一种红火蚁触杀杀虫剂及氟虫腈在灭杀红火蚁中的应用的制作方法

本发明涉及杀虫剂，具体涉及一种红火蚁触杀杀虫剂及氟虫腈在灭杀红火蚁中的应用。

背景技术：

红火蚁(S.invicta)是最具有入侵性的社会性昆虫，已经被国际上列为最具入侵性和破坏性的百种外来有害生物之一。红火蚁食性复杂、习性凶猛、繁殖迅速、竞争力强，能造成重大经济损失、社会危害和环境影响，红火蚁的杂食性和攻击性使其不仅是一种经济害虫，还威胁到公众健康。化学防治措施仍然是防治红火蚁有效措施，但仍然不能根除红火蚁。而且长期用化学药剂对红火蚁进行控制，会导致意想不到的反弹。

氟虫腈(商品名：锐劲特)英文通用名称为fipronil，是原法国罗纳-普朗克公司于1981年开发的苯基吡唑类新型广谱性杀虫剂，化学名称：(±)-5-氨基-1-(2，6-二氯-4，4，4-三氟甲苯基)-4-三氟甲基亚硫酰基-3-氰基吡唑。氟虫腈能与γ-氨基丁酸受体结合，有效阻塞昆虫中枢神经系统的γ-氨基丁酸调节的氯离子通道，干扰昆虫中枢神经系统，引起昆虫神经和肌肉的过度兴奋直至死亡。作为控制作物害虫的杀虫剂，氟虫腈活性高，杀虫谱广，有触杀、胃毒和内吸作用，对鳞翅目、同翅目、半翅目、缨翅目和直翅目，鞘翅目和膜翅目的多种害虫有优良的防效。

氟虫腈由于具有独特的作用机制，可有效地控制对有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性的害虫。近年来，人们发现一些害虫对氟虫腈产生一定程度的抗性。Kolaczinski等(2001)用WHO套装试剂对5个品系的按蚊进行测试，发现其中两个品系对氟虫腈具有抗性。氟虫腈在动物、植物、环境中代谢生成毒性与氟虫腈相当或毒性更高的砜化物或亚砜化合物。在动物体内通过吸收、代谢、排泄以和水解、光解等作用，广泛分布于动物的组织中，特别是在脂肪组织中含量较高。主要的排出途径是通过粪便。具体途径如下：

氟虫腈在动物体内的代谢途径。

毒死蜱(chlorpyrifos)是一种高效、广谱的有机磷杀虫剂，具有触杀、胃毒和熏蒸作用，可用于防治螟虫、卷叶虫、粘虫、介壳虫、蚜虫、棉铃虫、叶蝉和红蜘蛛等害虫毒死蜱对神经系统具有毒性作用，在动物体内能够转换为比其本身毒性强3000倍的氧化毒死蜱。在水、空气、土壤、植物和动物体内的初级代谢物对鸡胎盘比毒死蜱毒性高2-3倍。而且毒死蜱和TCP(3，5，6-三氯-2-吡啶酚)有可能存在协同效应。毒死蜱杀虫剂与细胞色素P450单氧化酶诱导研究多集中于鱼类、人类和小鼠中(Wheelock and Eder,2005；Cui et al.,2008；Lee,2009)，在昆虫中，而对细胞色素P450单氧化酶的研究尚少。最近，于荣荣等(2013)用毒死蜱诱导东亚飞蝗，结果显示，CYP4G62能被高剂量毒死蜱显著诱导，CYP9AQ1经毒死蜱处理后，在低、中和高浓度均被显著诱导。

技术实现要素：

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种红火蚁触杀杀虫剂及氟虫腈在灭杀红火蚁中的应用。

本发明的技术方案是：一种红火蚁触杀杀虫剂，其有效成分是氟虫腈、辛硫磷和或毒死蜱。

本发明的进一步改进包括：

其有效成为是浓度为0.15-0.36μg/ml的辛硫磷或0.26-0.55μg/ml的氟虫腈或0.34-0.64μg/ml的毒死蜱。

所述的红火蚁触杀杀虫剂是将有效成分溶解于丙酮中制得。

其有效成分是浓度不低于15.168μg/ml氟虫腈。

本发明的另一目的在于提供了氟虫腈在灭杀红火蚁中的应用。

所述的应用，是含有氟虫腈的杀蚁饵剂被红火蚁工蚁取食，当饵剂被红火蚁带进巢内后，通过工蚁在巢内的频繁活动和交哺喂食行为，将药剂传递到巢内的工蚁、幼蚁和蚁后，引起全巢红火蚁中毒死亡。

本发明制备简单，使用方便，灭杀效果好。

附图说明

图1是BSA蛋白含量标准曲线。

图2.是不同浓度对硝基苯酚的吸光度

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明。

实施例1

红火蚁的防治方法很多，其中化学防治技术是最有效、最深入、应用最为广泛的防治方法。饵剂的撒播是红火蚁大面积防治最有效的和持效的方式，灌巢(mound drench)也是和时、有效、快速防治红火蚁的有效方法之一。本申请选择7种不同类型的杀虫剂对红火蚁的触杀毒力测定，明确不同药剂对红火蚁的毒力差异和不同等级红火蚁(蚁后和工蚁)对药剂的敏感度差异。

试验材料

试虫和材料

供试红火蚁采自广东省广州增城和华南农业大学校园。参照Kuriachan等(2000)方法，用大塑料桶从田间采回红火蚁蚁群，放置1-2d，待蚁群在桶内建立了新的群落后，将自来水缓慢滴入桶内，令红火蚁从群落中自动上移、浮出。用40目的捞网将蚁群转入盆口涂以爽身粉的塑料盆(7.0L)中，在室内(室温25℃,RH 65％-80％)用人工饲料饲养一周后供试验用(曾鑫年等,2006)。工蚁、兵蚁、有翅雄蚁、有翅雌蚁和蚁后和幼蚁的判断标准参考曾玲等(2005)方法。

供试药剂

药剂

96％毒死蜱原粉Chlorpyrifos；

95％高效氯氰菊酯原药Beta-cypermethrin；

91％辛硫磷乳油Phoxim；

96％毒死蜱Chlorpyrifos；

97％吡虫啉Imidacloprid；

90％氟虫腈Fipronil；

95％高效氯氟氰菊酯Ambda-cyhalothrin；

97.2％啶虫咪Acetamiprid；

96.2％多杀菌素Spinosad；

93.7％阿维菌素Abamectin。

生化试剂

考马斯亮蓝G-250，Coomassie Brilliant Blue G250；

牛血清蛋白(BSA)，Bovine serum albumin；

分析试剂和有机溶剂

磷酸氢二钠，Disodium hydrogen phospHate，分析纯；

磷酸二氢钠，Sodium dihydrogen phospHate，分析纯；

氢氧化钠，Sodium hydroxide，分析纯；

醋酸，Acetate，分析纯；

醋酸钠，Sodium acetate，分析纯；

碳酸钠，Sodium carbonate，分析纯；

碳酸氢钠，Sodium blcarbonate，分析纯；

盐酸，Hydrochlori cacid，分析纯；

丙酮，Acetone，分析纯。

主要仪器设备

光照培养箱(LRH-300-GH)；

电子天平(BS2190S，精确度0.1mg)；

紫外分光光度计(UV-9100型)；

微量点滴仪(HMA 0807140)；

高速冷冻离心机(M IKRO 22R型)；

微量注射器(1-5μl)；

水浴锅(HH.S21-4型)；

HOSHIZAKI制冰机(FM-120EE)；

KH-500超声波清洗器。

试验方法

触杀毒力测定

药膜法:将原药溶解于适量丙酮中配成一系列浓度的药剂，移取1ml经预实验后的丙酮药液至口径、底径、高分别为6.6、4.4和6.8cm的一次性塑料水杯中，水杯的涂药面积为72.85cm²，转动水杯使药液均匀涂布于内壁，待丙酮挥发干后，倒置水杯，在杯口涂抹适量爽身粉，随机挑选10头蚁后或50头工蚁于杯中。每个浓度设3次重复，空白对照为丙酮。观察记录24h和48h后的死亡蚁数，计算死亡率。按几率值法和最小二乘法求取毒力回归方程，计算致死中浓度(LC₅₀)值。

点滴法：将原药溶解于适量丙酮中配成一系列浓度的药剂，挑选蚁后、有翅雌蚁各10头、工蚁30头，用微量点滴仪移取1μl经预实验后的上述浓度的药液，点滴于试虫前胸背板，置于一次性塑料水杯中，在杯口涂抹适量爽身粉，以小棉球供应10％的蔗糖水，每个浓度设3次重复，对照用丙酮点滴。观察记录24h死亡虫数，按(2.1)和(2.2)分别计算死亡率(％)和校正死亡率(％)。结果统计用SPSS(软件统计处理，求出毒力回归方程和LC₅₀和LC₉₀。

统计分析方法

生物测定数据均采用数据统计软件POLO进行分析，应用Microsoft EXCEL2010软件整理和运用GraphPad InStat软件对数据进行统计分析(one-way ANOVA and Tukey’s test,P<0.05)。

结果与分析

种杀虫剂对红火蚁工蚁触杀毒力作用

室内条件下，采用药膜法测定7种杀虫剂对红火蚁工蚁24h触杀毒力试验结果见表2-1。结果显示，辛硫磷对工蚁的LC₅₀和LC₉₀分别为：0.15和0.36μg/ml，高效氯氟氰菊酯对工蚁的LC₅₀和LC₉₀分别为：0.24和0.38μg/ml；氟虫腈对工蚁的LC₅₀和LC₉₀分别为：0.26和0.55μg/ml；毒死蜱对工蚁的LC₅₀和LC₉₀分别为：0.34和0.64μg/ml；吡虫啉对工蚁的LC₅₀和LC₉₀分别为：663.46和877.43μg/ml；多杀菌素对工蚁的LC₅₀和LC₉₀分别为：1068.90和1351.11μg/ml。这表明，红火蚁工蚁对大多杀虫剂较敏感，所试7种药剂中有5种杀虫剂处理24h的LC₅₀值低于0.5μg/ml；多杀菌素触杀毒力虽不和上述四种农药，但相对较好，只有阿维菌素的触杀毒力最弱。氟虫腈，辛硫磷和毒死蜱也具有良好的触毒杀活性。

表2-1. 7种杀虫剂对红火蚁工蚁的触杀毒力(1.6mg/头)

χ²(df)：卡方值(自由度)。

氟虫腈对工蚁和蚁后的触杀毒力

室内条件下，采用点滴法测定氟虫腈红火蚁工蚁与蚁后的24h触杀毒力试验结果(表2-2)可见，氟虫腈对工蚁与蚁后的LC₅₀分别为5.12和15.168μg/ml。氟虫腈对红火蚁工蚁与蚁后个体对药剂的敏感性差异很大，毒力可以相差2-3倍左右。

表2-2.氟虫腈对红火蚁工蚁和蚁后的触杀毒力

χ²(df)：卡方值(自由度)。

小结

室内条件下，采用药膜法测定7种杀虫剂对红火蚁工蚁24h触杀毒力。结果显示，红火蚁工蚁对大多杀虫剂较敏感，所试7种药剂中有5种杀虫剂处理24h的LC₅₀值低于0.5μg/ml；多杀菌素触杀毒力虽不如上述四种农药，但效果相对较好，只有阿维菌素的触杀毒力最弱。氟虫腈，辛硫磷和毒死蜱也具有良好的触毒杀活性。同时采用点滴法测定氟虫腈对红火蚁工蚁与蚁后的24h触杀毒力试验，结果显示，氟虫腈对工蚁与蚁后的LC₅₀分别为4.604和15.168μg/ml。氟虫腈对红火蚁工蚁与蚁后个体对药剂的敏感性差异很大，毒力可以相差2-3倍。蚁后较工蚁表现出一定的耐药性。

实施例2

细胞色素P450(Cytochrome P450，简称P450)是多功能氧化酶系的核心部分，在整个酶系的氧化代谢中起着末端氧化的作用(邱立红等,1999；Isin and Guengerich,2007)。P450能够参与昆虫体内多种外源物质和内源物质的代谢。细胞色素P450活性测定常用以下几种方法：1.O-脱乙基法：通过7-乙氧基香豆素脱乙基酶(7-ethoxycoumarin O-deacthylase，ECOD)的活性表征细胞色素P450酶系的活性。7-乙氧基香豆素(7-ethoxycoumarin)脱乙基作用后转化成7-羟基香豆素(7-hydroxycoumarin)后荧光值可产生变化(激发波长368nm，发射波长456nm)，利用荧光分光光度计，测7-羟基香豆素生成量产生的荧光值的变化表征细胞色素P450的活性(Ullrich,1972；Aitio,1978)。2.O-脱甲基法：利用对硝基苯甲醚(p-nitroanisole)在细胞色素P450的O-脱甲基作用下生成对硝基苯酚(p-nitrophenol)，可用分光光度计(Fredand and Hodgson,1980)检测碱性条件下p-nitrophenol在405nm处的吸收峰。艾国民建立用乙酸乙酯/正己烷作为终止剂和萃取剂，通过高效液相色谱梯度洗脱，分析对硝基苯酚的生成量，显著提高了测试的灵敏度和分辨度(艾国民等,2009)；3.艾氏剂环氧化法(aldrinepoxidation,AE)：在细胞色素P450环氧化作用下艾氏剂生成狄氏剂，然后再通过气相色谱检测狄氏剂的量，从而测定细胞色素P450的活性(Hammock et al.,1975；Yu et al.,1982)。

本申请采用P450O-脱甲基法测定红火蚁P450的酶活性，以对硝基苯甲醚(p-nitroanisole)为底物，探究红火蚁工蚁与蚁后P450酶活性差异以和杀虫剂对红火蚁细胞色素P450O-脱甲基活性的诱导作用。明确了外源化合物对红火蚁工蚁P450酶活性诱导的时间效应和剂量效应，从而为进一步研究红火蚁的耐药性机制和红火蚁的科学治理提供理论依据。

材料与方法

供试虫源和饲养

同实施例1。

化学试剂

NADPH(98％纯度)、牛血清白蛋白(BSA)；Tris-base、二硫苏糖醇(DTT，99％纯度)；苯基硫脲(PTU)；苯基硫脲(PTU)；苯甲基磺酰氟(PMSF)；乙二胺四乙酸(EDTA)，7-乙氧基香豆素(7-ethoxycoumarin)、7-羟基香豆素(7-hydroxycoumarin)；对硝基苯甲醚，p-nitroanisole；对硝基苯酚p-nitrophenol；考马斯亮蓝G-250；乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、甘氨酸(Gly)、三氯乙酸(TCA)、甘油、85％磷酸、丙酮、NaH₂PO₄和Na₂HPO₄。

实验仪器

5417C/R型台式高速冷冻离心机(Eppendorf，Germany)；LS-55荧光分光光度计(Perkin Elmer，USA)；Bio-40紫外-可见分光光度仪(Perkin Elmer，USA)；Sartorius 2004M电子天平(Opton，13Germany)；SPH-100B型摇床；水浴锅。

实验方法

选取发育整齐的红火蚁工蚁成虫若干头，分别用氟虫腈LC₅₀(0.25μg/ml)、毒死蜱LC₅₀(0.34μg/ml)处理，用丙酮处理作为对照。放入涂有药膜的一次性塑料杯中，置于环境条件为温度26±2℃、相对湿度50％-60％、光周期16h：8h(L：D)的温室内，分别在处理后24、48、72和96h取样，保存于-80℃冰箱中用于测定P-NA O-脱甲基活性。

P450酶活性测定

酶液的制备

参照于彩虹等(2002)的方法并稍作修改，取红火蚁若干，按60头/ml比例加入一定量的0.1mol/L、pH 7.5的磷酸盐缓冲液(含1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF、1mmol/L DTT和10％甘油)匀浆，4℃，10800rpm离心20min，用脱脂棉过滤上清液作为酶液，用于P-NA O-脱甲基活性和蛋白含量的测定。

P-NA O-脱甲基活性测定

参照Yu等(1992)并加以改进、反应：取375μl 2mM PNA、30μl 9.6mM NADPH，和345μl的粗酶源混合，34℃暴露在空气中水浴30min，在酶标板中加入200μl的反应液，在405nm处测定吸光度。以对硝基苯酚量计算生成的结果，酶活力单位为：μmol/pro(mg)/30min。

对硝基苯酚标准曲线制作

1、10^-5mol/L对硝基苯酚溶液：精确称取0.03478g对硝基苯酚溶于2.5ml的乙醇中，待用时再用乙醇稀释10000倍即可。

2、0.5mol/L NaOH溶液：精确称取0.1g NaOH完全溶解于5ml的蒸馏水中。

3、按0,20,40,80,120,160,200μl的标准将10^-5mol/L对硝基苯酚溶液分别加入到酶标板孔中，不足250μl，用0.5mol/L NaOH溶液补平。每个浓度至少重复3次。

4、在A405处用酶标仪测定其吸光度(OD值)，绘制标准曲线。

蛋白含量测定

参照Bradford(1976)的考马斯亮蓝G-250的方法，用牛血清白蛋白(BSA)制作蛋白质标准曲线。将试管分成7组，每组设3个重复，建立3ml的反应体系(如表3-1)。

表3-1.蛋白质标准曲线测定

Table 3-1.The method of protein standard curve

2.5ml G-250+0.5ml测定液液混匀，室温放置5min，用紫外-可见分光光度仪测定595nm处吸光值。以OD值为横坐标，BSA浓度为纵坐标做出蛋白质标准曲线。测定酶液蛋白含量时，将原酶液稀释30-50倍，同样采用3ml的反应体系，其中酶液0.5ml，G-250 2.5ml，室温反应5min后测定595nm处吸光值，根据蛋白质标准曲线计算出酶液中的蛋白含量。

数据统计分析

根据比活力公式计算红火蚁对硝基苯甲醚(p-nitroanisole)在细胞色素P450的O-脱甲基作用的活性：

比活力(μmol/min/mgPro.)＝(OD×V总/(T×Pro.×V酶)

其中，OD为反应产物对硝基苯酚(p-nitrophenol)(μmol/ml)在405nm处的吸光值；V总为反应总体积(ml)；T为反应时间(min)；Pro.为原酶液蛋白含量(mg/ml)；V为反应酶液体积(ml)。

结果与分析

蛋白质含量标准曲线

测定结果如图1所示。牛血清蛋白含量(μg/ml)为自变量(X)，以OD₅₉₅值为因变量(Y)，拟合蛋白质含量标准曲线方程为：Y＝0.0067x+0.1154，R2＝0.9948，对标准曲线方程的回归关系进行t检验,表现为差异显著。

对硝基苯酚的标准曲线

测定结果如图2所示。以对硝基苯酚的浓度值(nmol/L)作自变量(X)，OD₄₀₀值作因变量(Y)，拟合对硝基苯酚的标准曲线方程为：Y＝3.18×10^-2+1.41×10^-2X，R²＝0.9996，对标准曲线方程的回归关系进行t检验，表现为差异显著。

不同等级红火蚁(蚁后和工蚁)细胞色素P450O-脱甲基酶活性

红火蚁不同等级(蚁后和工蚁)细胞色素P450O-脱甲基酶测定结果见表3-2.，红火蚁蚁后细胞色素P450O-脱甲基酶活性低于工蚁且差异显著，其比活力分别为3.23和5.35μmol/mg/pro/30min，相差1.66倍。

表3-2.不同等级红火蚁(蚁后和工蚁)细胞色素P450O-脱甲基酶活性测定

Table 3-2.The specific activities of cytochrome P450of different castes of S.invicta

注：表中数值为平均值±标准误(μmol/mg/30min protein)，同列中不同小写字母表示不同处理差异显著(ANOVA,P＜0.05)，括号内数值为工蚁与蚁后组的比值.

Note:The results are shown as mean±S.E(μmol/mg/30min protein)；different lowercase letters in the same column mean significant difference(ANOVA,P＜0.05),data in bracket denote fold between workers/queens.

氟虫腈和毒死蜱对红火蚁P450活性诱导作用

采用药膜法用氟虫腈LC₅₀和毒死蜱LC₅₀分别处理红火蚁工蚁，测定的细胞色素P450活性结果见表3-3.。红火蚁工蚁P450活性结果显示，24h时，氟虫腈处理组和毒死蜱处理组P450活性显著高于对照组，分别为对照组的1.97倍和1.71倍；48h时，两处理组P450活性明显达到最高值，分别为对照组的3.00倍和1.96倍；72h时，两处理组P450活性均降低，毒死蜱处理组降低更为明显，分别为对照组的2.43倍和1.27倍。96h时，两处理组P450活性仍然高于对照组，分别为对照组的2.26倍和1.12倍，毒死蜱处理组P450活性基本与对照组相平。

表3-3.氟虫腈LC₅₀(0.05μg/ml)和毒死蜱LC₅₀(0.15μg/ml)理后的红火蚁(1.25mg/头)P450活性

注：表中数值为平均值±标准误(μmol/mg/30min protein)，同一时间点不同小写字母表示不同处理差异显著(ANOVA,P＜0.05)，括号内数值为同一时间点处理组与对照组的比值.

小结

红火蚁不同等级(蚁后和工蚁)细胞色素P450O-脱甲基酶测定结果显示，红火蚁蚁后细胞色素P450O-脱甲基酶活性低于工蚁且差异显著，其比活力分别为3.23μmol/mg/pro/30min和5.35μmol/mg/pro/30min，相差1.66倍。可能因为红火蚁蚁后与工蚁功能的不同，蚁后是整个蚁巢的中心，负责调控蚁群种群数量，性别比例等，很少出去蚁巢外活动，而工蚁经常出去从事觅食等活动，很容易接触到外源化合物而使解毒代谢酶含量升高。显示了细胞色素P450在工蚁对药物解毒代谢功能的重要性。

采用药膜法用氟虫腈LC₅₀和毒死蜱LC₅₀分别处理红火蚁工蚁，测定的细胞色素P450活性显示，24h时，氟虫腈处理组和毒死蜱处理组P450活性显著高于对照组，分别为对照组的1.97倍和1.71倍；48h时，两处理组P450活性明显达到最高值，分别为对照组的3.00倍和1.96倍；72h时，两处理组P450活性均降低特别毒死蜱处理组明显下降，分别为对照组的2.43倍和1.27倍。96h时，两处理组P450活性仍然高于对照组，分别为对照组的2.26倍和1.12倍，毒死蜱处理组P450活性基本与对照组相平。从整体看，相对于毒死蜱，氟虫腈对红火蚁有较好的触杀和诱导作用，且具有持久性。氟虫腈是一种含氟吡唑类杀虫剂，活性高、杀虫谱广，美国环境保护组织将氟虫腈定为可代替有机磷类防治蚂蚁的一种药剂(U.S.EPA,2000)。同时本实验室研究表明，氟虫腈杀蚁饵剂对红火蚁具有优良的胃毒作用，红火蚁工蚁取食，当饵剂被红火蚁带进巢内后，通过工蚁在巢内的频繁活动和交哺喂食行为，将药剂传递到巢内的工蚁、幼蚁和蚁后，引起全巢红火蚁中毒死亡，达到灭杀红火蚁蚁巢的目的。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。