本发明属于植物栽培领域，具体的讲，涉及西伯利亚杏体细胞胚胎发生的一种方法。
背景技术：
西伯利亚杏（Armeniaca sibirica (L.) Lam）主要分布于我国北方地区，是我国北方地区的主要经济树种和生态绿化树种，具有广泛应用和实际价值。西伯利亚杏繁殖常用方法主要是播种繁殖和嫁接方法,嫁接方法繁殖能够保持品种的优良特性,遗传性状稳定,但通过嫁接繁殖速度慢,严重阻碍了优良品种在大批量生产的推广应用。播种繁殖需要通过层积等技术，种子处理时间长，要求高，且由于种子产量往往受到气候影响，限制了西伯利亚杏播种苗培养。利用植物体细胞胚胎发生方式能用较少的材料,在较短时间内大量繁殖出统一优良性状的西伯利亚杏苗木。应用体胚发生技术繁殖苗木,其不受地区、气候等影响,扩繁速度比常规方法快数万倍，广泛应用到多种植物上。但迄今为止,西伯利亚杏组培苗在生产尚未应用，对西伯利亚杏体胚发生的研究未见报道。王鸿、马锋旺以西伯利亚杏下胚轴、子叶、茎尖和无性系叶片作为外植体,研究培养试管苗不同外植体、外源植物生长调节剂、培养基类型、培养时间、接种方式等因素对增殖效率、愈伤组织诱导率、再生频率和试管苗生根的影响。刘小蕾、刘艳萌、张学英等通过对西伯利亚杏的茎尖、叶片和下胚轴组织培养初步建立了西伯利亚杏再生体系。本文以西伯利亚杏成熟胚为外植体，经愈伤组织途径诱导胚性愈伤、胚性愈伤组织继代增殖、体细胞胚胎的分化与同步化，以及体细胞胚的成熟与萌发，从而建立西伯利亚杏体胚发生体系，为西伯利亚杏快速繁殖、种质资源保护等提供参考，为西伯利亚杏人工种子的开发应用奠定基础。
技术实现要素：
本发明目的为了解决运用体细胞胚胎发生技术实现西伯利亚杏快繁问题，以西伯利亚杏成熟胚为外植体，以B5、WPM等基本培养基附加不同浓度的6-BA、2,4-D、KT、NAA、ABA以及有机附加物等来诱导胚性愈伤组织、胚性愈伤组织增殖、体细胞胚胎分化与同步化、以及体胚成熟与植株再生，并提供一种诱导、继代及成苗时的方法及培养条件，以实现植株再生与快繁。
本发明目的实现由以下技术方案完成：
本发明包括以下生产步骤：
（1）将成熟的西伯利亚杏种子用刷子刷去表面残渣，以3%高锰酸钾溶液浸泡12小时后，自来水冲洗3遍，在干净的环境下破壳，取出西伯利亚杏种仁。在超净工作台中，先用无菌水将种仁冲洗三遍，用75%酒精浸泡30s后用无菌水清洗3-5次,再用 2%次氯酸钠溶液消毒3 min,然后用无菌水冲洗3-5次；
（2）将经步骤（1）处理过的种子以手术刀剥取完整的种胚后，接种于下列培养基中：B5培养基+6-BA（0.3mg/L）+2,4-D（0.9mg/L）+KT（0.25mg/L）+蔗糖（30g/L）+琼脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行诱导培养35天生成愈伤组织；
（3）将步骤（2）所述的愈伤组织接种于以下培养基中：B5培养基+NAA（0.5mg/L）+ KT（0.2mg/L）+蔗糖（20g/L）+ 还原型谷胱甘肽（100mg/L）+琼脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行继代培养30天诱导产生胚性愈伤组织；
（4）将步骤（3）所述的胚性愈伤组织接种于下列培养基中：B5培养基+NAA（0.2mg/L） +蔗糖（20g/L）+水解乳蛋白（500mg/L）+琼脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行增殖培养，每隔30天以相同配方继代培养进行增殖；
（5）将步骤（4）所述的胚性愈伤组织接种于下列培养基中：B5培养基+6-BA（0.5mg/L）+NAA（1.0mg/L） +蔗糖（20g/L）+水解酪蛋白（800mg/L）+谷氨酰胺（200mg/L）+琼脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行分化培养30天；
（6）将步骤（5）所述的分化而来的上期原胚接种于下列培养基中：B5培养基+ABA（1.5mg/L）+蔗糖（55g/L）+水解酪蛋白（800mg/L）+谷氨酰胺（200mg/L）+肌醇（500mg/L）+琼脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下同步化培养15天，使上期胚胎发生发育达到同步化；
（7）将步骤（6）所述的同步化体细胞胚接种于B5培养基+蔗糖（30g/L）+琼脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下培养20天后，体胚发育成熟，达到萌发的指标。
（8）将步骤（7）所述的分化成熟体细胞胚接种于1/2WPM培养基+蔗糖（20g/L）+琼脂（6g/L）, pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、3000Lx光照条件下培养30天后即可长成根茎叶健全的健壮西伯利亚杏幼苗。
本发明的优点是以西伯利亚杏成熟胚为外植体，不受季节与环境条件的影响，繁殖方式低耗高效，能很好地保留西伯利亚杏的优良杏状不发生改变，对西伯利亚杏种苗的生产繁育提供了强有利的保证。
具体实施方案：
实施例1
（1）将成熟的西伯利亚杏种子用刷子刷去表面残渣，以3%高锰酸钾溶液浸泡12小时后，自来水冲洗3遍，在干净的环境下破壳，取出西伯利亚杏种仁。在超净工作台中，先用无菌水将种仁冲洗三遍，用75%酒精浸泡30s后用无菌水清洗3-5次,再用 2%次氯酸钠溶液消毒3 min,然后用无菌水冲洗3-5次；
（2）将经步骤（1）处理过的种子以手术刀剥取完整的种胚后，接种于下列培养基中：B5培养基+6-BA（0.3mg/L）+2,4-D（0.9mg/L）+KT（0.25mg/L）+蔗糖（30g/L）+琼脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行诱导培养35天生成愈伤组织；
（3）将步骤（2）所述的愈伤组织接种于以下培养基中：B5培养基+NAA（0.5mg/L）+ KT（0.2mg/L）+蔗糖（20g/L）+ 还原型谷胱甘肽（100mg/L）+琼脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行继代培养30天诱导产生胚性愈伤组织；
（4）将步骤（3）所述的胚性愈伤组织接种于下列培养基中：B5培养基+NAA（0.2mg/L） +蔗糖（20g/L）+水解乳蛋白（500mg/L）+琼脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行增殖培养，每隔30天以相同配方继代培养进行增殖；
（5）将步骤（4）所述的胚性愈伤组织接种于下列培养基中：B5培养基+6-BA（0.5mg/L）+NAA（1.0mg/L） +蔗糖（20g/L）+水解酪蛋白（800mg/L）+谷氨酰胺（200mg/L）+琼脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下进行分化培养30天；
（6）将步骤（5）所述的分化而来的上期原胚接种于下列培养基中：B5培养基+ABA（1.5mg/L）+蔗糖（55g/L）+水解酪蛋白（800mg/L）+谷氨酰胺（200mg/L）+肌醇（500mg/L）+琼脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下同步化培养15天，使上期胚胎发生发育达到同步化；
（7）将步骤（6）所述的同步化体细胞胚接种于B5培养基+蔗糖（30g/L）+琼脂（6g/L），pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、暗条件下培养20天后，体胚发育成熟，达到萌发的指标。
（8）将步骤（7）所述的分化成熟体细胞胚接种于1/2WPM培养基+蔗糖（20g/L）+琼脂（6g/L）, pH控制在5.8～6.0、温度为23±2℃、3000Lx光照条件下培养30天后即可长成根茎叶健全的健壮西伯利亚杏幼苗。
本发明方法胚性愈伤诱导率为68.5%，增殖期以3.8倍速率增殖，分化期胚性愈伤平均分化产生体细胞胚165个/g，成熟体细胞胚萌发率为86.5%。
虽然以上对本发明目的的构思和实施例作了详尽说明，但本领域普通技术人员可以认识到，在没有脱离权利要求限定范围的前提条件下，仍然可以对本发明作出各种改进和变换，而这种改进和变换仍然应当属于本发明的保护范围。