褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种及其生产方法与流程

本发明涉及通过在鮨科中属于石斑鱼亚科的褐石斑鱼与鞍带石斑鱼两种之间的杂交来生产的杂交种及其杂交种的生产方法，涉及雌性褐石斑鱼(longtoothgrouper，epinephelusbruneus)与雄性鞍带石斑鱼(giantgrouper，epinepheluslanceolatus)之间的杂交种及雄性褐石斑鱼与雌性鞍带石斑鱼的杂交种的生产方法。本发明为包含如下步骤的方法：包括从雌性确保成熟卵，从雄性提取精液之后，进行两者之间的人工受精，从而生产受精卵，并将受精卵育成孵化及种苗步骤。与褐石斑鱼相比，褐石斑鱼与鞍带石斑鱼两种之间的杂交种具有生长非常快的优点。
背景技术：
：鮨科鱼类(familyserranidae)为3亚科529种，其中，主要养殖对象种为石斑鱼亚科(subfamilyepinephelinae)，是15属159种，大部分在属于亚热带性的印度-太平洋地区中栖息。鮨科鱼类作为高价的养殖鱼类受到瞩目，养殖生产量急增，2011年生产94040吨，从而具有10年增加7.3倍的大的市场性。属于本发明的对象种的褐石斑鱼作为在水产养殖业具有高附加价值的鱼种，在韩国济州岛用方言称为“东洋鲈”，以高的价格销售，并且作为鮨科鱼类的最大市场的香港市场和中国本土中的需要量多。鞍带石斑鱼作为在亚热带性地区中栖息的超大型鱼类，因快的生长率和高的价格，在台湾作为养殖对象种受到瞩目，还逐渐引入中国本土。杂交作为基因型和表现型不同的两种之间的交配方法，是一种以作为在经济上重要的形质的生长、抗病性、肉质、环境适应力增大等为对象生产新的物种的技术。尤其，种间杂交通过所需的形质的组合来获取杂种优势的概率高，因而正进行多种试图(韩国公开专利第10-1999-0045938号、韩国授权专利第10-0844339号、韩国公开专利第10-2012-0083990号)。另一方面，还正活跃地进行将鮨科鱼类作为对象的多种杂交品种的生产。代表性地，有暗点石斑鱼(duskygrouper(乌鳍石斑鱼(epinephelusmarginatus)))×白石斑鱼(whitegrouper(e.aeneus))、地中海石斑鱼(goldblotchgrouper(e.costae))×暗点石斑鱼、棕点石斑鱼(brown-marblegrouper(e.fuscoguttatus))×白星石斑鱼(spottedgrouper(e.polyphekadion))、点带石斑鱼(orange-spottedgrouper(e.coioides))×棕点石斑鱼、点带石斑鱼×鞍带石斑鱼及赤点石斑鱼(red-spottedgrouper(e.akaara))×点带石斑鱼等。尤其，由雌性棕点石斑鱼的成熟卵和鞍带石斑鱼的精液人工受精而成的杂交种因具有快的生长和抗病性而进行大量生产，且在香港市场中正式登录而进行销售。但是，至今，鮨科鱼类的杂交只有亚热带性鱼种之间的杂交种，未实现在韩国栖息的鮨科鱼类与亚热带性鮨科鱼类之间的杂交。与此同时，当开发通过市场性高的褐石斑鱼与生长快且具有市场性的鞍带石斑鱼之间的杂交的新品种时，与在韩国的销售一同，还可以在具有最大消费市场的中国进行销售。现有技术文献专利文献专利文献0001：韩国公开专利第10-1999-0045938号专利文献0002：韩国授权专利第10-0844339号专利文献0003：韩国公开专利第10-2012-0083990号技术实现要素：本发明的目的在于，为了获取褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的市场性、生长率等的优良形质，开发通过杂交的新品种。并且，本发明的目的在于，提供生长速度快、可贡献于养殖产业的活性化的褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交方法。为了实现如上所述的目的，本发明提供褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种的生产方法，上述褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种的生产方法包括：准备雌性褐石斑鱼的成熟卵，并准备雄性鞍带石斑鱼的精液之后，进行两者之间的人工受精，来生产受精卵的步骤；以及对上述受精卵进行孵化及饲育来生产仔鱼的步骤。并且，本发明提供褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种的生产方法，上述褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种的生产方法包括：准备雌性鞍带石斑鱼的成熟卵，并准备雄性褐石斑鱼的精液之后，进行两者之间的人工受精，来生产受精卵的步骤；以及对上述受精卵进行孵化及饲育来生产仔鱼的步骤。并且，本发明提供褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种的确认方法，上述褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种的确认方法包括：对生产的上述仔鱼的脱氧核糖核酸(dna)进行提取的步骤；对提取的上述仔鱼的脱氧核糖核酸和序列1的引物或序列2的引物进行混合，并利用聚合酶链式反应(pcr)进行扩增的步骤；以及通过电泳来确认通过上述扩增获得的产物的步骤。在本发明的一实施例中，其特征在于，在通过上述电泳来确认的步骤中，在使用序列1的引物的情况下，若检测到约320bp、330bp、400bp及450bp的条带，则判定为杂交种。在本发明的一实施例中，其特征在于，在通过上述电泳来确认的步骤中，在使用序列2的引物的情况下，若检测到约380bp及410bp的条带，则判定为杂交种。并且，本发明提供利用上述褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种的生产方法来制备而得的杂交种、受精卵及仔鱼。本发明可通过市场性高的褐石斑鱼与生长快且具有市场性的鞍带石斑鱼之间的杂交来提供生长速度快且具有优良形质的杂交种。本发明的杂交种中初期仔鱼的生长非常快，因而可解决当养殖鮨科鱼类时成为大问题的生物饵料的问题，从而可贡献于韩国养殖产业的活性化。并且，本发明可对抗作为鮨科鱼类种苗生产最发达国家的台湾提高韩国养殖产业的国家竞争力，并通过进入鮨科鱼类养殖市场可创造莫大的收入。附图说明图1为褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种的按水温的孵化率及初期生存率。图2为褐石斑鱼、鞍带石斑鱼及杂交种的形态特征。图3为褐石斑鱼及杂交种的生长率差异，趋势线利用了指数趋势线，并公开r2值。图4为利用序列1的引物的聚合酶链式反应扩增产物的电泳照片，gg1、gg2及gg3为鞍带石斑鱼，lg1、lg2及lg3为褐石斑鱼，lg×gg1、lg×gg2为杂交种。图5为利用序列2的引物的聚合酶链式反应扩增产物的电泳照片，gg1、gg2及gg3为鞍带石斑鱼，lg1、lg2及lg3为褐石斑鱼，lg×gg1、lg×gg2为杂交种。具体实施方式以下，基于实施例及附图对本发明进行详细说明。在本发明中使用的术语、实施例、附图等仅用于更具体地说明本发明，并有助于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员理解本发明，不能解释为本发明的发明要求保护范围等局限于此。若在本发明中使用的技术术语及科学术语无其他定义，则表示本发明所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的意义。本发明涉及褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种的生产方法，上述褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种的生产方法包括：准备雌性褐石斑鱼的成熟卵，并准备雄性鞍带石斑鱼的精液之后，进行两者之间的人工受精，来生产受精卵的步骤；以及对上述受精卵进行孵化及饲育来生产仔鱼的步骤。并且，本发明涉及褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种的生产方法，上述褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种的生产方法包括：准备雌性鞍带石斑鱼的成熟卵，并准备雄性褐石斑鱼的精液之后，进行两者之间的人工受精，来生产受精卵的步骤；以及对上述受精卵进行孵化及饲育来生产仔鱼的步骤。并且，本发明涉及褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种的确认方法，上述褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种的确认方法包括：对生产的上述仔鱼的脱氧核糖核酸进行提取的步骤；对提取的上述仔鱼的脱氧核糖核酸和序列1的引物或序列2的引物进行混合，并利用聚合酶链式反应进行扩增的步骤；以及通过电泳来确认通过上述扩增获得的产物的步骤。在通过上述电泳来确认的步骤中，在使用序列1的引物的情况下，若检测到约320bp、330bp、400bp及450bp的条带，则判定为杂交种。在通过上述电泳来确认的步骤中，在使用序列2的引物的情况下，若检测到约380bp及410bp的条带，则判定为杂交种。并且，本发明涉及利用上述褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种的生产方法来制备而得的杂交种、受精卵及仔鱼。以下，通过实施例详细说明本发明。以下实施例仅用于实施本发明，本发明的内容并不局限于以下实施例。实施例1.亲鱼的确保在本发明中，作为褐石斑鱼，利用了在韩国济州附近采集且在亲鱼饲育槽中正在驯养的体重为1.5～5.2kg的个体中成熟的雌性褐石斑鱼，作为鞍带石斑鱼，利用了从台湾进口且在亲鱼饲育槽中正在驯养的体重为54.2～112.0kg的个体中成熟的雄性鞍带石斑鱼。实施例2.杂交利用腹部压迫法从成熟的雌性褐石斑鱼与雄性鞍带石斑鱼中分别提取卵和精液之后，利用干法通过人工受精进行了杂交。首先，为了取得成熟的雌性褐石斑鱼的高质量的成熟卵，观察腹部之后，一边用手摸一边确认了成熟状态。向进行成熟的雌性褐石斑鱼的腹腔注射了25μg/kg的黄体生成素释放激素(lhrh)(美国西格玛(sigma，usa)公司)和1000iu/㎏的人绒毛膜促性腺激素(hcg)。从注射之后36小时开始以4小时的间隔用手摸并确认了成熟卵是否完熟，最终，通过压迫腹部来确保了成熟卵。利用腹部压迫法来提取了雄性鞍带石斑鱼的精液。需要防止确保的成熟卵在常温条件下露出30分钟以上，并在采卵容器中使确保的成熟卵与精液均匀地混合之后，在室温条件下，放置1～5钟，之后，添加海水来激活精子。之后，再添加海水，在室温条件下，放置5～20分钟，之后，区分了浮性卵和沉性卵。其中，仅将浮性卵移到洗卵网来清洗残留精液之后，将洗卵网飘浮于水槽来将海水流出10～20小时左右。最终，仅收取上浮的受精卵来移到孵化槽。实施例3.孵化及饲育在孵化槽中相同地进行了孵化及仔鱼的饲育。孵化实验结果表明，在22～31℃为止的孵化槽的水温中，全部进行孵化，但在22℃和31℃中呈现低于25℃和28℃的孵化率。卵黄吸收仔鱼的生存率在25℃及28℃实验组中呈现高的数值，但在22℃和31℃实验组中未生存(图1)。孵化仔鱼的畸形率分析结果表明，在25℃温度下，呈现1.5％的畸形率，而在28℃温度下，畸形率高达15.5％，使得适当孵化槽的温度优选为23～27℃，更优选为23.5～26.5℃。从孵化之后开口结束的2天开始供给了轮虫(rotifer)。随着仔鱼生长，与卤虫幼体一同供给了配合饲料。饲育水利用了过滤海水，在饲育初期以指数式维持，从供给卤虫之后将1天换水量维持成30～50％。针对水槽内排泄物，从卤虫供给步骤开始通过虹吸管进行了去除。实施例4.生长率的调查对孵化之后仔鱼的大小、卵黄吸收之后仔鱼的大小及孵化3天、5天、7天、12天、17天、24天间隔的生长率进行了调查(图2)。以全长为基准进行了测定，为了比较相应的杂交种的生长，以与褐石斑鱼纯种的全长为基准进行了比较。孵化之后20天为止，褐石斑鱼纯种和褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种之间无显著的差异，但之后，与褐石斑鱼纯种相比，褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种在40天呈现约155％的生长，在70天呈现187％的生长(图3)。实施例5.利用分子标记的杂交种的判别以褐石斑鱼和鞍带石斑鱼及两种之间的杂交种作为对象，切割尾鳍的一部分，并利用酚提取(phenolextraction)方法提取了基因组(genomic)脱氧核糖核酸。利用随机扩增多态性脱氧核糖核酸(rapd，randomamplifiedpolymorphicdna)技术判别了杂交种。在随机扩增多态性脱氧核糖核酸聚合酶链式反应中利用了10-mer随机引物(randomprimer)(美国加利福尼亚州阿拉米达市操纵子技术公司(operontechnologies，inc.，alameda，ca.))，以各1条的方式将共3条的基因组脱氧核糖核酸作为对象，首先进行聚合酶链式反应，来选定了呈现有效的条带图案的2个引物(表1)。之后，以3条鞍带石斑鱼、2条褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种及3条褐石斑鱼为对象，利用相应的2个引物进行了验证。聚合酶链式反应实施如下：将30ng的基因组脱氧核糖核酸和25μμ的随机引物放入20ul的容积的accupower聚合酶链式反应预混合试剂盒(pcrpremixkit)(韩国柏业(bioneer，korea)公司)之后，在94℃温度下，进行5分钟的初期热变性反应之后，将在94℃温度下1分钟，在36℃温度下1分钟，在72℃温度下2分钟的循环反应进行了35次。最终，在72℃温度下，进行了10分钟的延伸反应。在利用gelred(美国biotium公司(biotiuminc.，usa))进行染色的1.5％的琼脂糖(agarose)凝胶中，进行电泳来确认了聚合酶链式反应是否成功。其结果，在序列1的引物(opa7)中，在320～340bp(约330bp)和390～410bp(约400bp)中呈现鞍带石斑鱼的特异条带，在310～330bp(约320bp)和440～460bp(约450bp)中呈现褐石斑鱼的特异条带。在褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的2条杂交种中共享上述所涉及的特异条带(图4)。在序列2的引物(opa8)中，在370～390bp(约380bp)中呈现鞍带石斑鱼的特异条带，在400～420bp(约410bp)中呈现褐石斑鱼的特异条带，在褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的2条杂交种中均共享2个特异条带(图5)。因此，利用序列1及序列2的引物，可明确地区分褐石斑鱼和鞍带石斑鱼及两种之间的杂交种。表1引物名称碱基序列(5’→3’)opa7gaaacgggtgopa8gtgacgtagg序列表<110>韩国海洋科学技术院顺天乡大学校产学协力团木浦大学校产学协力团尹乐进<120>褐石斑鱼与鞍带石斑鱼的杂交种及其生产方法<130><150>kr10-2015-0185564<151>2015-12-24<160>2<210>1<211>10<212>dna<213>石斑鱼属（epinephelus）<400>1gaaacgggtg10<210>2<211>10<212>dna<213>石斑鱼属（epinephelus）<400>2gtgacgtagg10当前第1页12