本发明属于淡水鱼类杂交育种
技术领域：
，具体涉及一种雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼的杂交方法。
背景技术：
：黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼为同属鱼类，属于我国较重要的底层小型经济鱼类。黄颡鱼适于在池塘中养殖，但是它个体较小，生长速度较慢。瓦氏黄颡鱼又名江黄颡鱼，个体大，生长迅速，但它耐低氧能力和抗逆性较差，较难适于池塘养殖。目前，国内正在通过黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的杂交和选育，培育一种既适于池塘养殖、又生长较快、个头较大的黄颡鱼养殖新品种。现有技术中，受精方式主要为人工授精，导致雄瓦氏黄颡鱼必须杀死才可以取得精巢，这种方式的利用，虽然产卵时间统一，出苗整齐，但亲本死亡量非常大，无法重复利用，使得杂交成本大幅增加。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼的杂交方法，用于在降低成本的同时，降低鱼苗受病率，提高鱼苗的质量。为了达到上述目的，本发明提供一种雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼的杂交方法，采用如下技术方案：该雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼的杂交方法包括以下步骤：步骤S1、亲本培育：将雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼暂养驯化达到亲鱼标准，在驯化过程中，对雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼分别喂养亲本饲料，亲本饲料包括基础饲料和复合饲料添加剂，复合饲料添加剂含有甲壳素、蒲公英和姜黄素；步骤S2、人工催产：采取两针注射，提前催熟的办法，两针之间的时间间隔为10h；步骤S3、自然授精；步骤S4、人工孵化：取出受精卵在水泥池中孵化，水泥池中的水为地下水。可选地，在亲本培育的过程中，雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼分开培育，执行自然受精的步骤时并池。可选地，复合饲料添加剂含有按重量百分比计的甲壳素1％～60％、蒲公英1％～60％和姜黄素1％～40％。优选地，复合饲料添加剂含有按重量百分比计的甲壳素5％～50％、蒲公英5％～50％、姜黄素5％～30％。进一步优选地，复合饲料添加剂含有按重量百分比计的甲壳素20％～35％、蒲公英20％～35％、姜黄素10％～25％。可选地，复合饲料添加剂中甲壳素、蒲公英以及姜黄素用量比例为(1～2):(1～2):(0.8～1)。示例性地，复合饲料添加剂中甲壳素、蒲公英以及姜黄素用量比例为1:1:0.8。示例性地，复合饲料添加剂中甲壳素、蒲公英以及姜黄素用量比例为2:1.5:1。可选地，复合饲料添加剂还包括面粉、淀粉、玉米粉、玉米蛋白粉、鱼粉、酵母中的一种或几种。可选地，亲本饲料中复合饲料添加剂的重量百分比为0.005％～0.1％。可选地，喂养雌黄颡鱼/江黄颡鱼的亲本饲料中复合饲料添加剂的重量百分比为0.02％～0.1％；喂养雄瓦氏黄颡鱼中复合饲料添加剂的重量百分比为0.005％～0.01％。可选地，基础饲料含有按重量比计的鱼粉1％～30％，大豆粉2％～6％，肉粉(或肉骨粉)2％～10％，酵母粉1％～5％，复合维生素0.1％，磷酸二氢钙1.8％～2.2％，菜粕5％～30％，玉米5％～20％，细米糠5％～25％。可选地，在自然授精的步骤中，投放的雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼的比例为1:1.0～1.5，并设置人工鱼巢，引诱亲鱼在巢中产卵。优选地，投放的雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼的比例为1:1.2。可选地，在人工催产的过程中，第一针包括0.3ugLRHA2+0.5mgDOM，第二针包括1200IUHCG+5ugLRHA2+3mgDOM。其中HCG：人绒毛膜促性腺激素；LRHA2：促黄体释放激素A2；DOM：地欧酮。上述第一针作用是催熟，促进雌雄鱼性腺同步发育，因此药量不宜过大；第二针主要作用是促其排卵排精，药量应适当加大；按12～16h预计效应时间。可选地，人工催产的过程中，水温为27～28℃。可选地，人工孵化的过程中，水温为28～30℃。本发明采用雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼进行杂交，在杂交过程中采用自然受精的方式，亲本死亡量非常小，可以重复利用，使得杂交成本大幅降低，另外，通过含有复合饲料添加剂的亲本饲料的喂养，还解决了其在生长过程中营养不足问题，具体为：(1)甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂在较低的添加剂量范围内，能够发挥更有效的作用；表现出优良的促生长作用，提高亲鱼生长速度和降低饵料系数，促生长效果的有效剂量范围很小，弥补了现有技术不足；成本低，效果显著。(2)对亲鱼肝脏具有很好的调节、保护和修复作用，对病变肝脏具有很好的治疗作用；(3)提高动物的抗氧化能力和免疫防御力，降低脂质过氧化物的产生对亲鱼的毒害作用，增强亲鱼体质和提高亲鱼抗应激力，降低亲鱼水霉病的爆发和危害；(4)在保证亲鱼有效生长机能的前提下，还能有效地提高亲鱼粗蛋白含量，降低体脂肪含量；提高亲鱼消化机能；提高亲鱼非特异免疫机能；有利于亲鱼的生长，提高亲鱼抗病力；(5)甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂均为植物提取物，可以完全替代抗生素和促长类药物在亲本饲料中应用，保障养殖水产品的食用安全性，维护亲鱼健康，是一种新型环保、安全、绿色的饲料添加剂；(6)原料来源稳定，生产工艺简单，添加成本低，雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼杂交，孵化率以及出苗率都得到了较大幅度的提高，尤其雄鱼可以重复利用，可提高生产性能和养殖效益，具有很好的社会效益和生态效益。此外，本发明中的上述含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂的亲本饲料具有促进亲鱼体生长和/或降低体脂肪含量的用途；和/或，提高亲本非特异免疫机能的用途。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。实施例1：本实施例提供一种雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼的杂交方法，该雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼的杂交方法具体通过以下步骤完成：1)亲本培育：将雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼暂养驯化达到亲鱼标准。上述亲鱼(即雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼)均可以来自野捕或市场，此处不进行限定。其中，在驯化过程中，对雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼分别喂养亲本饲料，亲本饲料包括基础饲料和复合饲料添加剂，复合饲料添加剂含有甲壳素、蒲公英和姜黄素。示例性地，在驯化过程中，雌黄颡鱼/江黄颡鱼喂养包含0.02％～0.1％(重量百分比计)的复合饲料添加剂的亲本饲料；雄瓦氏黄颡鱼喂养包含0.005％～0.01％(重量百分比计)的复合饲料添加剂亲本饲料。挑选腹部膨大柔软，卵巢轮廓分明，手压腹部有流动感，生殖孔微红略外突的雌鱼和身体瘦长、生殖孔微红生殖乳突膨大的雄鱼作为亲鱼。雄性生殖乳突在繁殖季节特别明显，可长达1～2cm，可作为雌雄鉴别标准，同时一般雄体比雌体要大1/3～1倍。用小型挖卵器检查，可进一步确定雌鱼成熟度。2)人工催产：采取两针注射，提前催熟的办法，两针之间的时间间隔为10h。第一针作用是催熟，促进雌雄鱼性腺同步发育，因此药量不宜过大；第二针主要作用是促其排卵排精，药量应适当加大。按12～16h预计效应时间。具体针剂用量：第一针第一日早8点：第一针包括0.3ugLRHA2+0.5mgDOM第二针第一日下午5点：第二针包括1200IUHCG+5ugLRHA2+3mgDOM其中，HCG：人绒毛膜促性腺激素；LRHA2：促黄体释放激素A2；DOM：地欧酮。备注：HCG：人绒毛膜促性腺激素；LRHA2：促黄体释放激素A2可选地，人工催产的过程中，水温为27～28℃。可选地，人工孵化的过程中，水温为28～30℃。3)自然授精：在繁殖期内，直接将雌雄鱼并塘，其中投放的雌黄颡鱼/江黄颡鱼和雄瓦氏黄颡鱼的比例为1:1.2。在此步骤中，可以设置人工鱼巢，引诱雄瓦氏黄颡鱼在巢中产卵。在此步骤中，雄瓦氏黄颡鱼根据产卵习性，可分批产卵，雌黄颡鱼/江黄颡鱼也可重复利用，使得杂交方法的成本较低。4)人工孵化：取出受精卵在水泥池中孵化，水泥池中的水为地下水。具体为，将受精卵均匀粘附于着卵板上，放入水泥池中进行孵化，水泥池中的水为稳定的地下水(例如，微流水)，水泥池应该遮光遮阳，保持安静。在28～30℃的条件下，第三日早10：00检查其受精率。第三日下午18：00～22：00，小苗孵化出膜。至小苗出膜12h后，将着卵板拿去，以免坏水，保持水质清新。刚孵化出的小鱼，形似蝌蚪，体形相似于黄颡鱼。其个体长约1～1.5cm，靠其自身卵黄供给营养，出膜4天后，投喂蛋黄及小型枝角类。小鱼摄食良好，生长速度较快。出膜7天后出苗，统计出苗量，计算出苗率。实施例2：本实施例提供一种含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂的制备方法，该制备方法包括：1)将复合饲料添加剂配方中原料(甲壳素、蒲公英、姜黄素、玉米粉、酵母)进行粉碎，过80目标准筛，备用；2)按配方分别称取甲壳素20g，蒲公英20g，姜黄素16g，玉米粉694g，酵母250g备用；3)将甲壳素、蒲公英、姜黄素、玉米粉、酵母加入至不锈钢小型混合机(中南制药机械生产)中进行混合，混合均匀度达到95％以上，变异系数≤5％，制备得复合饲料添加剂。该复合饲料添加剂用于和基础饲料混合，以制备亲本饲料。示例性地，亲本饲料中复合饲料添加剂的添加量为0.005％。实施例3：本实施例提供一种含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂的制备方法，该制备方法包括：1)将复合饲料添加剂配方中原料(甲壳素、蒲公英、姜黄素、淀粉、鱼粉、面粉)进行粉碎，过80目标准筛，备用；2)按配方分别称取甲壳素40g、蒲公英30g、姜黄素20g、淀粉500g、鱼粉210g、面粉200g备用；3)将甲壳素、蒲公英、姜黄素、淀粉、鱼粉、面粉，加入至不锈钢小型混合机(中南制药机械生产)中进行混合，混合均匀度达到95％以上，变异系数≤5％，制备得复合饲料添加剂。该复合饲料添加剂用于和基础饲料混合，以制备亲本饲料。示例性地，亲本饲料中复合饲料添加剂的添加量为0.1％。实施例4：本实施例提供一种亲本饲料包括的基础饲料，该基础饲料的配方为，以风干物质重量百分比计：鱼粉4％，豆粕8％，菜粕22％，进口肉骨粉3％，小麦15％，麸皮8％，细米糠10％，沸石粉1％，膨润土2％，磷酸二氢钙2％，豆油2％，复合维生素0.1％，复合矿物质0.8％，其余为棉粕，总量为100％。实施例5：在上述基础饲料中分别加入四组不同剂量的复合饲料添加剂，制成亲本饲料，并使亲本饲料中复合饲料添加剂的重量比含量分别为0.005％，0.01％，0.02％，0.05％，0.10％，即对应梯度分别为0.05kg/t饲料(表一和表二中用“S0.05”表示，下同)，0.1kg/t饲料(S0.1)，0.2kg/t饲料(S0.2)，0.5kg/t饲料(S0.5)，1.0kg/t饲料(S1.0)；同时设置不含复合饲料添加剂的空白对照组C，阳性对照组D1[即上述基础饲料中添加重量比0.05％的L-肉碱(50％含量)]，阳性对照组D2(即上述基础饲料中添加重量比0.1％的磺胺胍)。利用上述7组饲料对不同亲鱼进行养殖实验，前两组针对雄瓦氏黄颡鱼，后三组针对雌黄颡鱼/江黄颡鱼，养殖实验周期为90天，放养每尾亲鱼平均重量规格为50g左右，每组设3个平行。数据处理：试验数据均以“平均值±标准差”表示，结果用SPSS12.0版统计软件中One-wayANOVA过程进行方差分析，并进行Duncan氏多重比较，P<0.05为差异显著。养殖结果如下：(1)对鱼体生长的影响表一示出了复合饲料添加剂对雌黄颡鱼/江黄颡鱼的鱼体生长指标的影响，表二示出了复合饲料添加剂对雄瓦氏黄颡鱼的鱼体生长指标的影响，结合表一和表二即可看出，使用了复合饲料添加剂的组的增重率和特定生长率高于各自空白对照组C，两组间具有显著性差异(P<0.05)，表明添加复合饲料添加剂能够提高鱼类的生长速度，对鱼类具有促生长作用。随着复合饲料添加剂的添加量的增加，复合饲料添加剂各组间较各自空白对照组C在增重率方面提高了20％以上，特定生长率提高了18％以上。实验结果表明亲本饲料中复合饲料添加剂含量在0.05-1.0kg/t范围内对鱼体具有显著的促生长效果。与同类添加剂相比，饲料中复合饲料添加剂的含量在0.05～1.0kg/t生长效果能够达到或超过阳性对照组D1和阳性对照组D2。表一：复合饲料添加剂对雌黄颡鱼/江黄颡鱼的鱼体生长指标的影响表二：复合饲料添加剂对雄瓦氏黄颡鱼的鱼体生长指标的影响注明：上标中不同字母代表具有显著性差异，相同字母代表无显著性差异，显著性水平为α＝0.05。(2)对鱼体抗氧化能力和脂质过氧化物的影响驯养之前的亲鱼其特异性免疫应答能力相对低下，因此，非特异性免疫在其免疫防御中具有重要意义。总抗氧化能力、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶反映机体抗氧能力和免疫防御能力。溶菌酶是一种非特异性体液免疫因子，广泛存在于鱼类体表黏液、肠道黏液、血清和巨噬细胞中，其活性变化可以反映鱼类非特异性免疫力的变化，即溶菌酶活性升高，鱼类的非特异性免疫功能增强。丙二醛是生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应后的氧化终产物，具有细胞毒性。表三示出了复合饲料添加剂对雌黄颡鱼/江黄颡鱼的鱼体抗氧化功能的影响，表四示出了复合饲料添加剂对雄瓦氏黄颡鱼的鱼体抗氧化功能的影响。结合表三和表四可知，对总抗氧化能力、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶测定，分别包含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂，雌黄颡鱼/江黄颡鱼以及雄瓦氏黄颡鱼各组在总抗氧化能力、谷胱甘肽过氧化物酶活性方面都与各自空白对照组C间具有显著性差异(P<0.05)。S0.1，S0.2，S0.5，S1.0组与空白对照组C的超氧化物歧化酶活性具有显著差异(P<0.05)，而S0.05组与空白对照组C超氧化物歧化酶活性无显著性差异(P>0.05)，但是S0.05超氧化物歧化酶活性高于雄瓦氏黄颡鱼空白对照组C。溶菌酶活性结果显示，包含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂各组、阳性对照组D1和阳性对照组D2溶菌酶活性均高于各自空白对照组C，但是各组间均无显著性差异(P>0.05)。包含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂可以提高鱼体溶菌酶活性，增强鱼体的免疫防御功能。脂质过氧化产物丙二醛结果显示，包含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂各组与雌黄颡鱼/江黄颡鱼以及雄瓦氏黄颡鱼各自空白对照组C丙二醛含量具有显著的差异性(P<0.05)，包含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂各组丙二醛含量显著低于雌黄颡鱼/江黄颡鱼以及雄瓦氏黄颡鱼各自空白对照组C。S0.05、S0.1组丙二醛含量低于雄瓦氏黄颡鱼阳性对照组D1，S1.0组丙二醛含量低于雌黄颡鱼/江黄颡鱼阳性对照组D1，且具有显著性差异(P<0.05)。S0.2和S0.5组丙二醛含量与雌黄颡鱼/江黄颡鱼阳性对照组D1接近，但分别与雌黄颡鱼/江黄颡鱼阳性对照组D1无显著性差异(P>0.05)。包含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂各组与雌黄颡鱼/江黄颡鱼以及雄瓦氏黄颡鱼阳性对照组D2相比较，包含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂各组丙二醛含量均低于各自阳性对照组D2，且二者具有显著性差异(P<0.05)。表明包含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂，能够显著降低血清中丙二醛含量，降低脂质过氧化产物对机体的损伤作用。包含不同添加量的甲壳素、蒲公英、姜黄素复合饲料添加剂在超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物活性、总抗氧化能力和溶菌酶活性是高于各自空白对照组C，高于或接近各自阳性对照组D1和阳性对照组D2。对于血清丙二醛含量，不同添加量的包含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂低于各自空白对照组C，同时低于或接近各自阳性对照组D1和阳性对照组D2。表明添加包含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂能够提高机体的抗氧化能力和降低脂质过氧化物，提高机体的免疫防御能力，增强抗病力。包含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂的不同添加量各组与阳性对照组D1和阳性对照组D2相比，在比较低添加量范围内发挥的作用效果也很明显。表三：复合饲料添加剂对雌黄颡鱼/江黄颡鱼的鱼体抗氧化功能的影响表四：复合饲料添加剂对雄瓦氏黄颡鱼的鱼体抗氧化功能的影响注明：上标中不同字母代表具有显著性差异，相同字母代表无显著性差异，显著性水平为α＝0.05。SOD：超氧化物歧化酶；GSH-Px：谷胱甘肽过氧化物酶；T-AOC：总抗氧化能力；LSZ：溶菌酶活性；MDA：丙二醛。(3)对鱼体形体影响鱼体的肥满度，体长/体高比和内脏指数反映鱼体的形体。肥满度表示鱼体的体重与体长立方的比值。表五示出了复合饲料添加剂对雌黄颡鱼/江黄颡鱼的鱼体形体指标的影响，表六示出了复合饲料添加剂对雄瓦氏黄颡鱼的鱼体形体指标的影响。结合表五和表六可知，包含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂各组分别与雌黄颡鱼/江黄颡鱼或雄瓦氏黄颡鱼空白对照组C间的肥满度无显著性差异(P>0.05)，但包含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂各组的肥满度高于各自空白对组C。S0.05、S0.1组鱼体内脏指数和体长/体高比分别与雄瓦氏黄颡鱼空白对照组C、雄瓦氏黄颡鱼阳性对照组D1和雄瓦氏黄颡鱼阳性对照组D2间均无显著差异(P>0.05)，S0.2、S0.5组鱼体内脏指数和体长/体高比分别与雌黄颡鱼/江黄颡鱼空白对照组C、雌黄颡鱼/江黄颡鱼阳性对照组D1和雌黄颡鱼/江黄颡鱼阳性对照组D2间均无显著差异(P>0.05)，S1.0的内脏指数低于雌黄颡鱼/江黄颡鱼空白对照组C，而S1.0体长/体高比则高于雌黄颡鱼/江黄颡鱼空白对照组C。体型改变、内脏指数降低，说明包含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂对于亲鱼体的营养品质具有一定的改善作用。表五：复合饲料添加剂对雌黄颡鱼/江黄颡鱼的鱼体形体指标的影响表六：复合饲料添加剂对雄瓦氏黄颡鱼的鱼体形体指标的影响组别肥满度％内脏指数(％)体长/体高比空白对照组C1.67±0.339.03±1.62ab4.82±0.33ab阳性对照组D11.82±0.0910.10±0.99a4.72±0.15ab阳性对照组D21.83±0.079.19±0.75ab4.66±0.13aS0.051.73±0.2110.12±0.95a4.75±0.20aS0.11.81±0.0910.14±0.97a4.73±0.12a注明：上标中不同字母代表具有显著性差异，相同字母代表无显著性差异，显著性水平为α＝0.05。(4)受精率、孵化率、出苗率的计算方法：当卵发育到原肠中期时，随机捞取一定数量卵子，对白色浑浊的卵子(坏卵)和受精卵(好卵)进行计数，得出受精率。受精率(％)＝受精卵数/卵粒总数×100％观察记录鱼苗出膜时间，待完全出膜后，对孵出的鱼苗进行估算，得出孵化率。孵化率(％)＝孵出鱼苗数/受精卵数×100％鱼苗平游出口摄食，计算平游开口摄食鱼苗数，得出出苗率。出苗率(％)＝平游鱼苗数/受精卵数×100％表七示出了雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼杂交情况。表中对应的雌黄颡鱼/江黄颡鱼喂养的亲本饲料为：亲本饲料里包含有基础饲料，以及0.02％(重量百分比)的复合饲料添加剂，复合饲料添加剂包含甲壳素、蒲公英、姜黄素；表中对应的雄瓦氏黄颡鱼喂养的亲本饲料为：亲本饲料里包含有基础饲料，以及0.005％(重量百分比)的复合饲料添加剂，复合饲料添加剂包含甲壳素、蒲公英、姜黄素。表七雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼杂交情况测卵数受精卵数出膜鱼苗数平游鱼苗数受精率(％)孵化率(％)出苗率(％)20016510710382.564.862.4194151999277.865.660.913998756670.576.567.3148115797477.768.764.32121591141047571.765.4157107695868.264.554.2结合表七可知，每一批受精卵所得结果受精率、孵化率以及出苗率非常均衡、稳定，说明包含有甲壳素、蒲公英、姜黄素的复合饲料添加剂对于雌黄颡鱼/江黄颡鱼与雄瓦氏黄颡鱼杂交，具有一定效果。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页1 2 3