一种农药对蜜蜂幼虫的毒性评价方法与流程

本发明涉及农药风险评价方法，具体涉及一种农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法。

背景技术：

蜜蜂是农业生产中主要的授粉物种。蜜蜂授粉可减少农药化肥的施用，适宜生态农业和绿色农业的发展；对维护农业生物多样性、稳定性具有重要生态功能。有研究显示：全球约87.5％的开花植物依靠昆虫授粉，其中87种为主要粮食作物，占世界粮食总产量的35％，而蜜蜂约占授粉昆虫总数的80％，无论是人工饲养还是野生存在，都在作物授粉方面发挥着巨大作用。同时蜜蜂授粉所产生的经济效益也相当可观，每年仅我国由蜜蜂传花授粉带来的经济效益就高达150亿元。因此，蜜蜂具有重大的生态和经济价值。但蜜蜂对农药敏感程度极高，滥用或误用农药都将破坏蜜蜂栖息地及其食物来源，从而对蜜蜂产生严重威胁。1990年至今，因农药中毒导致蜜蜂死亡、蜂群数量骤减的现象遍及北美、欧洲、亚洲等许多国家，已成为全球普遍关注的环境污染与生物安全问题。

为保护生态系统健康，从源头控制高风险性农药对环境生物产生的潜在不良影响，我国环保部、农业部也逐渐将农药对蜜蜂生物毒性与安全性评价列为农药登记管理、农药使用环境安全管理的重要内容之一，并制定了农药对蜜蜂急性毒性试验准则。但迄今为止，我国作为农药生产和使用第一大国，并未建立完整的农药对蜜蜂安全性风险评价体系。总体来看：我国农药对蜜蜂生物安全性风险评价工作比较落后，表现在实验方法上缺乏亚慢性、慢性试验方法，评价体系缺乏立体多层次实验。

技术实现要素：

本发明公开了一种农药对蜜蜂幼虫毒性试验的方法和药剂对蜜蜂幼虫NOEC/NOED值的毒性测定方法，完善了农药对蜜蜂慢性毒性试验评价体系。

本发明的实验方案为：

一种农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法，步骤为：

(1)试验生物为1日龄的蜜蜂幼虫，3～6日龄开始暴露染毒；以系列浓度组进行预备试验；根据预备试验确定的浓度范围，正试验设置不少于5个覆盖EC₅₀/ED₅₀和/或NOEC/NOED的浓度组，同时设空白对照组，当使用溶剂时，增加设置溶剂对照组；

(2)正试验结果观察；于第4d～8d及第15d观察并记录幼虫死亡数、其它异常情况，身体僵硬不动或轻微触碰无反应或第15d未化蛹的幼虫则判定为死亡，同时将死亡的幼虫去除，第22d观察并记录蛹死亡数、羽化数及观察到的异常情况；

(3)药剂对蜜蜂幼虫EC₅₀/ED₅₀或者NOEC/NOED值的测定；蜜蜂幼虫毒性试验以羽化率为主要评价指标，统计蜜蜂发育的幼虫死亡率、蛹死亡率、羽化率，进行统计学分析计算EC₅₀/ED₅₀及置信限；采用方差分析对各个浓度处理组与对照组间进行差异显著性分析，获得供试物对蜜蜂羽化影响的NOEC/NOED。

不同时间观察并记录蜜蜂不同虫态的死亡数、化蛹、羽化成蜂情况。计算幼虫死亡率、蛹死亡率、羽化率，半效应浓度/半效应剂量(EC₅₀/ED₅₀)；将供试物处理组和空白对照组的羽化率进行差异显著性分析，确定无可见效应浓度/无可见效应剂量(NOEC/NOED)。不可见效应浓度(NOEC)值用通过方差分析得出：若与空白试验组没有显著性差异的最高浓度，即为NOEC值；或通过浓度-效应关系得出：与空白实验组相比，根据实验测试所得的浓度-效应关系，其影响程度低于空白的10％的浓度，即视为NOEC值。

所述的农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法，蜜蜂幼虫获得的方法为：

(1)首先，将蜂王限制在有工蜂和空巢脾的幽王产卵器中，禁闭24h，待其产卵后释放蜂王，产卵75h后用移虫针将1日龄的幼虫随机转移至温度34℃～35℃的育王台基中，每个台基放入1只幼虫，然后将移入了幼虫的王台基置于24或48孔细胞培养板；每个培养板含有来自3个种群的幼虫；幼虫在试验条件下，用人工饲料饲养；

(2)在化蛹培养板中放入纸巾；将巾贴合孔的底部和边缘，将蛹培养板和盖子进行紫外灭菌15分钟；当D6～D8蜜蜂幼虫消耗完所有食物时，就将幼虫从培养板转移到化蛹培养板中；

(3)在幼虫或预蛹转至化蛹板之前，保持相对湿度95％±5％；预蛹转至化蛹板之后至化蛹板放入孵化盒之前，保持相对湿度80％±5％，化蛹板放入孵化盒之后至试验结束，保持相对湿度50％～80％；试验期间将干燥器放置于蜜蜂幼虫孵化器中，使干燥器温度均匀保持在34℃～35℃，黑暗的条件下进行；蜜蜂幼虫达到3日龄开始试验。

优选的，步骤(2)中的纸巾为：1m×2cm的纸巾，可以使用Kimwipe纸巾。

优选的，步骤(1)移虫前将培养板、移虫针、人工育王台基浸没在70％酒精(V/V)至少30min进行杀菌后，晾干待用；移虫时每个培养板≤20分钟；每移8只幼虫后使用酒精和水给移虫工具灭菌；使用移液器向每个王台基内供应食物，饲喂时避免接触或浸没幼虫。

优选的，所述的幼虫人工饲料的成分包括但不限于蜂皇浆、酵母提取物、果糖、葡萄糖；蜜蜂幼虫使用的三种饲料的成分及重量份为：

饲料A为：酵母提取物:葡萄糖:果糖:无菌水:鲜蜂王浆＝0.9:5.3:5.3:44.25:44.25；

饲料B为：酵母提取物:葡萄糖:果糖:无菌水:鲜蜂王浆＝1.3:6.4:6.4:42.95:42.95；

饲料C：酵母提取物:葡萄糖:果糖:无菌水:鲜蜂王浆＝2:9:9:30:50；

1日龄饲喂20μL饲料A，2日龄不进行饲喂，3日龄饲喂20μL饲料B、4日龄饲喂30μL饲料C、5日龄饲喂40μL饲料C、6日龄饲喂50μL饲料C。

优选的，饲料配置时需先将果糖、葡萄糖和酵母提取物完全溶解于无菌水后再与新鲜王浆混匀；混匀食物采用采用手动搅拌和涡旋振荡的方法；饲料新鲜配制并保存在0～5℃的冰箱里；或提前制备，冷冻保存直至使用。

优选的，所述的暴露染毒的步骤为：每天用混有供试物的饲料饲喂蜜蜂幼虫，3日龄饲喂20μL饲料B、4日龄饲喂30μL饲料C、5日龄饲喂40μL饲料C、6日龄饲喂50μL饲料C；使用水溶解的供试物，投喂的含毒饲料中受试溶液的量为≤10％；或使用有机溶剂溶解，投喂的含毒饲料中受试溶液的量≤2％。

优选的，暴露染毒过程中温度为23-40℃，每24h内出现偏差次数≤1次。

优选的，预备试验使用24孔细胞培养板，设置空白与溶剂对照组：每个浓度3个重复，每个重复12头幼虫。

优选的，正试验为：根据预备试验确定的浓度范围，按几何级差应≤3倍设置不少于5个覆盖EC₅₀/ED₅₀和/或NOEC/NOED的浓度组；设空白对照组，当使用溶剂时，增加设置溶剂对照组，对照组及每一剂量组均设3个重复，每个重复16只幼虫。

优选的，幼虫的培养条件：试验至少需准备两个密闭干燥器和一个孵化器，一个干燥器用于幼虫培养阶段，另外一个干燥器用于预蛹和化蛹阶段，使用时表面用10％漂白剂溶液进行清洁，待其表面完全干燥后方可进行试验；饱和硫酸钾溶液(160克的硫酸钾溶解到1升水中)和饱和氯化钠溶液(400克氯化钠溶解到1升水中)溶液制备时，水温需控制在45℃。将孵化箱设置到35℃，变化不超过0.5℃，将带有温湿度记录仪的干燥皿放入孵化箱中，记录试验期间的温湿度。

本发明的有益效果：

1、本发明建立了农药对蜜蜂幼虫毒性试验方法为该领域的创新。试验方法科学可行。

2、国内外研究尚少，且无具体指导准则，本发明属于创新型评价方法。

3、探索农药对蜜蜂幼虫发育、化蛹以及羽化状况产生的效应影响，为农药对蜜蜂提供高阶段的风险评估方法，同时完善农药对蜜蜂整个世代影响的评估手段。

4、保护有益生物蜜蜂种群、保护生态环境。

5、试验通过探索农药对蜜蜂幼虫发育、化蛹以及羽化产生的毒性影响，为农药对蜜蜂提供高阶段的风险评估方法，同时完善农药对蜜蜂整个世代影响的评估手段，从而保护有益生物蜜蜂总群，保护生态环境。

附图说明：

图1：幼虫D4-D8累积死亡率曲线；

图2：幼虫成蛹率；

图3：羽化率。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的发明范围。该技术领域的技术工程师可根据上述发明的内容作出一些非本质性的改进和调整。

试验材料与方法

1.1供试农药

98％氟铃脲原药

1.2供试生物

本试验使用的供试生物为意大利蜜蜂(Apis mellifera L)幼虫，由北京依科世福科技有限公司室外人工驯养。

1.3幼虫来源

试验在蜂王产卵的时候进行，幼虫来源于同一种群的意大利蜜蜂，蜂群应该饲喂充足、健康，无病无螨害。首先，蜂王被限制在有工蜂和空巢脾的幽王产卵器中，禁闭24h左右，检查产卵量后释放蜂王。

1.4幼虫采集

在第一天(D1)，将一龄幼虫从蜂脾转移到实验室的培养箱中(维持外界环境温度不低于20℃)，随后放置于干净条件用于嫁接。由于幼虫的不均一性，为了避免偏差，应选择新孵化的还未形成“C”形的幼虫。为了评估充足的LD₅₀范围，根据蜜蜂急性毒性试验结果，预实验设置6个处理组，使用24孔培养板，每个处理组3个重复，每个重复取12只幼虫；正式试验设置8个处理组，使用48孔培养板，每个处理3个重复，每个重复取16只幼虫。设置空白对照和溶剂对照。

1.4试剂

氯化钠、硫酸钾、浓硫酸、乙醇、丙酮、吐温80、无菌水、二甲基甲酰胺

1.5试验设备及器材

高压灭菌锅、24孔培养板、48孔培养板、干燥器、人工气候箱、移虫针、真空泵、幽王产卵器、移液器、天平、USB数码电子显微镜。

1.6幼虫食物

幼虫食物所需的主要成分有四种：皇浆、酵母提取物、果糖、葡萄糖。幼虫不同生长阶段所需营养成分配比稍有不同，按幼虫发育天数将其分为食物A、食物B和食物C(见表1)。食物需新鲜配制并保存在0-5℃的冰箱里(但不冷冻)。也可以提前制备，冷冻保存直至使用。

表1 不同年龄段幼虫食物量和食物成分变化

注：D＝day天数

1.7培养条件

幼虫培养在透明24/48孔聚苯乙烯培养板中，培养板事先进行紫外灭菌。这些培养板D1到D8期间置于含硫酸钾饱和液或10％浓硫酸的干燥器中，以保证95％±5％的湿度；幼虫化蛹于D8，置于含氯化钠饱和液的干燥器中，以保证80％±5％的湿度。干燥器提前用75％的乙醇擦洗消毒。试验期间将干燥器放置于人工气候箱中，使干燥器温度均匀保持在34到35℃，并且在试验的整段时期内无较大偏差。

2试验方法

试验前3天(D-3),将蜂王限制在有工蜂和空巢脾的幽王产卵器中,禁闭24h左右，检查产卵量后在D-2释放蜂王，并在蜂箱里培养幼虫直至D-1。预试验使用24孔培养板，设置空白与溶剂对照组：幼虫12×3重复＝36幼虫；6个浓度处理组(通过试验初步设置范围浓度分别为0.0001μg/幼虫，0.0005μg/幼虫，0.005μg/幼虫，0.05μg/幼虫，0.5μg/幼虫，1.0μg/幼虫)；正式试验使用48孔培养板，设置空白与溶剂对照组：幼虫16×3重复＝48幼虫；8个浓度处理组(通过预实验所得结果设置浓度分别为0.0005μg/幼虫，0.001μg/幼虫，0.002μg/幼虫，0.004μg/幼虫，0.008μg/幼虫，0.016μg/幼虫，0.032μg/幼虫，0.064μg/幼虫)：幼虫16×3重复＝48幼虫。测试环境为全黑暗，温度控制在34℃～35℃。

试验第一天(D1)，将新孵化的还未形成“C”形的一龄幼虫从蜂脾转移到实验室的培养箱中(维持外界环境温度不低于30℃)。移虫在34到35℃的24/48孔培养板上进行，使用移液器向每个王台基内供应食物。饲喂幼虫时应避免接触或浸没其身体，食物顺着王台基壁放置在幼虫的旁边。试验第2d(D2)只观察不喂食。根据时间表，试验第3d(D3)到第6d(D6)，分别饲喂含有不同浓度测试溶液的食物(D3为食物B，D4到D6为食物C)，根据食物C的配制比例，将不同浓度测试溶液溶入无菌水中，并在染毒前配制好食物C。根据幼虫不同年龄段分施用不同食物量进行饲喂。每个处理组包括食物都需使用不同枪头，避免污染，并记录第2d(D2)施药前食物剩余量。食物使用前应进行加热。试验第8d(D8)对幼虫进行化蛹，将幼虫转移至带有滤纸的培养板里并将培养板放置于适合蛹生长的干燥器中。试验第15d(D15)观察幼虫成蛹情况并记录。试验第22d(D22)观察并记录羽化和未羽化的成蜂，D3第一次染毒开始后，在饲喂阶段观察记录D3～D7,D8和D15的死亡率。对于不动的幼虫或用嫁接工具接触无反应的幼虫被记录为死亡，对于D15未转化为蛹的幼虫被记录为死亡。D22观察记录羽化的成蜂、未羽化的蜂以及行为表现异常的蜂。最终计算成年蜂的羽化率(成年蜂的羽化率＝D22羽化的成蜂/D3开始施药时幼虫的总数)、成蛹率(成蛹率＝D15成蛹幼虫数/D3开始施药时幼虫的总数)、幼虫的死亡率(幼虫的死亡率＝在D3-D8幼虫期蜜蜂死亡数/开始施药时D3幼虫的总数)

3结果与分析

根据表2可知，在试验浓度范围内分别观察D4～D7，D8，D15，D22天幼虫的死亡情况以及蛹的羽化情况。

表2 试验期间累计死亡情况

注：D＝day天数；CK₁代表空白对照；CK₂代表溶剂对照

表3 幼虫成蛹和羽化情况

注：D＝day天数；CK1代表空白对照；CK2代表溶剂对照

3.1幼虫死亡率

根据试验连续喂药4天140μL，观察D4～D8的死亡数(图1)。其D4-D7内幼虫的各浓度的累积死亡率计算得：4.17％，0，4.17％，4.17％，4.17％，6.25％，10.42％，12.50％。对于幼虫在喂食期间D8的NOEC估计值为0.004μg/幼虫(具体通过SPSS分析与溶剂对照组对比得到)。在实验所设浓度范围内，观察其浓度效应曲线(图2)。

98％氟铃脲原药对蜜蜂幼虫慢性毒性试验每个浓度剂量处理组的累积死亡率曲线图与两组空白对照比较，可以看出0.0005μg/幼虫，0.002μg/幼虫，0.004μg/幼虫，0.008μg/幼虫剂量处理组与空白与溶剂对照试验组的累计死亡率曲线图相似，但是是否在统计学上具有显著相关性需进一步由SPSS进行验证。根据SPSS软件处理可知，空白对照和溶剂对照的无显著性差异(P>0.05)，故各浓度处理组与溶剂对照比较。用不同剂量处理组与溶剂试验组做SPSS分析数据发现，根据结果可知，P在剂量为0.008μg/幼虫处理浓度下为小于0.05(P＝0.016<0.05)，且浓度为0.004μg/幼虫P值大于0.05与溶剂对照试验组没有显著性差异且为最高浓度的一组，因此LOEC为0.008μg/幼虫，NOEC估计值为0.004μg/幼虫。

3.2成蛹率

D15观察并记录幼虫的成蛹情况，并最终计算成蛹率。成蛹率＝D15成蛹数/D3开始染毒时幼虫的总数。空白对照、溶剂对照以及各浓度梯度的蛹的羽化率分别为：75.00％，60.42％，60.42％，58.33％，60.42％，52.08％，47.92％，22.92％，12.50％，10.42％。溶剂与空白对照组的成蛹率超过60％且死亡数大致相同，空白对照组与溶剂对照组间经证明无显著差异(P>0.05)，故各浓度组可与溶剂对照组比较差异是否显著。在0.0005μg/幼虫，0.001μg/幼虫，0.002μg/幼虫，0.004μg/幼虫，0.008μg/幼虫处理组与空白与溶剂对照试验组的成蛹率相似，并且经过SPSS软件计算可知其浓度P>0.05，证明其与溶剂对照组无显著相关性，在浓度为0.016μg/幼虫对幼虫成蛹的过程产生影响效应，其结果可知P＝0.001<0.05证明其与溶剂对照显著不相关，且浓度为0.008μg/幼虫P值大于0.05与溶剂试验组没有显著性差异且为最高浓度的一组，故成蛹阶段的LOEC为0.016μg/幼虫，NOEC估计值为0.008μg/幼虫。

3.3羽化率

D22观察并记录蛹的羽化情况(见图3)，记录羽化的成蜂并最终计算羽化率。成年蜂的羽化率＝D22羽化的成蜂/D3开始施药时幼虫的总数。空白对照、溶剂对照以及各浓度梯度的蛹的羽化率分别为：64.58％，54.17％，56.25％，50.00％，52.08％，43.75％，37.50％，16.67％，6.25％，0。对照组的羽化率超过50％，空白对照组与溶剂对照组间经证明无显著差异(P>0.05)，故各浓度组可于溶剂对照组比较差异是否显著。在0.0005μg/幼虫，0.001μg/幼虫，0.002μg/幼虫处理组与空白与溶剂对照试验组的羽化率相似，并且经过SPSS软件计算可知其浓度P>0.05，证明其与溶剂对照组无显著相关性，在浓度为0.016μg/幼虫对幼虫成蛹的过程产生影响效应，其结果可知P＝0.001<0.05证明其与溶剂对照显著不相关，且浓度为0.008μg/幼虫P值大于0.05与溶剂试验组没有显著性差异且为最高浓度的一组，故羽化阶段的LOEC为0.016μg/幼虫，NOEC估计值为0.008μg/幼虫。