间歇浸没式荔浦芋组培苗快速增殖的方法及荔浦芋种苗与流程

本发明涉及植物组织培养领域，具体而言，涉及间歇浸没式荔浦芋组培苗快速增殖的方法及荔浦芋种苗。

背景技术：

芋[Colocasia esculenta(L.)Schott]，又名芋艿、芋头、毛芋，为天南星科(Araceae)芋属(Colocasia Schott)，多年生单子叶草本植物。芋是一种重要的蔬菜和药用植物，在我国具有悠久的栽培历史。同时，芋还是迄今发现的耐盐性最强的蔬菜作物之一，长期栽培可以降低土壤的盐渍化程度，对滩涂的开发和利用具有较大的应用价值。全球芋头种植面积最大的非洲，占芋头种植总面积的79.9％，亚洲种植面积占7.6％，主要集中在中国、日本、菲律宾、泰国等。中国的槟榔芋产区主要分布在广西、广东、海南、福建；湖北、浙江、山东、四川、江西以多子芋为主，著名品种有广西荔浦芋、福建福鼎芋、广东乐昌炮弹芋、靖江香沙芋等。

自然条件下栽培的芋艿品种基本上不开花，因此，常规的芋的栽培方法是用球茎作种，每亩用种100～150公斤。然而，这不仅耗费了大量商品芋，而且还需要解决芋种越冬问题。同时，长期无性繁殖和蚜虫的传播，也会使得使芋感染上一种或多种病毒。长期以来，由于没有注重种源的提纯复壮工作，荔浦芋出现严重退化，抗病抗逆性下降，产量品质也明显下降。到目前为止，我国的芋艿产区已经100％受到芋花叶病毒的侵染，在栽培过程中芋还易患芋软腐病、芋疫病，严重影响芋艿的生产、销售及品种的交换和种质资源的保存工作。

组织培养可以在短时间内获得大量荔浦芋健康种苗，国内关于荔浦芋 组织培养的研究很多，主要包括茎尖脱毒、提纯复壮与快繁。传统组织培养：采用固体培养基培养茎顶生长点附近的芽(顶芽、腋芽)，使之大量分蘖繁殖，繁殖一定数量后，诱导芽长出根，形成完整植株。

然而，传统的组织培养育苗方法仍有很多问题，具体如下：

(1)传统组织培养方法操作过程中需要大量的手工劳动，是一种劳动密集型技术，机械化程度低，培育成本高；

(2)现有技术荔浦芋的增殖系数一般为5倍，效率很低；

(3)现有技术中，荔浦芋组培苗生根后，需要转移到自然环境中进行炼苗处理15～20天，才能移栽到营养杯中，育苗步骤较多且耗时较长，育苗时间也难以控制。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种间歇浸没式荔浦芋组培苗快速增殖的方法，本发明方法中通过间歇浸没液体培养系统进行组培苗培养，能够有效提高培养物的质量与繁殖系数；同时，本发明方法中，无需炼苗，简化了培育操作程序，缩短组培苗生产周期，而且培养效率高。

本发明的第二目的在于提供一种荔浦芋种苗，本发明荔浦芋种苗由本发明方法培育得到，具有移栽成活率高等优点。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

间歇浸没式荔浦芋组培苗快速增殖的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)建立间歇浸没液体培养系统：分别配置继代增殖液体培养基和生根液体培养基，并将所配置的培养基和间歇浸没式生物反应器灭菌后备用；

(2)接种与继代增殖培养：制备荔浦芋外植体，并将荔浦芋外植体接种于间歇浸没式生物反应器中，并在继代增殖液体培养基中进行继代增殖培养；

(3)生根培养：继代增殖培养结束后，将间歇浸没式生物反应器中的培养基替换为生根液体培养基，并继续进行生根培养；

(4)生根苗移栽：生根培养结束后，将所得组培生根苗移栽至培养杯中育苗，并将所得种苗移栽至田地。

可选的，本发明中，步骤(1)中所述继代增殖液体培养基为添加有6-BA、NAA、PP₃₃₃以及白砂糖的基础MS培养基；

其中6-BA的浓度为4～5mg/L，NAA的浓度为0.05～0.1mg/L，PP₃₃₃的浓度为0.2～0.5mg/L,白砂糖的浓度为30～40g/L。

可选的，本发明中，步骤(1)中所述生根液体培养基为NAA、IBA、PP₃₃₃以及白砂糖的基础MS培养基；

其中NAA的浓度为0.3～0.5mg/L，IBA的浓度为0.4～0.5mg/L，PP₃₃₃的浓度为0.4～0.5mg/L,白砂糖的浓度为30～40g/L。

可选的，本发明中，步骤(2)制备荔浦芋外植体的具体步骤如下：取荔浦芋茎尖分生组织培养的第3代或第4代组培苗，并将诱导出的不定芽切为单芽或双芽，剥离老叶，并保留芽体1～2cm，即得到荔浦芋外植体。

可选的，本发明中，步骤(2)中荔浦芋外植体的接种密度为：每升培养液中接种10～15株外植体。

可选的，本发明中，步骤(2)中继代增殖培养的具体条件为：培养温度25～30℃，光照强度1500～1800Lx，光照时间10～12h/d，培养时间25～30d。

可选的，本发明中，步骤(2)中继代增殖培养的浸没频率为5～10min/4～5h。

可选的，本发明中，步骤(3)中生根培养的条件为：培养温度27～30℃，光照强度1500～1800Lx，光照时间13～16h/d，培养时间20～25d。

可选的，本发明中，步骤(3)中生根培养的浸没频率为3～4min/6～8h。

同时，本发明还提供了由本发明方法培育得到的荔浦芋种苗。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明中，使用间歇浸没液体培养系统进行组培苗培育，能够有效防止有害物质在培养基中的积累，培养空间利用率高且利于培养气体成分交换，从而提高培养物质量与繁殖系数；

(2)本发明的培养基配方适合于使用间歇浸没式培养增殖荔浦芋组培苗，在本发明的培养基配方和培养条件下，继代一代增殖达30倍，增殖率远远高于传统组培方法；

(3)组培苗生根后无需再进行炼苗处理，生根与炼苗在同一反应器中同步完成，简化了组培操作程序；

(4)与传统荔浦芋组培苗相比，本发明的组培苗更粗壮。生根率达到95％以上，无需炼苗的移栽成活率可达到90％以上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为接种于间歇浸没液体培养系统1d的荔浦芋外植体；

图2为接种于间歇浸没液体培养系统10d的荔浦芋外植体；

图3为接种于间歇浸没液体培养系统20d的荔浦芋外植体；

图4为生根培养所得荔浦芋生根苗。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

按照植物学分类，天南星科(Araceae)芋属(Colocasia Schott)植物有20种，我国有6种，分别是勐腊芋、大野芋、芋、滇南芋、卷苞芋和假芋。其中芋[Colocasia esculenta(Linn.)Schott]是食用最为普遍的种，滇南芋虽然也有一些类型的植物部位可以食用，但栽培和食用的地区仅限于我国云南、广西等地；

而按照园艺学分类，芋分为魁芋、魁子用芋、多子芋和多头芋；

其中，a魁芋：母芋、子芋和孙芋按代数等级生长排列，彼此易分离，子芋多具短柄，母芋质量占球茎总质量的一半以上，以食母芋为主的芋类型。

b魁子兼用芋：母芋、子芋和孙芋按代数等级生长排列，彼此易分离，子芋多具短柄，母芋质量与子孙芋质量相当，母芋及子芋、孙芋均宜食用的芋类型。

c多子芋：母芋、子芋和孙芋等按代数等级生长排列，彼此易分离，子芋无柄，子芋和孙芋等的质量占球茎总质量的一半以上，以食子芋、孙芋为主的芋类型。

d多头芋：母芋、子芋和孙芋生长排列无明显代数等级差别，相互连接 成一个整体而不易分离的芋类型。

本发明中所要培育的荔浦芋，为天南星科芋属，是槟榔芋的著名品种，属魁芋类型，多年生草本，植株高1.3～1.7米，叶片长0.5～0.7米，叶柄长1～1.3米，上部紫红色，下部青绿色，与叶片相连处有一红褐色圆斑。母芋长约0.3米，横径约0.1米，近似纺锤形，中部大，每株有子芋十多个，呈棒槌形，尾部略弯，孙芋、曾孙芋呈藤状。横切面为灰白色并具有明显紫色槟榔花纹，肉质细粉松散，味甘甜且具有独特芬芳香味，营养丰富。生长期240～270天，单株产量2～3公斤,亩产约2000公斤。

荔浦芋为广西壮族自治区名特产蔬菜之一，在广西全区各地均有栽培，是广西极具特色和历史的农作物，有400年的人工栽培历史，为国家地理标志保护农产品，全区仅荔浦县种植荔浦芋5万余亩，亩产平均达2000公斤，总产量达10万吨，年总产值超过6亿元。

为促进荔浦芋生产向高产、优质、高效方向发展，各级政府高度重视发展“荔浦芋”这个支柱产业，全面提升荔浦芋市场竞争力，以实施农业标准化手段和方法，加快农业先进适用技术和科技成果在荔浦芋生产上的推广应用，从而带动荔浦芋生产及其它标准化、无公害蔬菜的发展，为科技兴农作出贡献。

本发明也是为荔浦芋标准化和高效培育提供了新的思路，也是为荔浦芋的普及和推广做出一份贡献！

间歇浸没液体培养系统，是一套集植物组织培养和植物次生代谢物质研究为一体的设备，其原理是利用液体培养基以经过过滤的空气压力为动力对植物组培苗进行间歇式培养，植物在液体培养的过程中提供了一个良好的环境，可以很好地进行培养器中的气体(包括容器中气体和培养基中的气体成分)交换。培养基的循环利用可很有效的防止营养沉积和有害物 质的积累，从而更有效利用培养基的营养成分。目前并没有使用间歇浸没液体培养系统进行荔浦芋培养的相关报道。

本发明所述间歇浸没液体培养系统，包括荔浦芋培养所用培养基以及间歇浸没式生物反应器；

其中，所述培养基分为继代增殖液体培养基和生根液体培养基；

进一步的，所述继代增殖液体培养基为添加有6-BA、NAA、PP₃₃₃以及白砂糖的基础MS培养基，培养基中所添加的各组分浓度具体可以为：6-BA 4、4.5或者5mg/L；NAA 0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或者0.1mg/L；PP₃₃₃ 0.2、0.3、0.4或者0.5mg/L；白砂糖30、32、35、37或者40g/L；

同时，所述生根液体培养基为添加NAA、IBA、PP₃₃₃以及白砂糖的基础MS培养基，培养基中所添加的各组分浓度具体可以为：NAA 0.3、0.4或者0.5mg/L；IBA 0.4或者0.5mg/L；PP₃₃₃ 0.4或者0.5mg/L；白砂糖30、35或者40g/L；

其中，所述间歇浸没式生物反应器可以为市售或者自制反应器。如图1中所用到的装置所示，本发明所用间歇浸没式生物反应器的主要结构包括：培养容器装置、载物构件和运输配件，所述的培养容器装置包括容器主体以及通过螺纹啮合的密封盖体；所述容器密封盖体顶部设有气体交换的通孔；所述容器主体侧壁的一端其底部与顶部均各设一外伸开孔；所述载物构件包括载物筛盘以及固定框架，单个载物筛盘通过多个摞叠置于固定框架内,而固定框架再搁置于所述培养容器内；所述的运输配件包括硅胶软管、蠕动泵和储液容器，通过两条硅胶软管与所述的培养容器、蠕动泵、储液容器相连接；

进一步的，本发明反应器中，所述培养容器装置和储液容器均为容积3L的广口白色玻璃瓶，瓶高30cm，直径15cm，储液瓶中液体培养基体积为 1L/瓶；

在进行接种培养前，要首先将包括培养基和间歇浸没式生物反应器的间歇浸没液体培养系统采用热湿灭菌法进行灭菌。

接下来就是具体的培养过程，首先是制备荔浦芋外植体。本发明外植体制备所用原料为荔浦芋茎尖分生组织培养的第三代或第4四代组培苗，并将这些组培苗在诱导培养过程中所长出的不定芽切成单芽或双芽，剥离老叶，留芽体1～2cm，将前代培养中发黑或者变黄的叶片完全去除，同时要注意不能破坏芽体的生长点和基部的芽点；

然后，在无菌环境中，将制得的荔浦芋外植体接种到装载有继代增殖液体培养基的如前所述的间歇浸没式生物反应器中，并将接种密度控制在10～15株外植体/L培养液，例如可以为，但不限于11、12、13、14或者15株外植体/L培养液，并进行继代增殖培养；

继代增殖培养要控制培养的温度为25～30℃，例如可以为，但不限于26、28或者29℃等；光照强度为1500～1800Lx，例如可以为，但不限于1600或者1700Lx等；光照时间为10～12h/d，例如可以为12h光照、12h黑暗或者11h光照、13h黑暗等；培养时间25～30d，例如可以为，但不限于26、27、28或者29d等；

同时，在继代增殖培养过程中，还要对间歇浸没式生物反应器进行设置，并调控浸没频率为5～10min/4～5h，即，每4～5h进行一次浸没换气培养，每次培养的时间控制在5～10min。

进一步的，在继代增殖培养过程中需要注意的是，要控制培养代数控制在12代以内，以防止组培苗变异的发生；

然后，将间歇浸没式生物反应器中的培养基替换为生根液体培养基，并将继代增殖培养产物继续进行生根培养；

生根培养需要控制培养的温度在27～30℃，例如可以为，但不限于28、29或者30℃；光照强度在1500～1800Lx，例如可以为，但不限于1600、1700或者1800Lx；光照时间为13～16h/d，例如可以为，但不限于14h光照、10h黑暗或者15h光照，13h黑暗等；培养时间20～25d，例如可以为，但不限于21、22、23或者24h等；

同时，在生根培养过程中，还要对间歇浸没式生物反应器进行设置，并调控浸没频率为3～4min/6～8h，即，每6～8h进行一次浸没换气培养，每次培养的时间控制在3～4min。

在生根培养后，本发明无需进行炼苗处理，在生根过程中实际上已经完成了炼苗的过程，因而能够大大减少育苗的周期；

将生根后的组培苗根部洗净后，可以直接移栽至培养杯中，在培养杯中育苗60d后，即可将所得种苗移栽至田地中。

实施例1

本发明所提供的间歇浸没式荔浦芋组培苗快速增殖的方法具体步骤参考如下：

(1)间歇浸没液体培养系统(TIBs系统)的建立：培养瓶和储液瓶为容积3L的广口白色玻璃瓶，瓶高30cm，直径15cm，储液瓶中液体培养基体积为1L/瓶，培养基配置完成后，整套装置采用湿热灭菌法进行灭菌后备用。

(2)材料选择：采用荔浦芋茎尖分生组织培养的第三代或第4四代组培苗为原材料；

(3)外植体的制备：将原材料组培苗在诱导过程中长出的不定芽切成单芽或双芽，剥离老叶，留芽体1～2cm，将前代培养中发黑或者变黄的叶片完全去除，注意不能破坏芽体的生长点和基部的芽点；

(4)接种与增殖培养：在无菌环境下将荔浦芋外植体接种到间歇浸没式生物反应器中，接种密度为每升继代增殖培液体养基10～15株外植体，并进行继代增殖培养；

其中，继代增殖液体培养基配方为：MS+6-BA 4mg/L+NAA 0.05mg/L+PP₃₃₃0.2mg/L+30g/白砂糖，PH值为6.0；

具体培养条件为：温度28±1℃，光照1500Lx，12小时光照，12小时黑暗，设定间歇浸没式生物反应器的相关参数，即间歇培养的间歇频率为每4小时一次，培养时间为5分钟，培养时间30天；

同时，间歇浸没式荔浦芋继代增殖培养代数控制在12代以内，以防止组培苗变异的发生。

(5)生根培养：待增殖培养结束后，将培养基更换为生根液体培养基；

其中，生根液体培养基配方为：MS+NAA 0.3mg/L+IBA 0.4mg/L+PP₃₃₃0.4mg/L+30g/L白砂糖，PH值为6.0；

具体培养条件为：温度28±1℃，光照1500Lx，14小时光照，10小时黑暗，设定间歇浸没式生物反应器的相关参数，即间歇培养的间歇频率为每6小时一次，培养时间为3分钟，培养时间20天；

(6)生根苗的移栽：生根结束后无需再进行炼苗处理，用清水洗干净根部，直接移栽至营养杯中，在营养杯中育苗60天左右即可移栽至大田。

各培养阶段外植体或种苗的形态如图1-4所示，具体的，接种于间歇浸没液体培养系统1d的荔浦芋外植体如图1所示；接种于间歇浸没液体培养系统10d的荔浦芋外植体如图2所示；接种于间歇浸没液体培养系统20d的荔浦芋外植体如图3所示；生根培养所得荔浦芋生根苗如图4所示。

进一步对本发明各阶段培育产物进行检测，结果发现，本发明培育得到的组培苗相较于传统方法而言，明显外形更加粗壮；同时，组培苗的发 芽率达到95％以上，而移栽成活率也能够达到90％以上。

本发明自动化程度高，节省劳动成本，并可在短时间内获得大量荔浦芋组培苗，极大缩短生产周期，效率高，增加经济效益。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。