本发明涉及一种组培方法，具体涉及一种保加利亚精油玫瑰的继代培养方法，属于生物技术领域。
背景技术：
保加利亚玫瑰属蔷薇科、蔷薇属，落叶灌木。由于保加利亚玫瑰属国际香型，出油率高达万分之三点六，是提取玫瑰精油和生产玫瑰纯露(鲜花水)的最佳品种。保加利亚玫瑰产量极大，可以达到亩产鲜花500～750公斤，亩产干花、干花蕾80～100公斤。
保加利亚的玫瑰是世界公认的优质玫瑰品种，花香纯粹、细致，属国际淡香型，花期相对集中，开花时散发出清甜的香味，是萃取玫瑰精油和加工玫瑰露的最佳品种，因而被广泛种植用以提取玫瑰油，具有很高的经济价值。保加利亚的玫瑰产业已有300多年的历史，素有"玫瑰王国"之美誉。用保加利亚玫瑰鲜花生产的玫瑰纯露，每公斤售价达1000美元。从保加利亚玫瑰鲜花中提取的玫瑰精油，每公斤售价高达7000～8000美元，素有"液体黄金"之称。
保加利亚玫瑰适应性强，栽培管理容易，经济效益高。中国长江以北及北京以南地区均可栽培。是一项具有广阔市场前景和巨大开发潜能的新兴产业。
已有研究技术：
现有的关于玫瑰组织培养的报道中，多以激素组合为切入点进行玫瑰组织培养的研究。邓燕红等在《玫瑰组织培养研究》报道中采用MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.01mg/L+3％白糖+0.4g/L琼脂这一配方进行玫瑰的增殖培养，增殖倍数可达到6以上；
赵一鹏等在《玫瑰的组织培养技术》研究中也采用类相似的配方，仅对激素的浓度进行了调整，基本培养基选用MS，激素的变化范围在BA1.0mg/L～10mg/L,GA3 0.25-20mg/L,NAA和IAA 0.01-0.05mg/L；
张艳秋等在《玫瑰组织培养快繁技术》中提出，玫瑰在继代培养基MS+6-BA3.0mg/L+NAA 0.1mg/L中增殖系数最高，可以达到4；
于守超等以紫枝玫瑰为试验材料进行研究时《紫枝玫瑰组织培养的研究》，采用MS+1.8mg/l 6-BA+0.08mg/L NAA+0.4mg/l GA3效果很好；
《白花玫瑰植物组织培养初探》和《红花玫瑰植物组织培养的研究》分别以白花玫瑰和红花玫瑰作为试验材料，继代培养阶段使用相同的配方MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，增殖比例最高分别为3.24和3.75。
《食用玫瑰组培快繁关键技术研究》和《墨红玫瑰的组织培养研究》均选用云南当地的食用玫瑰品种“墨红”作为试验材料，增殖阶段的培养配方分别为MS+6-BA3.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/l+琼脂6g/l和MS+6-BA2.5mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，增殖系数分别为3.5和3.517。
《精油玫瑰组织培养技术研究》一文中，以“大马士革”玫瑰为材料，以MS为基本培养基，通过正交试验设计，得到的结论为：激素用6BA1.0mg/L和NAA0.01mg/l进行处理，培养基中碳源选择白砂糖用量为40g/L对玫瑰的增殖效果最好。
《大马士革玫瑰组织培养技术研究》经过试验得出的适宜大马士革玫瑰增殖培养的配方为WPM+6-BA3.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，增殖系数最高可达到5.1。
《玫瑰组织培养与快繁技术试验研究》以甘肃地区引进的良种“保加利亚”玫瑰进行组培研究，获得无菌外植体进入增殖培养阶段，采用MS+BA1.0+2,4-D 0.1，MS+BA1.0+IBA0.1和MS+BA1.0+NAA0.2这3种配方交互使用，以此获得高增殖系数的玫瑰组培苗。
已有研究报道不足之处：
上述研究报道所用的玫瑰材料可分为观赏用玫瑰、食用玫瑰和精油用玫瑰。植物组织培养技术的理论基础是细胞全能性理论，而即使是同属植物，因基因型不同，组织培养中所用的继代培养技术也有差异。精油用玫瑰体内芳香类物质较其他2类玫瑰丰富，因此直接影响到在其组培过程中对于各营养物质及调节物质的需求。在上述的报道中培养基中多以高浓度的6-BA(浓度大于2.0)搭配NAA进行培养，6-BA多代使用易积累可能降低组培苗的分化能力，同时以“保加利亚”玫瑰为材料进行组培研究，采用3种配方交互进行，这对于工厂化生产易造成管理上的混乱，不易进行生产工艺的控制。
本发明以“保加利亚”玫瑰为试验材料，采用一种配方增殖系数可达到4.5以上，成功实现玫瑰的工厂化生产。
技术实现要素：
本发明的目的在于，提供一种保加利亚精油玫瑰的继代培养方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。
本实验针对一种保加利亚精油玫瑰的继代培养过程，解决了一种保加利亚精油玫瑰组培快繁中增殖比例低，组培苗发黄且玻璃化的问题，从而实现保加利亚精油玫瑰组培工厂化生产。
本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
一种保加利亚精油玫瑰的组培快速繁殖方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)实验材料得选择：挑选长势整齐、植株高度为2.5-4.0cm、继代周期为30-35天、叶色呈绿色或嫩绿色的保加利亚玫瑰组培苗作为继代培养材料；
(2)具体实验步骤：
(2.1)材料的切割：切除叶片，保留顶芽心叶，叶柄留0.1-0.2cm，切割成0.5-0.8cm的茎段；
(2.2)保加利亚精油玫瑰继代培养；顶芽与茎段分开接种，均匀地接种到继代培养基1号(MG-1)中；
其中，步骤(2.2)中改良MS(KNO3 1.9-2.5g/L，NH4NO3 1.65-2.1g/L，MgSO4·7H2O 0.37-0.48g/L，KH2PO4 0.17-0.22g/L，CaCl2·2H2O 0.44-0.57g/L，Na2EDTA·2H2O 0.041-0.056g/L,FeSO4·7H2O 0.03-0.041g/L,MnSO4·H2O 16.9mg/L，H3BO3 6.2mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，KI 0.83mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，肌醇10mg/L,烟酸0.05mg/L，盐酸硫胺素0.01mg/L，盐酸吡哆醇0.05mg/L)+6-BA0.3mg/L+NAA 0.01mg/L+葡萄糖20g/L+卡拉胶5.5g/L；
其中，步骤(2.2)中，保加利亚精油玫瑰继代培养得培养条件为光照时间为12h/d，光照强度2000-3000lux，培养温度为26±2℃；
(2.3)培养35d后，植株纵向生长株高在3.5cm以上，植株侧芽均萌发，下部有一个侧芽生长形成单枝大小约2cm，统计增殖比例平均达到1:4.5。
本发明的有益效果：
本发明针对玫瑰继代培养培养过程所需的营养成分进行调整，改良了大量元素、铁盐、钙盐的用量，碳源改用葡萄糖，解决了玫瑰组培苗过程中植株发黄生长停滞的现象；
同时采用低浓度的6-BA与NAA的组合处理，降低因激素过高和多代累积导致玫瑰组培苗分化能力出现异常的风险，并提高了玫瑰组培苗的增殖比例。
本实验改良了玫瑰基本培养基成分并使用适宜的激素组合，采用一组增殖培养配方，成功建立玫瑰的组培体系，实现玫瑰工厂化生产。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种保加利亚精油玫瑰的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)实验材料得选择：挑选长势整齐、植株高度为2.5-4.0cm、继代周期为30-35天、叶色呈绿色或嫩绿色的保加利亚玫瑰组培苗作为继代培养材料；
(2)具体实验步骤：
(2.1)无菌外植体的获取：切除叶片，保留顶芽心叶，叶柄留0.1-0.2cm，切割成0.5-0.8cm的茎段；
(2.2)保加利亚精油玫瑰继代培养；顶芽与茎段分开接种，均匀地接种到继代培养基1号(MG-1)中；
其中，步骤(2.2)中改良MS(KNO3 1.9-2.5g/L，NH4NO3 1.65-2.1g/L，MgSO4·7H2O 0.37-0.48g/L，KH2PO4 0.17-0.22g/L，CaCl2·2H2O 0.44-0.57g/L，Na2EDTA·2H2O 0.041-0.056g/L,FeSO4·7H2O 0.03-0.041g/L,MnSO4·H2O 16.9mg/L，H3BO3 6.2mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，KI 0.83mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，肌醇10mg/L,烟酸0.05mg/L，盐酸硫胺素0.01mg/L，盐酸吡哆醇0.05mg/L)+6-BA0.3mg/L+NAA 0.01mg/L+葡萄糖20g/L+卡拉胶5.5g/L；
其中，步骤(2.2)中，保加利亚精油玫瑰继代培养得培养条件为光照时间为12h/d，光照强度2000-3000lux，培养温度为26±2℃；
各继代培养基中的生长表现如表1所述，pH调节至5.9：
表1
表1的实验结果表明：与白砂糖相比，添加了葡萄糖的培养基中，玫瑰组培苗生长良好，木质化程度低，不会出现早衰现象，而且植株富有生命力。
实施例2
一种保加利亚精油玫瑰的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)实验材料得选择：挑选长势整齐、植株高度为2.5-4.0cm、继代周期为30-35天、叶色呈绿色或嫩绿色的保加利亚玫瑰组培苗作为继代培养材料；
(2)具体实验步骤：
(2.1)无菌外植体的获取：切除叶片，保留顶芽心叶，叶柄留0.1-0.2cm，切割成0.5-0.8cm的茎段；
(2.2)保加利亚精油玫瑰继代培养；顶芽与茎段分开接种，均匀地接种到继代培养基1号(MG-1)中；
其中，步骤(2.3)中改良MS(KNO3 1.9-2.5g/L，NH4NO3 1.65-2.1g/L，MgSO4·7H2O 0.37-0.48g/L，KH2PO4 0.17-0.22g/L，CaCl2·2H2O 0.44-0.57g/L，Na2EDTA·2H2O 0.041-0.056g/L,FeSO4·7H2O 0.03-0.041g/L,MnSO4·H2O 16.9mg/L，H3BO3 6.2mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，KI 0.83mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，肌醇10mg/L,烟酸0.05mg/L，盐酸硫胺素0.01mg/L，盐酸吡哆醇0.05mg/L)+6-BA0.3mg/L+NAA 0.01mg/L+葡萄糖20g/L+卡拉胶5.5g/L；
其中，步骤(2.2)中，保加利亚精油玫瑰继代培养得培养条件为光照时间为12h/d，光照强度2000-3000lux，培养温度为26±2℃；
各继代培养基中的生长表现如表2所述，pH调节至5.9：
表2
表2中，提高大量元素、钙盐、铁盐的用量，最高浓度至原用量的1.5倍，成功改善了植株的颜色，表现为绿色。
6-BA与NAA组合处理，当6-BA使用浓度提高时，丛芽的萌发量也随之提高，但是组培苗较细弱，应用于生产时，降低了有效种苗的比率，得不偿失；当6-BA为0.3mg/L，NAA0.01mg/L时，增殖比例能够达到4.5，且植株健壮，进行继代培养的有效种苗比率达到99％以上，提高了种苗的利用率，而且利于下一阶段生根操作。
(2.3)培养35d后，植株纵向生长株高在3.5cm以上，植株侧芽均萌发，下部有一个侧芽生长形成单枝大小约2cm，统计增殖比例平均达到1:4.5。
以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。