发明所述的基础日粮相较于其他的蜜蜂幼虫饲料能够使幼虫生长良好，大幅提高幼虫成活率。

优选的，其中蜜蜂幼虫的实验室饲养步骤中：所述适应性饲养采用装有基础日粮的孔板进行；孔板中每孔分配一只蜜蜂幼虫，每孔蜜蜂幼虫基础日粮的饲料量为40～60μL，孔板中的基础日粮每24小时更换。优选的孔板可采用48孔板或其他孔板。

优选的，蜜蜂幼虫的实验室饲养和受试农药的添加步骤中的环境条件均为：温度34±2℃，湿度95±1％，优选温度34±1℃，湿度95％；更优选的，饲养时孔板置于箱底部装有甘油水混合液的密闭箱中，再放于34±1℃培养箱内培养。

优选的，其中受试农药的添加步骤中，所述对照组幼虫分为空白对照组幼虫或/和溶剂对照组幼虫；所述空白对照组幼虫用基础日粮饲养，所述溶剂对照组幼虫用添加了溶剂的基础日粮作为饲料饲养，其中每41～61μL饲料中含有溶剂0.5～5μL；所述处理组幼虫分为多个处理组，优选分为至少5个处理组，每个处理组分别用含有不同浓度受试农药的受试饲料饲养。

优选的，其中受试农药的添加步骤中，受试饲料的制备方法为：受试农药用蒸馏水或/和对蜜蜂幼虫无毒性的有机溶剂溶解后，配制成一个或多个不同浓度的受试农药溶液，将其分别加入基础日粮中配制得到受试饲料，其中每41～61μL受试饲料中含有受试农药溶液0.5～5μL，优选1μL；

优选的，受试农药的添加步骤中继续饲养过程中每只蜜蜂幼虫的饲料量为41～61μL，饲料每24小时更换。更优选的，受试饲料中各浓度处理组及溶剂对照组的量不超过基础日粮体积的5％。

优选的，受试农药的添加步骤中，受试农药添加时，受试对象一般为4日龄后的蜜蜂幼虫。

优选的，在继续喂养过程中也需定时(如24h)更换受试饲料，其中基础日粮现配现用，饲喂前须在培养箱内预热。

优选的，化蛹及观察步骤中，所述化蛹板孔中垫有干燥的灭菌纸，例如干燥的无菌擦镜纸；优选的，即将进入蛹化期的幼虫在转移至化蛹板之前先吸干幼虫体表的饲料；更优选的，转移至化蛹板中的幼虫不再移动，直至蜜蜂幼虫发育完全。实验发现，在化蛹板孔中垫干燥的灭菌纸，可以使预蛹到成蜂过程的羽化率提高50％以上。

优选的，化蛹及观察步骤中，化蛹板可采用24孔板或其他孔板。

一种蜜蜂幼虫实验室内饲养的具体方法为：从蜂脾中移取1日龄后期的蜜蜂幼虫至盛有蜜蜂幼虫基础日粮的48孔板内，每孔一只幼虫，将48孔板置于箱底部装有1L灭菌的甘油水混合液(15.5％甘油+84.5％水)的密闭小整理箱中，置于34±1℃培养箱内培养，以后每24小时，更换孔板中的饲料，待幼虫即将进入蛹化期时，用擦镜纸吸干幼虫体表的饲料后，将幼虫转移于垫有灭菌纸的24孔板中准备化蛹，此后不再移动虫体，直至蜜蜂幼虫发育完全。在该过程中可进一步添加受试农药或其他试剂，借此可以进一步开展许多以蜜蜂幼虫为对象的活体实验。

本发明的显著优点：

1.快速、简单。本发明通过优化蜜蜂幼虫基础日粮、虫龄以及化蛹板，获得了较为简单的，容易掌握的室内饲养技术，操作者能在较短的时间内掌握。

2.直观、准确。本发明在实验室内饲养蜜蜂幼虫的方法，可以让我们不依赖于蜂群，在实验室内开展农药对蜜蜂幼虫毒性研究，避免蜂群内诸多不可控制因素的制约，可直观、高效、准确的评价农药对蜜蜂幼虫的影响。

3.较强的实用性和扩展性。本发明在实验室内饲养蜜蜂幼虫的方法，在此基础上可以开展许多以蜜蜂幼虫为对象的活体实验，因此适用于除农药外的其它研究，应用范围较广。

附图说明

图1为在实验室利用48孔板饲养的不同发育时期的蜜蜂幼虫，其中A、B、C、D、E、F分别表示1、2、3、4、5、6日龄的幼虫。

图2为在实验室利用24孔板进行化蛹和羽化的蜜蜂幼虫，其中A、B、C分别表示刚化蛹的蜜蜂幼虫、成熟蛹体和羽化的幼蜂。

具体实施方式

实施例1：本发明实验室人工饲养蜜蜂幼虫的方法，包括以下步骤：

(1)蜜蜂幼虫的准备

在蜂王产卵期内，选择三箱四周内未用药的、健康的、已知来源和生理状态的蜂群。打开蜂箱盖各插入1张空脾，用隔王板将蜂王固定在空脾上产卵，24小时后去掉隔王板将蜂王放出，检查新产卵情况。根据蜂王的生育能力，可适当缩短隔离时间，以减少幼虫之间的大小和年龄差异。含有蜂卵的蜂脾继续留在蜂箱内，直到孵化(蜂卵孵化期一般为3天)。

(2)蜜蜂幼虫的实验室饲养

从蜂箱内取出所插入的蜂脾，挑取所述蜜蜂幼虫置于装有蜜蜂幼虫基础日粮的孔板上，放入培养箱内进行饲养。

实验室内利用48孔板来饲喂蜜蜂幼虫。

幼虫基础日粮配方为新鲜蜂王浆占50％，无菌水占37％，葡萄糖占6％，果糖占6％，酵母提取物占1％。具体操作方法为：配制好幼虫基础日粮，置于培养箱内预热30分钟，按每个孔中添加50μL幼虫日粮到48孔板内。

从蜂脾中移取1日龄后期的蜜蜂幼虫至盛有蜜蜂幼虫基础日粮的48孔板内，每孔一只幼虫，将48孔板置于箱底部装有1L灭菌的甘油水混合液(15.5％甘油+84.5％水)的密闭小整理箱中，置于34±1℃培养箱内培养，以后每24小时，更换孔板中的幼虫基础日粮。

待幼虫即将进入蛹化期时，用擦镜纸吸干幼虫体表的饲料后，将幼虫转移于垫有灭菌纸的24孔板中准备化蛹，此后不再移动虫体，直至蜜蜂幼虫发育完全，具体培养的各日龄蜜蜂幼虫见图1，可见各日龄的蜜蜂幼虫均能正常生长发育并化蛹。

利用这种方法培养的蜜蜂幼虫都能够正常发育，与在蜂箱内哺育的蜜蜂幼虫发育情况基本一致。在此基础上可以开展许多以蜜蜂幼虫为对象的活体实验，避免蜂群内诸多不可控制因素的制约。

对比例1：日粮配方对蜜蜂幼虫生长发育的影响

为获得最佳蜜蜂幼虫日粮配比，参照蜜蜂幼虫的营养需要，本发明配制蜜蜂幼虫基础日粮：新鲜蜂王浆占50％，无菌水占37％，葡萄糖占6％，果糖占6％，酵母提取物占1％。

同时配制OECD237准则中给出不同阶段的三种日粮：

日粮A(第1天)：50％的新鲜蜂王浆和50％的含2％的酵母提取物、12％的葡萄糖和12％果糖的水溶液；

日粮B(第3天)：50％的新鲜蜂王浆和50％的含3％的酵母提取物、15％的葡萄糖和15％的果糖的水溶液；

日粮C(第4天到第6天)：50％的新鲜蜂王浆和50％含4％的酵母提取物，18％的葡萄糖和18％的果糖的水溶液。

试验按日粮分为2个处理，每个处理3个培养板(48孔)即3个重复，挑取不同日龄的蜜蜂幼虫进行饲喂，发现本发明幼虫基础日粮处理组幼虫生长良好，均能排便进入蛹化期。OECD237处理组幼虫生长不佳，幼虫在移植到培养板3天左右死亡，个别幼虫在发育到蛹期后停止发育，然后死亡。

表明本发明中的蜜蜂幼虫基础日粮配方优于OECD237准则，主要是由于蜜蜂幼虫期发育缓慢，对糖的需求量较少，但蜜蜂幼虫期要经历一系列复杂的变化，其体内不断进行物质的分解和合成，而水分是生理代谢和生化反应的主要媒介，对水的需求量大，而OECD237准则增大了糖的含量，降低了水分含量，所以幼虫生长不佳。

对比例2：虫龄对幼虫存活率的影响

试验日粮统一为实施例1中饲喂效果最佳的日粮配方，1日龄前期幼虫(蛋青色)和1日龄后期幼虫(白色)两个处理组，每个处理3个培养板(48孔)即3个重复。在饲喂过程中发现，1日龄前期幼虫在移植到培养板前3天长势比较不错，第四天50％以上的幼虫身体弹性减弱，逐渐停止发育然后死亡。1日龄后期幼虫生长良好，90％以上的幼虫存活，排便进入蛹化期。

对比例3：化蛹板对幼虫发育的影响

试验设计了2个处理组，一个是在24孔培养板孔内垫干燥的无菌擦镜纸，另一个是空白24孔培养板。试验日粮统一为实施例1中饲喂效果最佳的日粮配方，挑取实施例2中饲喂效果最佳的虫龄，进行饲喂，然后把进入排便期即将化蛹的幼虫(预蛹)用移虫针移入化蛹板孔中，每孔1只。空白的化蛹板的化蛹模式，从预蛹到成蜂仅获得44.44％的羽化率，相比之下，垫干燥的无菌擦镜纸的化蛹板获得高达95.83％的成活率。

实施例2：本发明利用实验室人工饲养蜜蜂幼虫评价农药对蜜蜂幼虫毒性的方法，包括以下步骤：

(1)蜜蜂幼虫的准备

在蜂王产卵期内，选择三箱四周内未用药的、健康的、已知来源和生理状态的蜂群。打开蜂箱盖各插入1张空脾，用隔王板将蜂王固定在空脾上产卵，24小时后去掉隔王板将蜂王放出，检查新产卵情况。根据蜂王的生育能力，可适当缩短隔离时间，以减少幼虫之间的大小和年龄差异。含有蜂卵的蜂脾继续留在蜂箱内，直到孵化(蜂卵孵化期一般为3天)。

(2)蜜蜂幼虫的实验室饲养

从蜂箱内取出所插入的蜂脾，挑取所述蜜蜂幼虫置于装有蜜蜂幼虫基础日粮的孔板上，放入培养箱内进行饲养。

实验室内利用48孔板来饲喂蜜蜂幼虫。

幼虫基础日粮配方为新鲜蜂王浆占50％，无菌水占37％，葡萄糖占6％，果糖占6％，酵母提取物占1％。具体操作方法为：配制好幼虫基础日粮，置于培养箱内预热30分钟，按每个孔中添加50μL幼虫日粮到48孔板内。

从蜂脾中移取1日龄后期的蜜蜂幼虫至盛有蜜蜂幼虫基础日粮的48孔板内，每孔一只幼虫，将48孔板置于箱底部装有1L灭菌的甘油水混合液(15.5％甘油+84.5％水)的密闭小整理箱中，置于34±1℃培养箱内培养，以后每24小时，更换孔板中的幼虫基础日粮。

(3)受试农药的准备

受试农药用蒸馏水溶解，对于难溶化合物选用对蜜蜂幼虫无毒性的有机溶剂助溶，其中溶剂的量不超过饮食体积的5％，增加溶剂对照组。试验至少设置5个浓度处理组。

(4)受试农药的添加

受试时，步骤(2)中所挑取的蜜蜂幼虫经三天适应性饲养(温度34±1℃，湿度95％)，于第4天进行健康检查，剔除异常、生病、受伤的幼虫，分配到各处理组中。将1μL受试农药分别添加到基础日粮中制成受试饲料，利用该受试饲料饲喂各处理组的蜜蜂幼虫，每24小时，更换孔板中的饲料，连续饲喂3天，随后进入蛹化期，不再喂食。观察幼虫在孔中完成排便、吐丝、化蛹和羽化的过程。

实施例3：

用类似实施例2的方法，以意大利蜜蜂幼虫为研究对象，以典型新烟碱类农药吡虫啉为代表，开展农药对蜜蜂幼虫毒性研究。蜜蜂幼虫准备完成后，试验第1d，从三个蜂群上选取1日龄后期幼虫，置于48孔板上，喂食等量的基础日粮，经三天适应性饲养(温度34±1℃，湿度95％)，试验开始后的第4d进行健康检查，剔除异常、生病、受伤的幼虫，再分配到各处理组中。试验设置1个空白对照组(C1，始终喂基础日粮)，1个溶剂对照组(C2，始终喂基础日粮)及5，50，500，1000，2000和3000mg·L^-1 6个浓度处理组(于试验开始后的第4d、5d和6d每天分别添加1μL药液于基础日粮中喂食)。连续饲喂3天，随后进入蛹化期，不再喂食。观察幼虫在孔中完成排便、吐丝、化蛹和羽化的过程。

试验结果表明，吡虫啉处理剂量为15ng·幼虫^-1时，并不影响蜜蜂幼虫存活率、化蛹率和羽化率；当处理剂量达到150ng·幼虫^-1时，蜜蜂幼虫羽化率下降，但不影响蜜蜂幼虫的存活率和化蛹率；幼虫7天半数致死剂量为2300ng·幼虫^-1。

实施例4：

用类似实施例2的方法，以意大利蜜蜂幼虫为研究对象，以典型新烟碱类农药呋虫胺为代表，开展农药对蜜蜂幼虫毒性研究。试验设置1个空白对照组(C1，始终喂基础日粮)，1个溶剂对照组(C2，始终喂基础日粮)及1，5，50，500，1500和3000mg·L^-1 6个浓度处理组。其他步骤采用与实施例3类似的方法进行受试。

试验结果表明，呋虫胺处理剂量为3ng·幼虫^-1时，并不影响蜜蜂幼虫存活率、化蛹率和羽化率；当处理剂量达到15ng·幼虫^-1时，蜜蜂幼虫羽化率下降，但不影响蜜蜂幼虫的存活率和化蛹率；幼虫7天半数致死剂量为577ng·幼虫^-1。