本发明属于生物农药技术领域，尤其是涉及一种利用虾蟹壳制备的植物免疫诱抗剂及其制备方法。
背景技术：
植物免疫诱抗剂也叫植物疫苗，是一类新型生物农药，具有显著防病、防冻、增产、改善品质的效果，对人畜无害、不污染环境。是继人用疫苗、动物疫苗后，疫苗工程技术出现的新领域，也是国际上生物农药创制较为热门的研究方向。
植物免疫诱抗剂对农作物病虫害没有直接的杀灭作用，而是由外源生物或分子通过诱导或激活植物所产生的抗性物质，对某些病原物产生抗性或抑制病菌的生长。当其施用在农作物上后，通过诱导农作物产生抵御或防控农作物病虫害的物质，从而达到防治病虫害的目的。据不完全统计，目前，国内已经在农业部农药检定所获得正式登记的植物免疫诱抗剂主要有康壮素(蛋白质激发子)、益微菌(枯草芽孢杆菌)、壳寡糖和脱落酸等药物品种。有关植物免疫诱抗剂的研究与利用，目前也已经得到了政府有关管理和推广部门及广大农民的认可，其在保护植物健康生长、保障食品和生态安全方面发挥着越来越重要的作用。未来，植物免疫诱抗剂农药将有望成为具有巨大发展前景的新型战略产业。
几丁质是已被确定的具有激发子活性的寡糖之一。几丁质有大量的来源，最为主要的来源为虾蟹壳，其含量为20％～40％，充分利用虾蟹壳来源，开发更为高效的几丁质植物免疫诱抗剂具有一定的市场前景。目前，利用几丁质制备植物免疫诱抗剂已有少量研究。中国专利CN105746591A公开了一种利用蟹壳制备植物免疫诱抗剂的方法，该专利对蟹壳中的几丁质进行酯化并以此作为植物免疫诱抗剂的主体。然而，从蟹壳中直接提取几丁质的水溶性较差，而且几丁质酯化会使水溶性的进一步降低，使其移动性受到限制，难以涉足长距离信号的传导过程，使具有激发子活性的几丁质片段难以更好发挥其有效作用，对植物诱导抗病性大幅降低。
技术实现要素：
针对几丁质难以涉足长距离信号的传导、诱导植物抗病性不足的问题，本发明提供了一种利用虾蟹壳制备的植物免疫诱抗剂及其制备方法。
本发明是通过以下技术实现的：
一种利用虾蟹壳制备的植物免疫诱抗剂，所述植物免疫诱抗剂包括如下重量配比的原料：改性几丁质3～8份、中药提取物0.5～1份、磷酸盐0.1～0.5份、有机酸0.1～0.5份、水50～150份。
优选地，所述中药提取物包括如下重量配比的原料：黄连3～8份、板蓝根5～8份、黄芩5～10份、黄柏10～15份、大黄3～5份、鱼腥草3～5份、大青叶3～5份、穿心莲1～5份、五味子3～8份，其制备方法如下：将黄连、板蓝根、黄芩、黄柏、大黄、鱼腥草、大青叶、穿心莲、五味子混合并以固液重量比1：30～40浸入40wt％～60wt％乙醇水溶液中，于70～80℃条件下保温3～4小时后过滤，对过滤液进行喷雾干燥，收集干燥物，即为中药提取物。
优选地，所述喷雾干燥为离心喷雾干燥，出口温度为80～90℃，入口温度为300～320℃，离心喷雾头转速为8000～12000转/分。
优选地，所述磷酸盐为磷酸氢铝、磷酸铜、磷酸钙、磷酸铁和磷酸镁中的一种或几种。
优选地，所述有机酸为水杨酸和茉莉酸中的一种或两种。
优选地，所述改性几丁质的制备步骤如下：
1)取虾蟹壳、去其残肉，洗净，于80～90℃条件下烘干后，粉碎至100～150目，得虾蟹壳粉末；
2)取虾蟹壳粉末按固液重量比1：30～40浸入0.5～1.5mol/L的盐酸溶液中，升温至60～80℃并保温4～6小时后过滤，以水将虾蟹壳粉末洗至中性；
3)将洗至中性的虾蟹壳粉末以固液重量比1：20～30浸入5～10g/L的氢氧化钠溶液中，升温至40～60℃并保温4～6小时后过滤，以水将虾蟹壳粉末洗至中性；
4)将洗至中性的虾蟹壳粉末以固液重量比1：20～30浸入10wt％～15wt％的双氧水溶液中，升温至80～100℃并保温2～4小时后过滤，以水冲洗并于80～90℃条件下烘干，即得虾蟹几丁质；
5)将虾蟹几丁质以固液重量比1：4～6浸入40wt％～50wt％的氢氧化钠溶液中，将混合溶液装入不锈钢容器中，通入氮气，升温至70～80℃，保温72～96小时，过滤，除去碱液，以水将虾蟹几丁质洗至中性，于80～90℃条件下烘干后，即得脱乙酰几丁质；
6)取脱乙酰几丁质以固液重量比1：30～50溶于饱和碳酸氢铵溶液中，于室温下静置50～100h后，升温至60～70℃，保温1～2小时，真空浓缩该反应液并进行真空冷冻干燥，即得铵基化脱乙酰几丁质；
7)称取铵基化脱乙酰几丁质加入等重量的二氯乙酸酐，于30～40℃下反应6～8小时后，加入铵基化脱乙酰几丁质重量5～8倍的水，于70～90℃下反应6～8小时后，真空浓缩该反应液并进行真空冷冻干燥，即得改性几丁质。
几丁质是许多真菌细胞壁多糖的主要成分，植物几丁质酶的释放的可溶性几丁质片段起到激发子的作用。然而几丁质水溶性较差，整体移动性受到限制，不能涉足长距离信号传导过程，在本发明中，发明人通过结构修饰制得具有良好生物活性的改性几丁质(I)，提高了几丁质的移动性，使较长距离信号传导成为可能。
在本发明的植物免疫诱抗剂中，除了改性几丁质外，更引入了磷酸盐、有机酸和中药提取物。磷酸盐的金属离子可使离子通道发生变化，离子通道在原生质膜去极化和激发子信号传统过程中起到积极的作用；本发明所使用的有机酸为水杨酸和茉莉酸，水杨酸与茉莉酸为植物的内源激发子，将这两种有机酸作为外源激发子施用于植物之上，同样可诱导植物提高抗病能力；此外，为了实现对已遭受病原菌侵染的植物治愈，本发明添加了具有抗菌、杀菌活性的中药提取物，结果显示，中药提取物的辅助作用进一步提高了植物免疫诱抗剂的使用效果。
优选地，步骤6)或步骤7)的真空浓缩的条件为：温度为70～80℃，真空度为-0.08～-0.06MPa，时间为1～2小时；步骤6)或步骤7)的真空冷冻干燥的条件为：温度-60～-40℃，真空度为-0.08～-0.06MPa，时间为96～120小时。
一种利用虾蟹壳制备的植物免疫诱抗剂的制备方法，所述植物免疫诱抗剂的制备方法为：按重量配比将改性几丁质、中药提取物、磷酸盐、有机酸、水混合，均质后，对混合溶液进行喷雾干燥，收集干燥物，即为植物免疫诱抗剂。
优选地，所述喷雾干燥为离心喷雾干燥，出口温度为80～90℃，入口温度为300～320℃，离心喷雾头转速为8000～12000转/分。
本发明公开的一种利用虾蟹壳制备的植物免疫诱抗剂及其制备方法，其有益效果为：1)对源于虾蟹壳的几丁质进行结构修饰，制得一种具有长距离传导信号能力、高诱导植物抗性的改性几丁质，以此为主要成份的植物免疫诱抗剂对多种病原菌侵染具有积极的免疫效果，尤其是对番茄的根腐菌、甲疫病菌效果显著，其病害发生率小于5％；2)本发明所制得的植物免疫诱抗剂免疫作用时间长，与植物有较好的相容性，可被植物吸收或自行降解，对环境无污染。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，对本发明申请所述的一种利用虾蟹壳制备的植物免疫诱抗剂及其制备方法。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例一种利用虾蟹壳制备的植物免疫诱抗剂，包括如下重量配比的原料：改性几丁质3Kg、中药提取物0.5Kg、磷酸钙0.1Kg、水杨酸0.1Kg、水50Kg，其制备方法为：按原料的重量称取改性几丁质、中药提取物、磷酸钙、水杨酸、水混合，均质后，对混合溶液进行喷雾干燥，收集干燥物，即为植物免疫诱抗剂。其中，喷雾干燥为离心喷雾干燥，出口温度为80℃，入口温度为300℃，离心喷雾头转速为8000转/分。
在本实施例所制备的植物免疫诱抗剂的原料中，改性几丁质的制备步骤如下：
1)取虾蟹壳、去其残肉，洗净，于80℃条件下烘干后，粉碎至100目，得虾蟹壳粉末；
2)取20Kg虾蟹壳粉末按固液重量比1：30浸入600Kg的0.5mol/L盐酸溶液中，升温至60℃并保温4小时后过滤，以水将虾蟹壳粉末洗至中性；
3)将洗至中性的虾蟹壳粉末以固液重量比1：20浸入5g/L的氢氧化钠溶液中，升温至40℃并保温4小时后过滤，以水将虾蟹壳粉末洗至中性；
4)将洗至中性的虾蟹壳粉末以固液重量比1：20浸入10wt％的双氧水溶液中，升温至80℃并保温2小时后过滤，以水冲洗并于80℃条件下烘干，即得虾蟹几丁质；
5)将虾蟹几丁质以固液重量比1：4浸入40wt％的氢氧化钠溶液中，将混合溶液装入不锈钢容器中，通入氮气，升温至70℃，保温72小时，过滤，除去碱液，以水将虾蟹几丁质洗至中性，于80℃条件下烘干后，即得脱乙酰几丁质；
6)取脱乙酰几丁质以固液重量比1：30溶于饱和碳酸氢铵溶液中，于室温下静置50h后，升温至60℃，升温1小时，真空浓缩该反应液并进行真空冷冻干燥，即得铵基化脱乙酰几丁质；真空浓缩的条件为：温度为70℃，真空度为-0.08MPa，时间为1小时；真空冷冻干燥的条件为：温度-60℃，真空度为-0.08MPa，时间为96小时；
7)称取铵基化脱乙酰几丁质加入等重量的二氯乙酸酐，于30℃下反应6小时后，加入铵基化脱乙酰几丁质重量5倍的水，于70℃下反应6小时后，真空浓缩该反应液并进行真空冷冻干燥，即得改性几丁质6.3Kg。真空浓缩的条件为：温度为70℃，真空度为-0.08MPa，时间为1小时；真空冷冻干燥的条件为：温度-60℃，真空度为-0.08MPa，时间为96小时。
在本实施例所制备的植物免疫诱抗剂的原料中，中药提取物包括如下重量的原料：黄连3Kg、板蓝根5Kg、黄芩5Kg、黄柏10Kg、大黄3Kg、鱼腥草3Kg、大青叶3Kg、穿心莲1Kg、五味子3Kg，其制备方法如下：将黄连、板蓝根、黄芩、黄柏、大黄、鱼腥草、大青叶、穿心莲、五味子混合并以固液重量比1：30浸入40wt％乙醇水溶液中，于70℃条件下保温3小时后过滤，对过滤液进行喷雾干燥，收集干燥物，即为中药提取物0.57Kg。其中，喷雾干燥为离心喷雾干燥，出口温度为80℃，入口温度为300℃，离心喷雾头转速为8000转/分。
实施例2
本实施例一种利用虾蟹壳制备的植物免疫诱抗剂，包括如下重量配比的原料：改性几丁质8Kg、中药提取物1Kg、磷酸氢铝0.5Kg、茉莉酸0.5Kg、水150Kg，其制备方法为：按原料的重量称取改性几丁质、中药提取物、磷酸氢铝、茉莉酸、水混合，均质后，对混合溶液进行喷雾干燥，收集干燥物，即为植物免疫诱抗剂。其中，喷雾干燥为离心喷雾干燥，出口温度为90℃，入口温度为320℃，离心喷雾头转速为12000转/分。
在本实施例所制备的植物免疫诱抗剂的原料中，改性几丁质的制备步骤如下：
1)取虾蟹壳、去其残肉，洗净，于90℃条件下烘干后，粉碎至150目，得虾蟹壳粉末；
2)取20Kg虾蟹壳粉末按固液重量比1：40浸入800Kg的1.5mol/L盐酸溶液中，升温至80℃并保温6小时后过滤，以水将虾蟹壳粉末洗至中性；
3)将洗至中性的虾蟹壳粉末以固液重量比1：30浸入10g/L的氢氧化钠溶液中，升温至60℃并保温6小时后过滤，以水将虾蟹壳粉末洗至中性；
4)将洗至中性的虾蟹壳粉末以固液重量比1：30浸入15wt％的双氧水溶液中，升温至100℃并保温4小时后过滤，以水冲洗并于90℃条件下烘干，即得虾蟹几丁质；
5)将虾蟹几丁质以固液重量比1：6浸入50wt％的氢氧化钠溶液中，将混合溶液装入不锈钢容器中，通入氮气，升温至80℃，保温96小时，过滤，除去碱液，以水将虾蟹几丁质洗至中性，于90℃条件下烘干后，即得脱乙酰几丁质；
6)取脱乙酰几丁质以固液重量比1：50溶于饱和碳酸氢铵溶液中，于室温下静置100h后，升温至70℃，保温2小时，真空浓缩该反应液并进行真空冷冻干燥，即得铵基化脱乙酰几丁质；真空浓缩的条件为：温度为80℃，真空度为-0.06MPa，时间为2小时；真空冷冻干燥的条件为：温度-40℃，真空度为-0.06MPa，时间为120小时；
7)称取铵基化脱乙酰几丁质加入等重量的二氯乙酸酐，于40℃下反应8小时后，加入铵基化脱乙酰几丁质重量8倍的水，于90℃下反应8小时后，真空浓缩该反应液并进行真空冷冻干燥，即得改性几丁质6.3Kg。真空浓缩的条件为：温度为80℃，真空度为-0.06MPa，时间为2小时；真空冷冻干燥的条件为：温度-40℃，真空度为-0.06MPa，时间为120小时。
在本实施例所制备的植物免疫诱抗剂的原料中，中药提取物包括如下重量的原料：黄连8Kg、板蓝根8Kg、黄芩10Kg、黄柏15Kg、大黄5Kg、鱼腥草5Kg、大青叶5Kg、穿心莲5Kg、五味子8Kg，其制备方法如下：将黄连、板蓝根、黄芩、黄柏、大黄、鱼腥草、大青叶、穿心莲、五味子混合并以固液重量比1：40浸入60wt％乙醇水溶液中，于80℃条件下保温4小时后过滤，对过滤液进行喷雾干燥，收集干燥物，即为中药提取物1.3Kg。其中，喷雾干燥为离心喷雾干燥，出口温度为90℃，入口温度为320℃，离心喷雾头转速为12000转/分。
实施例3
本实施例一种利用虾蟹壳制备的植物免疫诱抗剂，包括如下重量配比的原料：改性几丁质6Kg、中药提取物0.8Kg、磷酸镁0.2Kg、磷酸钙0.2Kg、水杨酸0.2Kg、茉莉酸0.2Kg、水100Kg，其制备方法为：按原料的重量称取改性几丁质、中药提取物、磷酸镁、磷酸钙、水杨酸、茉莉酸、水混合，均质后，对混合溶液进行喷雾干燥，收集干燥物，即为植物免疫诱抗剂。其中，喷雾干燥为离心喷雾干燥，出口温度为85℃，入口温度为310℃，离心喷雾头转速为10000转/分。
在本实施例所制备的植物免疫诱抗剂的原料中，改性几丁质的制备步骤如下：
1)取虾蟹壳、去其残肉，洗净，于85℃条件下烘干后，粉碎至130目，得虾蟹壳粉末；
2)取20Kg虾蟹壳粉末按固液重量比1：35浸入700Kg的1.0mol/L盐酸溶液中，升温至70℃并保温5小时后过滤，以水将虾蟹壳粉末洗至中性；
3)将洗至中性的虾蟹壳粉末以固液重量比1：25浸入8g/L的氢氧化钠溶液中，升温至50℃并保温5小时后过滤，以水将虾蟹壳粉末洗至中性；
4)将洗至中性的虾蟹壳粉末以固液重量比1：25浸入12wt％的双氧水溶液中，升温至90℃并保温3小时后过滤，以水冲洗并于85℃条件下烘干，即得虾蟹几丁质；
5)将虾蟹几丁质以固液重量比1：5浸入45wt％的氢氧化钠溶液中，将混合溶液装入不锈钢容器中，通入氮气，升温至75℃，保温84小时，过滤，除去碱液，以水将虾蟹几丁质洗至中性，于85℃条件下烘干后，即得脱乙酰几丁质；
6)取脱乙酰几丁质以固液重量比1：40溶于饱和碳酸氢铵溶液中，于室温下静置75h后，升温至65℃，并保持1.5小时，真空浓缩该反应液并进行真空冷冻干燥，即得铵基化脱乙酰几丁质；真空浓缩的条件为：温度为75℃，真空度为-0.07MPa，时间为1.5小时；真空冷冻干燥的条件为：温度-50℃，真空度为-0.07MPa，时间为108小时；
7)称取铵基化脱乙酰几丁质加入等重量的二氯乙酸酐，于35℃下反应7小时后，加入铵基化脱乙酰几丁质重量7倍的水，于80℃下反应7小时后，真空浓缩该反应液并进行真空冷冻干燥，即得改性几丁质6.1Kg。真空浓缩的条件为：温度为75℃，真空度为-0.07MPa，时间为1.5小时；真空冷冻干燥的条件为：温度-50℃，真空度为-0.07MPa，时间为108小时。
在本实施例所制备的植物免疫诱抗剂的原料中，中药提取物包括如下重量的原料：黄连6Kg、板蓝根7Kg、黄芩8Kg、黄柏12Kg、大黄4Kg、鱼腥草4Kg、大青叶4Kg、穿心莲3Kg、五味子5Kg，其制备方法如下：将黄连、板蓝根、黄芩、黄柏、大黄、鱼腥草、大青叶、穿心莲、五味子混合并以固液重量比1：35浸入50wt％乙醇水溶液中，于75℃条件下保温3.5小时后过滤，对过滤液进行喷雾干燥，收集干燥物，即为中药提取物0.9Kg。其中，喷雾干燥为离心喷雾干燥，出口温度为85℃，入口温度为310℃，离心喷雾头转速为10000转/分。
为了进一步验证实施例所制备的植物免疫诱抗剂的使用效果，请参见如下应用实例：1、番茄品种“浙粉702”(浙江省农业科学院)
2、植物免疫诱抗剂的施用方式
2015年5月25日开始，对两组(实验组与对照组)番茄进行喷施，每组50株。实验组喷施由实施例1～3所制备的植物免疫诱抗剂水溶液(浓度为2g/L)，对照组喷施清水，每月喷施两次，每株喷施30mL，其它肥料相同。2015年7月25日对实验组与对照组的每株番茄进行检查。结果如表1所示。
表1植物免疫诱抗剂对病害发生率的影响
由表1可知，与对照组(喷施清水)相比，所有实验组(喷施植物免疫诱抗剂)的番茄根浙粉702的根腐菌、甲疫病菌均有显著下降，病害发生率为5％以下。